转录因子的识别签名可以预测乳腺癌的生存

文摘

背景。转录因子的表达模式(TFs)可以用来开发潜在的癌症预后的生物标志物。在这项研究中,我们旨在识别和验证TF签名预测乳腺癌的无病生存期(DFS) (BRCA)患者。方法。套索和Cox回归分析应用于构建一个基于TF签名,TCGA的基因表达数据集。的预后价值TF签名TCGA调查数据库,进一步验证模型的可靠性3独立从基因表达数据集综合(GEO)。TF签名的预测性能比较与先前发表4基因签名。研究癌症的TF签名和特征之间的关系,基因集富集(GSEA)进行了分析。TF的相关性签名和免疫渗透的水平也被调查。结果。11-TF预后签名是由对BRCA病人生存预测性能好。通过使用风险评分模型基于11-TF签名,BRCA患者分层为低收入和高危人群和显示好,可怜的无病生存期(DFS),分别。分数是一个独立的风险预测指标调整其他临床病理的因素。此外,11-TF签名有一个更好的生存预测性能相比4以前公布的基因签名。此外,风险评分是一个癌症的标志。最后,一个高风险得分更高的渗透M0和M2巨噬细胞,降低渗透休息CD4记忆⁺T细胞、CD8⁺T细胞。结论。在这个研究结果确认和验证小说预后TF签名,这是一个独立的预测生物标志物DFS BRCA病人。

1。介绍

乳腺癌(BRCA)是死于癌症的主要原因之一,妇女和代表一个异构组肿瘤起源于上皮细胞衬乳导管(1,2]。传统上,肿瘤大小;淋巴结的转移状况;和地位的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR),和HER2作为有用的预后标志物的BRCA诊所(3- - - - - -5]。然而,这些预后生物标志物仍局限在准确预测生存由于BRCA患者的遗传异质性6]。因此,建立一个精确的和健壮的签名来指导预后分层BRCA是相当重要的。

转录因子(TFs) dna结合蛋白质与基因的启动子序列和随后调节基因的表达7]。先前的研究已经表明,TFs参与了几个关键的细胞过程,如细胞生长、分化、增殖和细胞死亡8- - - - - -10]。TFs BRCA患者往往异常表达,TFs的表达之间的关系,已经证明了病人生存BRCA [11]。然而,TFs的表达模式和预后能力BRCA只在一些研究调查。

在目前的研究中,我们确定了几个survival-related TFs的预测和开发了一个11-TF签名BRCA患者的无病生存期(DFS)通过分析基因表达和相应的临床数据的BRCA患者癌症基因组图谱(TCGA)。TF签名验证的预测性能3独立从基因表达数据集综合(GEO)并与4以前公布的基因签名。此外,协会之间的风险评分基于11-TF签名和癌症的标志,和免疫细胞渗透了。

2。材料和方法

所有数据分析使用R软件(http://www.r-project.org/version3.5.1)。研究过程的流程图如图1。

2.1。数据收集

2018年,兰伯特等人发表了一篇引人注目的评论覆盖≥1600可能人类TFs潜在的人类生理学和疾病(7]。在这项研究中,我们收集了1639 TFs文学的进一步探索。从BRCA基因表达数据患者从TCGA通过下载加州大学圣克鲁兹齐娜浏览器(UCSC齐娜,http://xena.ucsc.edu/)[12]。TCGA的重叠TFs 1639 TFs被提取,和1554年得到了TFs TCGA的微分表达式分析队列(114配对正常和肿瘤样本)。

共有950名患者相应的基因组数据(读计数)和临床信息包括DFS TCGA数据是从数据库中,作为训练集。基因表达谱和相应的临床信息的BRCA患者选择在线公共基因表达综合(地理,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库,包括三个独立数据集的数据加入GSE20685 [13],GSE21653 [14,15],GSE42568 [16]。GSE20685由327 BRCA病例,GSE21653由266 BRCA病人,GSE42568包含121个样本(104 BRCA 17患者和正常对照组,表1)。共有697个肿瘤样本生成使用相同的芯片平台(GPL570 Affymetrix人类基因组U133 + 2.0数组),和这些数据集作为验证集。

