文摘
背景。激素是一个独立的因素诱发甲状腺癌(TC)细胞的分化。的促甲状腺激素(TSH)可以促进TC的进展和入侵细胞。然而,一些基因相关激素的变化研究了在低分化转移TC。本研究旨在构建一套基因coexpression相关网络和验证有关的一些基因中心的变化调节激素水平。方法。微阵列基因表达数据集TC样本来自公共综合(GEO)数据库。R软件和生物信息学包是用来识别差异表达基因(度),重要的基因模块eigengenes和中心的基因。随后,该基因本体论(去)富集分析探索重要的生物过程,构造与低分化TC的机制有关。最后,一些中心通过实时聚合酶链反应和免疫印迹基因表达式被验证。结果。基因芯片与类别GSE76039数量进行了分析,筛选和1190度的标准 和 。我们的分析表明,人类双重氧化酶2 (DUOX2)和磷酸二酯酶8 b (PDE8B)是两个重要基因在coexpression网络中心。此外,验证试验结果表明DUOX2和PDE8B的表达水平升高在低分化转移TC组织。结论。本研究确定和验证DUOX2和PDE8B明显与甲状腺癌的转移能力有关。
1。介绍
甲状腺癌(TC)是最常见的内分泌恶性甲状腺组织,这被认为是相关激素水平和遗传易感性因素(1]。由于异常的细胞增殖的特点和可能蔓延到身体的其他部位,TC的发病率近几十年来迅速增加。根据国家癌症研究所的监测,流行病学调查表明,TC病人占所有的3.4%年度诊断(2]。截至2015年,全世界有320万人患有TC (3]。
在分化型甲状腺癌,大约4%的患者在诊断有远处转移,而另一个7%到23%的患转移性疾病患者在5年内(4]。淋巴结、肺、骨骼和大脑是常见的TC癌细胞转移网站(5]。研究表明,肺转移患者的预后差(6]。转移性TC更恶性,目前没有有效的治疗(7]。因此,它是非常重要和紧急的揭示TC转移的分子机制是非常重要和紧迫。先前的研究已经比较了TC组织的基因表达谱通过微阵列技术(8RT-qPCR],下一代测序(9]。差异表达的mrna在TC已报告在多个报告。然而,识别差异表达mrna从不同研究差异很大,和转移的关键基因表达TC仍需进一步补充。因此,在这项研究中,我们收集了TC-related基因微阵列基因表达数据概要形式综合(GEO)基因和评估,确定几个metastasis-related TC样本的基因表达水平。
2。材料和方法
2.1。微阵列数据和样本
信使rna的基因芯片表达数据集的TC从基因表达综合数据库下载(GEO) (10),作为公众对基因表达数据集的存储库。基因芯片GSE76039 GPL570平台生成的数组(人类基因组U133 Affymetrix + 2.0)11),包括20未分化TC (ATC)和17低分化转移TC (PDMTC)样本。获取相对基因表达水平在每个示例中,这个数据集使用分位数RMA规范化标准化。
验证靶基因的蛋白质浓度,10配对甲状腺癌患者和相邻的非癌变组织收集TC在北华大学的附属医院。从每个病人得到书面知情同意。该协议用于本研究机构审查委员会批准的北华大学的附属医院。
2.2。识别差异表达基因
意义(度)的差异表达基因筛选的DEseq2(版本1.30)包在R软件(3.4.2版)(12根据前面描述的方法(13]。确切概率法用于计算零假设的价值。所有与标准被认为是显著差异表达的基因 和 ( )。
2.3。加权基因Coexpression网络和基因模块
加权基因coexpression网络基于度构造使用WGCNA包R软件。重叠拓扑矩阵(汤姆)构造加权邻接矩阵建立之后的 (14]。汤姆的对象,两个基因的互联性是评估他们共享邻居的程度在全球网络(15]。
每个基因模块代表一个集群的基因有很高的拓扑重叠。所有的基因模块检测到平均每组的分层聚类。基因内的连接模块被使用在模块连接函数计算WGCNA包。模块eigengene(我),第一主成分,被用来评估一个给定的基因的会员模块和基因网络的重要性16]。
2.4。富集分析差异表达基因
