LAG3 PD1调节CD8 + T细胞弥漫型大b细胞淋巴瘤的病人

文摘

背景。弥漫型大b细胞淋巴瘤(DLBCL)是一个异构淋巴恶性肿瘤临床和基因。难治性患者不满意的结果促使对DLBCL努力探索新的治疗方法。然而,治疗与免疫相关的检查点机制仍不清楚。本研究旨在调查的潜在角色程序性细胞死亡蛋白1 (PD1)和淋巴细胞激活基因3 (LAG3) CD8 + T细胞在DLBCL治疗。方法。利用流式细胞术,我们检查的内容T细胞,细胞因子的水平,和表达PD1 LAG3 DLBCL患者和健康对照组。CD8 + T细胞的细胞因子水平DLBCL患者治疗前后比较通过阻断PD1和LAG3磁bead-sorted CD8 + T细胞。结果。我们发现的比例CD4 + T细胞和CD8 + T细胞在DLBCL患者治疗后增加。细胞因子的水平趋势朝着健康对照组在治疗。LAG3 PD1(+)(+),或PD1 (+) LAG3(+)都表示在低CD4 + T细胞和CD8 + T细胞在治疗后比治疗DLBCL患者。此外,封锁PD1和LAG3在排序的CD8 + T细胞在对治疗的反应明显抑制细胞因子的生产。结论。PD1和LAG3 CD8 + T细胞可能是重要的治疗目标和DLBCL患者中发挥治疗作用。

1。背景

弥漫型大b细胞淋巴瘤(DLBCL)约占30 - 40%非霍奇金淋巴瘤(NHL) [1]。DLBCL是一个激进的淋巴瘤临床病理和分子遗传特性有很大的异质性(2]。的许多基因突变发生在DLBCL影响染色质重塑以及其他基因表观遗传功能(3]。患者通常表现为迅速扩大淋巴结病和宪法的症状,需要立即治疗(4]。免疫组织化学(包含IHC)和荧光原位杂交(FISH)是常见的方法来诊断DLBCL [5]。

hydroxydaunorubicin使用利妥昔单抗,环磷酰胺,长春新碱和泼尼松(R-CHOP)标准疗法在DLBCL显著提高总生存期(6]。然而,DLBCL患者R-CHOP治愈约60%,其余患者对感应immunochemotherapy或复发后完全缓解(CR) [7]。R-CDOP全身化疗(利妥昔单抗、环磷酰胺、长春地辛,阿霉素脂质体,和强的松)据说可以达到完全缓解(8]。R-DA-EPOCH(利妥昔单抗、阿霉素、依托泊苷、强的松、长春新碱、环磷酰胺)是常用的复发DLBCL患者(2]。然而,现有的方法仍然没有准确或有效地预测治疗效果DLBCL治疗前(9]。因此,了解化学治疗剂的潜在影响机制作用于DLBCL改进协议改善病人预后至关重要。

改善DLBCL患者的预后,各种方法都试过了,但是到目前为止,没有有效的方法来改善患者的总生存期(10]。众所周知,肿瘤微环境分析是评估DLBCL发展一个重要方面。免疫细胞和炎症细胞的存在有助于调节肿瘤细胞的生长和入侵DLBCL [11]。癌症慢性炎症可能影响肿瘤浸润T细胞诱导他们疲惫,从而抑制T细胞的分化、增殖,和效应功能12]。这是由于持续的表达抑制性受体等程序性细胞死亡蛋白1 (PD1)和淋巴细胞激活基因3 (LAG3) T细胞表面的13]。

PD1表达CD4 +和CD8 + T细胞在免疫激活和炎症;这对DLBCL(被认为是一个潜在的治疗目标14,15]。PD1抑制是一个关键的目标CD8 + T细胞诱导提高预防和治疗性疫苗16]。同时,PD1-positive肿瘤浸润淋巴细胞(尖)的存在与贫穷有关DLBCL患者总生存期(17]。LAG3高度表达的CD8 + T细胞和CD4 + treg DLBCL患者与不良预后相关(18]。广泛的临床前数据和机械的分析建立了LAG3第三免疫检查点在诊所,LAG3表达增加的情况导致T细胞功能受损(19]。

在immunochemotherapy的时代,迫切需要找到更多有效的药物或高危患者的治疗方案。国际预后指数(IPI)是主要的预后风险评估方法对DLBCL和用于化疗(20.]。我们对DLBCL治疗的疗效评估使用IPI或年龄调整IPI (aaIPI)作为一个索引。利用流式细胞仪和体外实验探讨被T细胞亚型的比例的变化引起DLBCL治疗后,和目标的角色PD1和LAG3治疗。

