文摘

背景。虽然研究显示,微rna - 603起着至关重要的作用在许多癌症,微rna - 603在皮肤黑色素瘤的调节机制仍然未知。我们旨在调查的角色在皮肤的黑色素瘤细胞微rna - 603。方法。首先,微rna - 603表达在皮肤黑色素瘤细胞系检测中存在。TBX5 mRNA和蛋白表达水平的皮肤黑素瘤细胞系被存在和免疫印迹检测,分别。此外,微rna - 603之间的交互和TBX5由dual-luciferase决定报告基因分析,及其对皮肤黑素瘤细胞的生长的影响被检测到细胞功能实验如麻省理工、集落形成,Transwell化验。结果。表达人类皮肤的黑色素瘤细胞的微rna - 603水平相对调节。Overexpressing微rna - 603可以促进皮肤的黑色素瘤细胞的发展,而微rna沉默- 603表达可以抑制皮肤黑色素瘤的恶性发展。此外,TBX5低表达在皮肤黑色素瘤细胞。dual-luciferase试验证实,微rna - 603可以专门绑定到3UTR TBX5和调节TBX5。救援实验的结果表明,抑制微rna - 603表达可以抑制增殖,迁移,和皮肤的黑色素瘤细胞的入侵,但其抑制效应可能被TBX5恢复。结论。微rna - 603可以调节TBX5的表达,促进皮肤的黑色素瘤细胞的恶性发展。

1。介绍

小分子核糖核酸是一种内源性小非编码RNA分子,发挥负面作用在调节基因表达的绑定到3翻译区(UTR)目标信使rna诱导的信使核糖核酸的翻译抑制或转录后的退化1,2]。众所周知,微概要文件在癌症不同概要文件在正常状态,和小分子核糖核酸特异表达影响肿瘤进展microRNA-mRNA监管机制(3]。微rna - 603被认定为肿瘤促进microRNA在一些癌症。例如,郭等人的研究(4)表明,微rna - 603激活神经胶质瘤细胞的肿瘤生长。在一项由马et al。5),这是解释说,微- 603 / BRCC2监管轴促进骨肉瘤。然而,对于卵巢癌,microrna - 603是一个肿瘤抑制[6]。完全,microrna - 603似乎癌症中扮演不同的角色,以便更广泛研究微rna - 603急需。

皮肤黑素瘤是一种恶性皮肤癌,其特征是积极的转移性增长和预后不良(7]。许多研究报道microrna在黑色素瘤的肿瘤促进/抑制机制。microRNA-26a一样,例如,几个小分子核糖核酸微rna - 137和微- 148,可以作为肿瘤抑制,针对MITF主调节基因,在黑素瘤(8- - - - - -10microRNA-10b等),而其他小分子核糖核酸microRNA-17, microRNA-19,被认为是肿瘤促进因素,针对痒,ETV1, PITX1,分别在黑色素瘤(11- - - - - -13]。广泛,一些研究者也集中在小分子核糖核酸对黑色素瘤免疫治疗和耐药的影响14- - - - - -16]。总之,microRNA-mRNA轴在黑色素瘤的发展起到了至关重要的作用,治疗,和耐药性;然而,在黑素瘤microRNA-mRNA监管机制尚未完全清楚。

在这项研究中,微rna - 603表现出显著的过表达在人类皮肤的黑色素瘤细胞系,并且还可以促进皮肤的黑色素瘤细胞的发展。我们进一步证实T-box转录因子5 (TBX5)直接监管微rna - 603的目标。本研究进行了一次深入调查微rna的表达水平- 603和TBX5在皮肤的黑色素瘤和对黑色素瘤细胞的发展的影响。这些研究提供了一个依据新的皮肤黑色素瘤的治疗靶点。

2。材料和方法

2.1。细胞系,细胞培养

正常的人类黑色素细胞PIG1 (BNCC340321)和人类皮肤的黑色素瘤细胞系A375 (BNCC352140) M21 (BNCC340167)和SK-MEL-1 (BNCC342058)都是由希伯来文名字文化集合(BNCC)。人类皮肤的黑色素瘤细胞系WM35 (BFN60808633) Malme-3M (BFN607200871)和SK-MEL-30 (BFN60805921)从BLUFBIO购买(上海)生物科技发展有限公司有限公司