R软件包和生物信息学工具被用来执行生物过程的浓缩度的分析。度(意味着logFC: 2.93)内富集分析结果映射到基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)数据库17通过clusterProfiler []18)包。在去富集分析,只有被认为是生物过程类别。重要度进一步检查使用基因集富集分析(GSEA)来过滤掉——或者表达下调基因(19]。度列表是根据logFC preranked值产生的基因表达联想测验。GSEA所有探测和执行的子集WGCNA模块的一个类似的概念和KEGG分析。
2.5。实时聚合酶链反应
总RNA被试剂盒从大约20毫克的组织分离试剂(美国英杰公司)根据指令。随后,1μ克总RNA受到互补脱氧核糖核酸合成使用RevertAid RT逆转录(美国表达载体)。的引物序列PDE8B (F: 5 - - - - - -AGTCAGCCCTTGAATGCTTTC-3 ;R: 5 - - - - - -GCATCGAAGTTCTGAGTTTGTCT-3 ),DUOX2 (F: 5 - - - - - -CTGGGTCCATCGGGCAATC-3 ;R: 5 - - - - - -GTCGGCGTAATTGGCTGGTA-3 ),和GAPDH (F: 5 - - - - - -GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3 ;5 - - - - - -GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3 )得到从PrimerBank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank)和合成从英杰公司(上海,中国)。实时PCR是由快速SYBR™绿色主人混合(美国表达载体)ABI 7500实时PCR系统(美国ABI)根据制造商的指示。
2.6。免疫印迹
总蛋白提取使用里帕缓冲区包含从组织蛋白酶抑制剂。蛋白质浓度测定用BCA试剂盒(美国表达载体)。大约50μg的每个蛋白质都装上一个sds - page凝胶。蛋白质电泳后,都被转移到PVDF膜。PVDF膜稀释主要抗体孵育过夜在4°C (PDE8B 1: 500年,春秋国旅;DUOX2 1: 500年,春秋国旅;和GAPDH, 1: 1000年,春秋国旅)。随后,细胞膜是孵化anti-mouse免疫球蛋白,HRP-linked抗体(CST 1: 1000年,美国)。最后,增强化学发光检测系统(FluorChem NatureGene corp .)被用来检测PVDF膜上的蛋白表达。
2.7。统计分析
所有的数据进行了处理和分析IBM SPSS 24.0软件(美国芝加哥,IL)。学生的 - - - - - -测试是用来评估和统计差异 被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。度的加权基因Coexpression网络
不同的归一化预处理(图后表达数据进行了分析1)。总数1190包括479调节和711个表达下调基因的重要标准( 和 )筛选(图2(一个))。随后,基因coexpression加权网络的1190度是由WGCNA包。结合汤姆,分层平均连锁聚类法应用于检测基因网络中的模块。发现的基因模块动态树切割(的原则 , )。在空中交通管制和PDMTC组,四个基因模块识别(图2 (c))。基因不属于任何模块被忽略了在这个研究和归类为灰色模块。
(一)
(b)
(c)
(d)
正如所料,基因模块之间有高度的相关性。意味着模块成员或意味着模块eigengenes内基因表达的相关性,相关系数的值从0.65到0.91在所有基因模块(图2 (d))。进行了相关测试的模块eigengenes和总结在图2 (d)控制后,所有模块都显著的错误发现率(罗斯福)。
3.2。生物过程度的结果
GSEA进行与度除了灰色模块通过富集分析,结果遇到了显著水平 表中列出1。最重要的术语主要是侧重于甲状腺发展和激素代谢过程(图2 (b)、表1)。此外,所有这些术语被激活在PDMTC与主ATC样品相比,和大多数的基因调节(图2 (b))。