2。材料和方法

2.1。样品收集

所有DLBCL患者资格进入研究根据专家的诊断标准确认haematopathologist (CB)。病人需要全方位化疗。此外,10个健康对照组被选为控制。的全血17 DLBCL, 9 DLBCL患者三个疗程的化疗药物,7 DLBCL患者六个疗程的化疗药物,和10个健康对照组进行流式细胞术。所有患者接受,并签署了知情同意。这项研究是根据赫尔辛基宣言的原则。本研究经伦理委员会批准新疆医科大学第一附属医院。

2.2。流式细胞术

Anti-CD3、anti-CD4 anti-CD8, anti-CD183、anti-CD196 anti-CD25, anti-CD127, anti-PD1, anti-LAG3 BD生物科学(美国加州)。外周血样本surface-labeled与抗体在室温下10分钟。然后,血液中的红细胞与血红细胞溶解细胞溶解产物(美国加州BD生物科学)。PBS的细胞被洗两次。CBA(仪珠阵列)检测组件从BD购买生物科学。的LSR-II流式细胞分析仪(美国加州BD生物科学)是用于流式细胞仪实验。Kaluza软件(贝克曼)是用于数据分析。

2.3。CD8 + T细胞反应排序和封锁

我们收集5毫升新鲜全血DLBCL患者有或没有治疗,和5毫升的PBS是添加到全血。提取外周血单核细胞(PBMCs)和离心机,颗粒收集和清洗。我们增加了150μl的CD8 + T细胞磁珠(BD生物科学)离心沉淀,它在黑暗中30分钟。我们添加了2毫升PBS和呆板乏味的上层清液管。暂停PBS的磁珠,我们把他们放在一个磁框架。我们让他们在黑暗的10分钟和丢弃的上层清液。我们添加了培养基,放进一夜之间文化的细胞培养瓶。

阻断实验,CD8 + T细胞被培养,然后一夜之间有或没有孵化anti-PD1 (pembrolizumab [21])或/和LAG3 (IMP321 [22])抑制性抗体。文化是继续进行后续测试。

2.4。统计分析

SPSS为windows V19.0(美国芝加哥,伊利诺斯州)是用于所有分析。的值表示为 (SD)。学生的 - - - - - -测试是用来比较组之间的差异比较。对所有实验,是一个重大的区别值小于0.05 ( )。

3所示。结果

3.1。弥漫型大b细胞淋巴瘤的临床特征

本研究进行标本39 DLBCL患者和他们的特点如表所示1。39 DLBCL患者包括21个男性和18个女性。所有病人的平均年龄是59.9岁,69.2%的病人患有晚期疾病(四期)。所有患者被诊断出患有DLBCL和切接受化疗,R-CHOP / CDOP或R-DA-EPOCH。两名患者被诊断为根据鱼的双重打击的结果,和治疗R-DA-EPOCH被选中。重要的是,我们评估的有效性3和6疗程的治疗后所有患者,分别。根据响应标准的卢加诺2014年,患者的治疗反应率3课程后的治疗如下:20名患者(51.3%)与CR, 2例(5.1%)与PD与公关12例(30.8%),2例(5.1%)和SD。后患者的治疗反应率六课程如下:25例(64.1%)与CR与PD 4例(10.3%),2例(5.1%)与公关,和1个病人(2.6%)和SD。IPI评分的结果被用来评估预后风险。患者年龄小于60岁使用aaIPI进行评估。此外,LDH水平上升、ESR、CRP,β2 mg在DLBCL患者很常见。

3.2。描述的T细胞反应治疗

T细胞识别变化内容DLBCL治疗期间,我们对外周血淋巴细胞进行流式细胞术。发现DLBCL患者相比,CD4 + T细胞的比例逐渐增加治疗后直到重大变化发生在六个疗程的治疗(图1(一))。同样的现象被认为改变CD8 + T细胞,增加在DLBCL患者治疗后。此外,我们决定改变Th1、Th2, Th17细胞,以及治疗前后(图Treg细胞变化1 (b))。Th2和Th17以及Treg细胞逐渐增加在DLBCL患者治疗后,外周血Th1细胞的比例逐渐下降。然而,Th2细胞的比例没有显著变化( )。在细胞因子分析的结果,水平的il - 4、il - 10,和IL-17高架在DLBCL患者化疗药物,和干扰素-γ,TNF、il - 6和- 2减少(图2)。

3.3。PD1和LAG3 T细胞的表达

确定免疫检查站T细胞的表达,我们检查了PD1的表达和LAG3 CD4 +和CD8 + T细胞,分别。中CD4 +细胞,PD1 (+), LAG3(+),或PD1 (+) LAG3(+)在治疗后都表示下级比未经处理的DLBCL患者(图3(一个))。CD8 +细胞表达水平的PD1 (+), LAG3(+),或PD1 (+) LAG3(+)所有治疗后呈下降趋势与未经处理的DLBCL患者相比(图3 (b))。这些结果表明,治疗DLBCL患者可能涉及PD1和LAG3免疫细胞免疫的检查点。