PIG1、A375 SK-MEL-1细胞系都孵化rpmi - 1640中含10%胎牛血清的边后卫。细胞系M21、WM35 Malme-3M, SK-MEL-30在DMEM培养(美国σ)加上10%的边后卫(Hyclone;美国通用电气医疗集团生命科学,洛根,UT)。所有的细胞都在恒温孵化器孵化37°C公司为5%₂。

2.2。细胞转染

模拟数控,microrna - 603模拟,抑制剂数控,微rna - 603缓蚀剂,si-NC, si-TBX5都由Sangon生物技术(上海,中国)。Lipofectamine 2000(热费希尔科学,Inc .)应用于瞬变使转染合成序列或表达质粒对人类皮肤的黑色素瘤细胞Malme-3M和A375。之后,相应的细胞培养介质有限公司为5%₂在37°C,以供将来使用。在转染前,所有的细胞都应该保持在完全培养基至少24 h和清洗磷酸盐(PBS, pH值7.4)。

2.3。中存在

总RNA转染细胞的分离试剂盒试剂(生活技术,大岛,纽约,美国)。RNA浓度是2000年由NanoDrop系统(热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)。根据设备指令,小分子核糖核酸信使rna是反向转录成互补的miScript IIRT工具包(美国试剂盒)和PrimeScript RT大师混合(豆类,大连,中国),分别。微rna的表达- 603和TBX5 mRNA测量与应用生物系统公司存在®7500实时PCR系统(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)通过使用SYBR®预混料交货Taq™II(豆类生物有限公司、志贺、日本)。U6 GAPDH和作为内部参考微rna - 603和TBX5,分别。2^{- - - - - -ΔΔCt}值是用来比较相对表达式之间的区别。引物序列表现出表1。

2.4。免疫印迹

与PBS洗两次后,细胞细胞溶解与radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(美国马热费希尔科学)。蛋白质浓度测试用BCA (bicinchoninic酸)蛋白质分析工具包(Beyotime)。等价的蛋白质样本孤立10%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(50μg /车道)。然后,样品被转移到聚偏二氟乙烯或聚乙二烯二氟化物膜(zy - 160 fp Zeye生物有限公司,有限公司,上海,中国。膜在5%脱脂奶被捕37°C 2 h。随后,这是洗3次Tris-Buffered盐水和渐变20 (TBST)和孵化一夜之间在4°C兔多克隆抗体TBX5(1: 1000年,ab259980 Abcam,剑桥,英国)。兔多克隆抗体GAPDH(1: 2500年,ab9485 Abcam,剑桥,英国)被用来控制。与TBST洗后,细胞膜是孵化与山羊antirabbit免疫球蛋白g h和l(1: 2000年,ab205718 Abcam,剑桥,英国)2 h。最后,一个增强化学发光(ECL)工具包(皮尔斯生物技术)是用于开发的膜,和蛋白质分析了乐队成像系统(美国ZG11SCIBRIGHTCL Bio-Rad, CA)。

2.5。MTT试验

黑色素瘤细胞Malme-3M和A375消化后,利用离心力分离,resuspended, 细胞被补充到每个的96孔板和三个复制井和常规条件下培养。4 d细胞连续培养,10μL MTT添加每100μ每天L培养基,细胞培养4 h。测量吸光度值标在570 nm,评估细胞增殖。细胞生长曲线绘制了水平轴和每组细胞的吸光度比值在每个时间点的纵轴。

2.6。集落形成实验

转染48 h后,500个细胞都放在6-well细胞培养板。每2 d媒介文化所取代。文化后15 d, PBS的细胞被洗两次,固定与甲醇在室温20分钟,结晶紫染色和0.1%,持续15分钟。最后,殖民地至少有50个细胞数用显微镜。

2.7。Transwell化验

细胞迁移试验: 转染细胞接种到参议院Transwell室,和一个细胞培养基+ 10%的边后卫加入下议院刺激细胞入侵。文化24 h后37°C,内外细胞被轻轻删除。剩余的细胞被固定在4%多聚甲醛15分钟和沾0.1%结晶紫为20分钟。染色细胞是由一个光学显微镜观察,和五个地区被随机选择100 x放大计算染色细胞的数量。然后,进行统计分析。细胞入侵检测类似于细胞迁移试验除了细胞入侵检测需要20μg细胞外基质凝胶(Sigma-Aldrich;默克公司)在参议院被覆盖。