2.2。肿瘤样本

肿瘤样本和匹配相邻正常组织收集从20 BRCA病人在吉林大学第三医院(吉林、中国),2020年1月至2020年11月。口头同意了所有的病人。所有实验的伦理道德委员会批准吉林大学第三医院(吉林,中国)。所有样品都是匿名分析之前保证保护隐私。

2.3。差异表达TFs的识别

Limma包是用来识别差异表达TFs 114双的BRCA和正常控制样品(17]。发现了差异表达TFs的截止条件 和调整值≤0.05。所有值调整业务使用Benjamini和方法来控制错误发现率(罗斯福)18]。火山地块创建基于R包中的ggplot2(3.2.0版本,https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html)[19]。层次聚类分析对微分TFs的表达进行了使用pheatmap包(1.0.12版本,https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html)[20.]。

2.4。预后特遣部队建设的签名

确定候选人预后TF,单变量回归分析进行评估的相关性差异表达TFs和DFS BRCA队列。只有TFs考克斯 和log-rank 被视为关联的生存。至少绝对收缩和选择操作符(套索)回归模型的敏感性和特异性,其具有相当大的优势及其系数可用于确定真正的药效监管组织(21]。在这项研究中,套索回归分析来确定候选人是否有效的变量DFS,和那些 被消除。基于签名的预后模型被用来计算每个病人使用的风险评分 在哪里是选择基因的数量,代表每个基因的表达,和代表基因的系数 。值得注意的是,平均风险评分被定义为截止标准分类样本到高风险( )和低风险( )组。

为进一步验证的预测性能TF签名,时间的AUC接受者操作特征(ROC)曲线评估(22]。定义点设置为1 - 2 -,3 -,4 - 5 -,10年时间,ROC曲线用来评估时间的风险评分结果的预测价值(22]。更高的AUC表示更高的灵敏度。

2.5。基因集富集分析(GSEA) TF的签名和癌症的标志

癌症特征总结数据集的相关信息,从而减少变异和冗余。这提供了更精确和简洁投入GSEA分析(23]。总共50标志基因集是从分子签名数据库(MSigDB,招募http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb),导入到GSEA (http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)。

2.6。实时定量PCR(存在)

验证mRNA表达水平之间的TFs TCGA肿瘤和正常乳腺组织样本数据集,这些TFs mRNA表达水平是衡量在收集新鲜冷冻肿瘤组织样本中存在。随后,存在实施从癌症和收集的RNA正常溶解产物。总之,总RNA分离通过FastPure细胞/组织总RNA隔离设备V2 (Vazyme生物技术有限公司,南京,中国)根据制造商的指导方针。接下来,RNA转录到cDNA使用HiScript II第一链cDNA合成装备。所有反应都是使用一个实现AceQ普遍SYBR qPCR大师混合(Vazyme生物技术有限公司,南京,中国)在QuantStudio™5实时PCR系统(ABI,生活技术,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。表达式计算为δ的褶皱变化阈值周期( )归一化后的内部参考。的引物对存在如表所示S1。

2.7。反褶积的渗透到肿瘤微环境中免疫细胞

细胞类型鉴定评估相对子集的RNA转录(CIBERSORT)是一种算法,用于描述复杂组织的细胞成分基于基因表达谱(24]。在目前的研究中,CIBERSORT方法应用于研究免疫细胞浸润程度TCGA的肿瘤样本数据库。

2.8。统计分析

生存使用kaplan meier方法进行估计(25]。DFS之间的时间被定义为诊断和疾病复发。统计生存时间差异评估使用log-rank测试(26]。单变量和多变量回归分析进行使用Cox比例风险模型(27]。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。预后TF签名的识别

在这项研究中,共有287个差异表达TFs被确定阈值以下的BRCA与正常对照组之间 和 。287年TFs 85是调节和202是表达下调。分布的差异表达TFs描述使用火山的情节横坐标和吗是纵坐标(图2(一个))。这些差异表达TFs的热图的可视化呈现在图2 (b)和显示,BRCA(肿瘤)和正常对照组(正常)可能会被这些TFs(图2 (b))。