3.4。细胞因子表达PD1的封锁和LAG3之后

我们专注于PD1和LAG3表达的细胞因子影响的CD8 + T细胞。CD8 + T细胞的纯度排序从外周血PBMCs DLBCL患者为98%(图4(一))。细胞因子的分泌是检查添加PD1的封锁之后,LAG3, PD1 LAG3,分别在体外培养(图4 (b))。细胞因子的水平生产的CD8 + T细胞治疗组的封锁是类似疾病的群体。和生产的细胞因子治疗组的封锁的价格相比有一个显著的变化没有的封锁。

4所示。讨论

随着我们对疾病的理解机制的进步,我们能够更好地DLBCL治疗。毫无疑问,化疗药物正在前方有许多承诺,但仍有许多患者不良的结果。在这里,我们描述CD4 + t细胞和CD8 + t细胞的变化内容DLBCL治疗而造成的。化学治疗剂治疗减少PD1和LAG3表达CD4 + T细胞和CD8 + T细胞在DLBCL患者。改变的CD8 + T细胞在细胞因子生产后对治疗的反应被减毒PD1和LAG3封锁。

DLBCL患者都接受治疗之前,被纳入本研究。T细胞衰竭在DLBCL患者治疗后的改善。T细胞衰竭流行在肿瘤免疫微环境23]。淋巴细胞在肿瘤的存在与改善预后密切相关,和淋巴细胞的数量的时候肿瘤活检是积极与疾病控制24]。辅助T 2 (Th2)和管理(Treg) T细胞内容增加在DLBCL患者治疗后。过渡到一个Th2和Treg免疫抑制表型与肿瘤转移和侵袭性和赋予相关免疫反应闪避属性(25]。与我们的检测结果,方差的比例Th17细胞在外周血DLBCL患者明显减少和化疗后的恢复26]。和在DLBCL IL-17A水平升高与不良预后相关(27]。此外,在这项研究中,我们发现,Th1 / Th2细胞分布的改变在DLBCL患者治疗后,这些变化可能与患者对治疗的反应。最近,这是表明LAG3和PD1表情CD8 + T细胞可能代表疲惫的T细胞(28]。

Xu-Monette等人发现,高比例的PD1 + CD8 + T细胞和PD-L1 + T细胞在肿瘤微环境(时间)预测穷人生存在DLBCL [29日]。检查点抑制剂针对PD1已经进行第一阶段试验在复发/难治性DLBCL患者有前景的结果(30.]。LAG3是一种很有前途的免疫检查点负调节T细胞的活化作用和肿瘤的预后很差,当高度表达(31日]。有趣的是,在临床前研究中,治疗方法使用双重免疫检查点封锁已被证明改进效果比单药PD1-targeted治疗实体肿瘤(32,33]。此外,有强有力的证据表明upregulation PD1 LAG3可以调解逃避机制的疗法,和联合治疗可以克服获得抗病性PD1 (34]。我们的研究结果表明,炎性细胞因子的生产被同时封锁PD1和显著增加LAG3 CD8 + T细胞在治疗。这些结果表明,PD1和LAG3 CD8 + T细胞可以治疗DLBCL治疗的目标。

异常的细胞表面分子的表达对DLBCL CD8 + T细胞可能提供有用的信息预测肿瘤复发和生存35]。我们集中我们的注意力在CD8 + T细胞作为免疫细胞反应的机制在DLBCL治疗。PD1和LAG3检查站的关键角色的CD8 + T细胞反应进行了探讨CD8 + T细胞的功能评价。CD8 + T淋巴细胞特定的肿瘤抗原,免疫激活及其驱动的前景对疲惫的淋巴细胞显著疗效子集在癌症患者36]。

本研究也有一定的局限性。临床样品尺寸小造成的解释结果受到一定的限制。此外,实验检测手段相对单一,以及将使用更多的实验进行多方面的研究在随后的年。最后,因为下游的有限理解机制,以及与其他细胞内的交互途径,进一步对免疫调节的研究是迫切需要的。

5。结论

综上所述,T细胞衰竭的现象在DLBCL患者治疗后缓解。PD1和LAG3表达在CD8 + T细胞可能是治疗的一个重要目标。因此,本研究的数据表明,免疫调制治疗针对PD1检查站和LAG3有价值的辅助设置DLBCL患者。

数据可用性

在这项研究的所有数据都包含在这篇文章。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

确认

作者要感谢所有那些导致了这项研究。这项工作是支持由新疆维吾尔自治区自然科学基金(2019号d01c284)。

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