2.8。Dual-Luciferase化验

合成突变体(狗)或野生型(WT) 3UTR TBX5被克隆到下游的荧光素酶向量pmirGLO(美国WI Promega)构建荧光素酶报告质粒WT-TBX5 MUT-TBX5。随后,人类皮肤的黑色素瘤细胞Malme-3M cotransfected质粒和微- 603模拟或模拟数控,虽然A375细胞cotransfected质粒和微- 603剂或抑制剂数控。Renilla荧光素酶表达载体pRL-TK(豆类、大连、中国)被用来作为内部参考。dual-luciferase测定的荧光素酶活性测试套件(WI Promega,麦迪逊,美国)。

2.9。数据分析

实验数据分析GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad Prism 6.0,圣地亚哥,CA,美国)。上述细胞实验重复三次。测量数据被表示为 。两组之间的比较是检查学生的 - - - - - -测试。 指的是统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。微rna - 603在不同的黑素瘤细胞系表达明显升高

研究表明,微rna - 603通常是培养在各种癌症组织和肿瘤通常稳定发展,像骨肉瘤5),神经胶质瘤(4),和结直肠癌17]。在这里,我们通过中存在微rna - 603测试表达式。结果公布,微rna - 603在人类皮肤黑素瘤细胞系是高于正常的人类黑色素瘤细胞系(图1)。因此,黑素瘤细胞Malme-3M微rna - 603表达水平和最低的A375微rna - 603表达水平最高的被选为后续细胞功能实验。

3.2。Overexpressing微rna - 603促进黑色素瘤细胞Malme-3M进展

探索微rna - 603黑素瘤细胞的生物功能,模拟数控和微- 603模拟Malme-3M转染到黑色素瘤细胞。转染和文化2 d后,微- 603水平是衡量存在。结果表明,微- 603超表达可以有效提高微rna - 603(图的表达2(一个))。然后,MTT试验的结果表明,黑素瘤细胞的增殖能力overexpressing微rna - 603年组(图2 (b))。此外,微rna转染黑素瘤细胞的单克隆- 603模拟也明显增强(图2 (c))。Transwell化验结果如图2 (d)和2 (e)。与阴性对照组相比,细胞迁移和侵袭性能力在微- 603模拟组增强。总之,upregulation微rna - 603可以促进恶性黑色素瘤细胞的过程。

3.3。Downregulation微- 603抑制黑色素瘤细胞的发展

同样,抑制剂数控和微- 603缓蚀剂使用转染黑素瘤A375细胞。转染和文化的2 d后,存在结果表明微- 603年抑制剂实验组,微rna - 603的表达水平低于对照组(图3(一个))。因此,转染细胞可以用于后续实验。接下来,在数字展出3 (b)和3 (c)与阴性对照组相比,黑素瘤细胞的增殖能力和单克隆都抑制微- 603年抑制剂实验组。Transwell化验结果显示数据3 (d)和3 (e)。与阴性对照组相比,细胞迁移和侵袭性微rna - 603抑制剂组的能力都减弱。因此,我们认为,微rna沉默- 603可以抑制黑色素瘤细胞的发展。最后的结果部分2。2和2。3,microrna - 603可能影响扩散、迁移和入侵皮肤黑色素瘤细胞。