单变量回归分析的DFS导致提取12 survival-associated TFs候选人预后签名,包括E2F2 EGR3, EMX1, FOXD1, FOXJ1, NKX6-1, NR3C2, PAX7, STAT4, MYBL2 ZNF552, MSX1。如图2 (c)、高表达E2F2 FOXD1 MSX1, MYBL2, NKX6-1, PAX7与贫穷DFS,虽然EGR3表达升高,EMX1, FOXJ1, NR3C2, STAT4和DFS ZNF552与改善。确定一个预后TF签名,套索回归分析进行的12 prognosis-associated TFs TCGA数据集(图2 (d))。如图2 (e)11 TFs选择构建预后TF签名,而MYBL2 0的回归系数是移除。一般信息的11个TFs表所示2。斯皮尔曼的相关分析表明,表情识别TFs,组成特遣部队签名显示没有相关性,从而表明每个特遣部队(图的一个独立的预测能力2 (f))。

3.2。基于11 TF签名预测的风险评分BRCA患者的生存

我们接下来的表达模式分析11 TFs TCGA的数据库。正常样本,表达E2F2相比,FOXJ1, EMX1, PAX7, NKX6-1 FOXD1, ZNF552显著提高( )MSX1的表达,STAT4 NR3C2, EGR3显著降低肿瘤样本(所有 )(图3(一个))。与这些结果一致,存在证实这些TFs的信使rna表达水平显示类似的趋势TCGA表达式模式的数据库(图3 (b))。随后,构建了风险评分模型,并用来预测BRCA患者的预后。根据风险评分中位数,BRCA患者分为低风险和高风险组(图3 (c))。高危患者得分更容易复发患者相比,低风险的分数(图3 (c))。分层集群性能表明,11预后TFs分类之间的低风险和高风险组(图3 (d))。

接下来,我们分析了生存预测能力的风险评分,TCGA数据库,这被认为是训练集,如图4(一)低风险组中,病人已经大大延长DFS相比,病人在高危人群( , ,《考克斯 ,和log-rank )。接下来,预测风险评分的性能验证3地理数据和显示类似的预测价值(GSE20685: , ,《考克斯 ,和log-rank ;GSE21653: , ,《考克斯 ,和log-rank ;和GSE42568: , ,《考克斯 ,和log-rank )。

评估的敏感性和特异性11-TF签名,时间对DFS ROC曲线预测构造(图4(一))。不包括1年期AUC值GSE20685 GSE21653,所有其他AUC值≥0.6。11-TF签名实现5年生存的AUC值为0.689,0.647,0.672,和0.721 TCGA GSE20685, GSE21653和GSE42568分别。这些结果表明,分数基于11-TF签名是有效的风险预测的DFS的BRCA病人和一个健壮的预测性能。

3.3。11-TF签名显示优越的预测性能相比以前公布的预后签名

在这项研究中,我们11-TF签名与4以前公布的预后签名面板:9-TF签名报道陈et al。28周],12-lncRNA签名et al。29日),13-gene后生签字保et al。30.毛],12基因预后签字et al。31日]。如图4 (b)低风险组中,所有患者有一个长DFS相比,病人在高危人群(Chen等人:log-rank ;包等。:log-rank ;毛et al。: log-rank ;和周et al。: log-rank )。4以前公布的基因签名相比,我们获得一个更小的log-rank 11-TF签名价值。此外,我们11-TF签名1-10-year AUC值最高。因此,这些发现强调了我们11-TF签名的最佳性能。

3.4。风险评分是一个独立的预后因素

在这里,我们首先进行单变量回归分析探讨临床和病理因素之间的相关性和BRCA DFS的病人。如表所示1风险评分,病理阶段,状态,和公关状态显著相关患者的DFS BRCA TCGA的数据库;风险评分,T台,N舞台,舞台,和相邻CT与GSE20685 DFS的患者;只有风险得分和T台的DFS BRCA GSE21653病人;风险评分,而N阶段,ER地位在GSE42568 DFS的病人有关。有趣的是,我们发现风险评分与整个BRCA DFS组相关。随后,多元回归分析探讨哪些因素是独立的预后因素。如表所示1,只有风险评分在所有数据集是一个独立的预后因子。