3.3。度的交互网络
中心基因高度代表关键角色的规定TC地位由于整个网络中重要的生物学意义。确定基因在顶级中心重要的术语,在模块连接计算基于邻接矩阵与签署了汤姆。最强的顶部连接模块内的基因提取阈值为0.25。结果表明,DUOX2和PDE8B最高的两个核心基因连接(图3(一个))。由于相同的基因在不同的生物过程,重叠的过程是不可避免的和筛选基因可能参与多个进程。因此,构建一个网络交互的主要生物过程是必要的探索途径的信号传输。coexpression网络,主要相关的生物过程与甲状腺激素代谢过程几乎是大大丰富(图3 (b))。
(一)
(b)
3.4。表达式PDE8B DUOX2
确认的基因表达水平DUOX2 PDE8B在甲状腺癌组织中,PDE8B的mRNA水平和人类TC和相邻noncutaneous DUOX2组织被实时PCR检测。结果表明,PDE8B和DUOX2都显著增加在所有TC组织与邻近noncutaneous组织(图4(一))。进一步评估两种蛋白质的表达水平,免疫印迹实验根据指令执行和结果表明,蛋白质含量TC PDE8B和DUOX2也高的样品(图4 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
PDMTC通常表现得更积极,与存活率比分化良好型的患者(20.]。因此,有必要开发新型候选基因开发靶向治疗(21]。在这项研究中,我们旨在调查TC病人的基因表达特征促进更好地理解PDMTC转移的机制。
WGCNA已广泛用于数据挖掘,尤其是在研究生物网络和分析基因表达数据找到intramodular中心基因(22]。通过WGCNA和富集分析,分析了1190度内包括四个重要基因模块。此外,一些中心基因高度被发现与甲状腺激素代谢过程有关。我们的验证实验结果明显展示了两个重要基因DUOX2和PDE8B在转移性TC组织评估。
DUOX2首次发现是在哺乳动物的甲状腺组织,主要在唾液腺和胃肠道23]。DUOX2活动行为的一个关键的角色在甲状腺球蛋白的结合iodine-bound甲状腺过氧化物酶(TPO)。Ginabreda et al。24]发现DUOX2之间显著负相关,病理生理学的传真照片TC。然而,Lacroix et al。25)报道,DUOX蛋白质的表达水平呈正相关,肿瘤细胞分化和TC组织中更为普遍。此外,启动子DUOX2被TSH和胰岛素诱导甲状腺癌形成(26]。浓缩结果表明DUOX2相关基因生物过程中激活PDMTC组。这些证据提高DUOX2的潜在作用的机制转移TC。
PDE8B被认为有最高的亲和力阵营和规范阵营信号(27]。最近的一项荟萃分析报道,常见的遗传变异PDE8B TSH和T4(自由变化显著相关28]。研究结果表明,甲状腺激素水平将重要的流行病学研究,提供了强有力的证据,PDE8B参与甲状腺TSH信号通路(28]。GSEA分析结果表明,生物过程”调节激素水平(去:0010817)”被激活。这些证据表明PDE8B可能发挥关键作用调控不是水平,这是一个独立的危险因素有区别的TC和颈部淋巴结转移的影响29日]。
另一个有趣的基因包括EGR1、TSHR PAX8, HPN, TG与我们的研究相关细胞与荷尔蒙相关的活动。例如,促甲状腺激素受体(TSHR)和促甲状腺激素反应(也称为“促甲状腺素”)是一个膜蛋白和甲状腺细胞代谢的主要监管机构,包括刺激生产的甲状腺素(T4)和三碘甲状腺氨酸(T3)鱼精蛋白。这些基因缺陷的原因许多类型的甲状腺机能亢进(30.]。最近,一项研究表明,TSHR显著下调分化良好型的TC样品和提升TC细胞入侵和转移(31日]。此外,多变量分析表明,TSHR的重要预后因素预测转移和总生存期(31日]。
总之,这项研究证实了两个新的候选基因,DUOX2 PDE8B,可作为预后生物标志物或转移患者的治疗靶点TC。本研究将为阐明提供重要信息的生理和分子机制TC细胞转移。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Zhenguo太阳和Xiaoshuai元的贡献同样这项工作。