我们进一步进行分层分析患者临床病理的变量,分子亚型和风险评分。如图5(一个),BRCA病人低风险组相比更长的生存时间在所有分层的高危人群临床病理的变量组在每个数据集。具体来说,高,低风险组之间比较的曲线显示与log-rank显著差异 和考克斯 。此外,分子亚型的分层分析表明,高风险患者显示可怜的生存所有分子亚型(图的趋势5 (b))。然而,没有观察到的差异为正常,DFS和基底亚型之间的高收入和低风险组。综上所述,这些数据表明,风险评分是一个独立的预后因素的预测的DFS BRCA病人。

3.5。风险评分与免疫细胞浸润有关

使用CIBERSORT方法,我们估计22免疫细胞亚型的丰度调查之间的关系风险评分和肿瘤微环境中免疫细胞浸润。如图6的分数M0和M2巨噬细胞,自然杀伤(NK)细胞,调节性T细胞,和记忆B细胞明显高于在高危人群,而本地B细胞,肥大细胞,单核细胞,内存和本地CD4休息⁺T细胞、CD8⁺T细胞,树突状细胞和巨噬细胞M1被明显高于低风险组。此外,两个免疫细胞比例最高的高危人群是M0和M2巨噬细胞。两种类型的免疫细胞,包括休息CD4记忆⁺T细胞、CD8⁺低风险患者的T细胞比例最高。

3.6。风险评分与癌症的特点相关联

调查如果11-TF签名与肿瘤生物学过程相关,基因集富集(GSEA)进行了分析。如图7,共有6个特征基因集富集( )。四个特征(包括MYC_TARGETS_V1 MYC_TARGETS_V2、糖酵解和DNA_REPAIR)与高风险有关分数,这表明这些生物过程的激活可能参与BRCA进展。相比之下,另外两个特点(ESTROGEN_RESPONSE_EARLY和ESTROGEN_RESPONSE_LATE)与低风险相关的成绩,表明他们的激活抑制肿瘤恶化,改善BRCA患者的生存。

4所示。讨论

因为BRCA异构的特点,传统的预测因素似乎并不是足够的BRCA患者的生存。因此,survival-specific预后有价值的生物标志物的发展是至关重要的。近年来,一些研究已经确定基因可能作为预后指标BRCA面板。例如,陈等人。28]TCGA使用基因表达数据和临床数据和地理数据库识别9-TF签名,这可能发挥着重要在BRCA患者预后的作用。太阳et al。32]分析了lncRNA表达谱的BRCA患者从GEO数据库来识别nine-lncRNA签名可以是一个有价值的预后生物标志物预测BRCA患者转移风险。在另一项研究中,BRCA患者的lncRNA表达谱分析了构建12-lncRNA签名来预测recurrence-free生存(29日]。2019年,保et al。30.)建立了一个13-gene后生签名通过结合mRNA表达和DNA甲基化数据集。12基因预后签名识别的基础上,结合独立BRCA数据库通过基因coexpression网络分析(31日]。值得注意的是,所有这些研究集中在预后签名的识别;然而,他们并不认为免疫渗透分析和实施中存在的表达水平来验证这些签名使用冷冻组织样本。在我们的研究中,除了建立和验证预测模型的一个重要预测DFS 11-TF签名BRCA病人通过集成TF数据,基因表达数据集,也表现免疫渗透和临床信息,分析探讨相关的免疫细胞和TF签名。此外,我们验证了TFs使用中存在使用冷冻组织样本的表达水平。我们的研究结果显示,成功的风险评分是一个独立的预后因素分类肿瘤患者分为高风险和低风险组DFS的显著差异。因此,这些结果表明的重现性和可靠性对DFS的预测BRCA 11-TF签名。

11-TF预后模型是由E2F2 EGR3, EMX1, FOXD1, FOXJ1, NKX6-1, NR3C2, PAX7, STAT4 ZNF552, MSX1。在先前的研究中,陈等人报道,E2F家族共同或个别的TFs调节细胞增殖在癌症33]。具体来说,BRCA e2f有预后价值,独立于临床参数(34]。在先前的研究中,据报道,E2F2的激活与ER的耐抗雌激素治疗α阳性的BRCA [35]。HER2-regulated E2F2表达式进一步影响cell-matrix附着力,与潜在后果转移殖民(36]。此外,调节E2F2充当一个重要中间BRCA HER2-directed信号电路中(37]。Malorni等人签名表明基因表达可能是建立基于与E2F1基因关联的调查和E2F2表达BRCA TCGA在数据库中(38]。我们的结果是一致的结果在这些研究中,从而进一步验证在BRCA E2F2预后的关键功能。EGR3积极参与雌激素信号(39]。井上等人证明EGR3中起关键作用的生理正常和恶性乳腺细胞,通过过量的感应基因(40]。在这项研究中,GSEA表明雌激素反应的特点(ESTROGEN_RESPONSE_EARLY和ESTROGEN_RESPONSE_LATE)被浓缩在低风险病人组。我们推断,EGR3抑制TFs通过促进雌激素信号在BRCA进展的能力。狐狸家族的DNA结合蛋白质调节DNA转录和修复(41]。有趣的是,在这项研究中,两个狐狸的家人(FOXD1和FOXJ1)被确定为在BRCA DFS预测患者预后签名。FOXD1函数作为癌基因在肺癌、乳腺癌、和脑癌42,43),是调节促进乳腺癌细胞增殖和药物抗性诱导G1年代过渡(42]。FOXJ1 hypermethylated BRCA细胞系和临床组织样本,揭示其作为假定的肿瘤抑制基因(44]。此外,DNA_REPAIR是癌症的一个重要标志,在高危人群丰富,这是按照福克斯家族的功能,从而验证我们的研究的一致性。

癌症是一种复杂的多级过程涉及遗传和表观遗传变化,导致致癌基因的激活信号和/或肿瘤抑制信号的失活(45]。癌细胞获得一定数量的变化,促进肿瘤的生长和入侵46]。GSEA MSigDB,最初开发,仍然是最大的和最受欢迎的存储库的基因数据集(47]。GSEA数据库集中协调的微分表达式注释的基因或基因集和生产数据,可以更容易地解释有关的生物过程(48]。我们利用GSEA从MSigDB选择DFS预测的重要标志和11-TF预后签名。MYC_TARGETS_V1, MYC_TARGETS_V2、糖酵解和DNA_REPAIR丰富的高危人群,而ESTROGEN_RESPONSE_EARLY和ESTROGEN_RESPONSE_LATE被显著富集低风险组。MYC促进细胞周期进程通过激活到Cdc25A, E2F1, E2F2 [49]。此外,减少扩散是由减少MYC enteroendocrine细胞/ E2F1活动(50]。已经表明,MYC基因表达与GSEA高分数为MYC标志(MYC_TARGETS_V1和MYC_TARGETS_V2) (23]。2019年,玉等人表明,MYC在激进的扩散中扮演着一个关键的角色由BRCA细胞表型表现出表达ERα突变(51]。因此,针对MYC结合其他致癌途径提供了一种有前途的治疗策略BRCA [52]。在这项研究中,11 TFs被合并成一个面板,及其预后价值DFS BRCA成立。

最近,在几项研究,表明肿瘤浸润免疫细胞与癌症患者的预后相关(53,54]。进一步确定免疫浸润细胞之间的关系和TF签名,CIBERSORT分析揭示免疫浸润细胞的成分。在目前的研究中,高渗透的M2巨噬细胞与一个高风险的得分,而高渗透的休息CD4记忆⁺T细胞、CD8⁺T细胞是低风险评分。这些结果符合这些免疫细胞的生物学功能在癌症的发展过程中。在先前的研究中,据透露,M2巨噬细胞扮演了一个重要的角色在促进肿瘤的生长和转移55]。此外,M2巨噬细胞已报告是与不利三阴性乳腺癌患者的预后(56]。休息CD4记忆⁺T细胞、CD8⁺T细胞已被证明是与增加的总生存期(OS)和DFS的BRCA [57]。基于这些结果,我们相信这11-TF签名是可靠的风险评分预测BRCA患者的预后。

总之,我们已经确认和验证的预测预后11-TF签名DFS的BRCA患者。11-TF签名是一个独立的因素,可能作为一种补充临床病理因素的预后因素。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

同意

TCGA的知情同意和地理科目得到TCGA的地理协会,分别。

的利益冲突

我们国家没有利益冲突。

作者的贡献

CF负责收集文献和写作。JD和NL提出这项工作的想法,进行数据分析,实现实验验证和修订后的手稿。

补充材料

补充表S1:引物对qPCR。(补充材料)

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