3.4。TBX5表达式是在黑色素瘤细胞中表达下调和直接监管微rna - 603的目标

为了更好地理解微rna - 603的分子机制影响黑素瘤细胞的表型,下游监管轴是探索。文献综述说明,TBX5是一个肿瘤抑制,可以通过一些oncomicroRNAs表达下调18,19]。因此,我们认为,微rna - 603可以绑定到TBX5 mRNA,从而抑制其表达在转录后的水平。确定的绑定关系,TargetScan数据库应用于预测微rna - 603和TBX5之间的结合位点,(图和结果验证该绑定关系4(一))。合成傻瓜或WT 3UTR pmirGLO TBX5克隆到下游的荧光素酶向量,以构建荧光素酶报告质粒TBX5-WT和TBX5-MUT(图4 (b))。首先,存在和免疫印迹结果体现,与正常人黑素细胞细胞系相比,TBX5表达式在黑色素瘤是表达下调(图4 (c))。接下来,dual-luciferase报告基因化验证实cotransfecting TBX5-WT微- 603模拟或微- 603抑制剂可以诱导减少或增加荧光素酶活动,分别虽然没有荧光素酶活性改变使用TBX5-MUT转染组(图4 (d))。此外,存在和免疫印迹分析也表明转染微- 603模拟可以显著减少TBX5 Malme-3M细胞的表达,而转染的微rna - 603抑制剂可以明显提高TBX5 A375细胞(数字的表达4 (e)和4 (f))。这些结果表明,微rna - 603可以通过直接针对下调TBX5表达式。

3.5。微rna - 603影响黑色素瘤细胞通过调节TBX5进展

我们证实,在黑素瘤细胞系,microrna - 603高表达。然后,为了更好地验证微rna - 603和TBX5之间的关系以及它们对黑色素瘤细胞的影响行为,进行了一系列细胞功能实验。首先,转染组的黑色素瘤细胞系A375构造,包括抑制剂数控+ si-NC,微rna - 603抑制剂+ si-NC,微rna - 603抑制剂+ si-TBX5组。存在和免疫印迹结果展示图5(一个)。与对照组相比,TBX5表达升高微- 603表达抑制的时候,当时TBX5的表达抑制两个基因同时沉默。MTT和集落形成试验,观察到肿瘤细胞的增殖活性和单克隆都减少A375细胞转染和微- 603缓蚀剂。然而,当微rna - 603和TBX5同时抑制,细胞的增殖能力明显恢复(数字5 (b)和5 (c))。此外,Transwell化验结果中演示的数据5 (d)和5 (e)。与阴性对照组相比,细胞迁移和侵袭性能力都是抑制微- 603年抑制剂+ si-NC组。然而,在微- 603抑制剂+ si-TBX5转染组,肿瘤细胞的迁徙和侵入性能力明显恢复。因此,这些结果共同表明,低表达微rna - 603可以抑制增殖,迁移,和黑色素瘤细胞的入侵,而其抑制作用可能压制TBX5所抵消。

4所示。讨论

在这项研究中,我们首先研究了微rna - 603在皮肤黑色素瘤细胞系中存在。实验结果表明,微- 603表达在皮肤黑色素瘤细胞系普遍高于正常组织。探讨微rna - 603的作用在皮肤的黑色素瘤细胞的细胞功能的变化,微rna - 603是过表达和抑制皮肤黑色素瘤细胞系Malme-3M A375,分别观察细胞增殖的变化,移民,和入侵,等。结果表明微rna - 603促进增殖,迁移,和皮肤的黑色素瘤细胞的入侵,表明微rna - 603很有可能作为皮肤黑色素瘤的促进因素。

TBX5系统守恒的基因家族中的一员。这个家庭同样的DNA结合域称为T-box。TBX5包含T-box序列可以利用转录因子诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖(20.和细胞间信号转导21),和消极的调节细胞迁移通过调节转录(22]。研究证实,TBX5起到了很重要的作用在抑制癌症的各种组织。例如,在结肠癌(23),TBX5有高度甲基化和低表达水平。TBX5通常是低nonsmall细胞肺癌,和upregulation TBX5明显压制的癌细胞(18]。然而,TBX5在黑色素瘤的分子调节机制尚不清楚。因此,我们选择它作为我们的研究对象,我们预测TBX5之间的结合位点和微- 603通过TargetScan数据库。然后,dual-luciferase试验进行验证TBX5微rna - 603的直接监管目标。TBX5是皮肤黑色素瘤细胞中表达下调,其表达水平由微rna - 603调制。基于微rna - 603和TBX5的表达状态,以及它们之间的绑定交互,我们提出微- 603 / TBX5轴在皮肤的黑色素瘤。

总之,在这项研究中,是体现微rna - 603非常调节皮肤的黑色素瘤细胞中,它扮演了一个角色,通过定位和调节TBX5表达一个促进因素。本研究有助于理解生物功能的微rna - 603 / TBX5监管轴在肿瘤的发生,预计将提供一个新的皮肤黑色素瘤的分子治疗的目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

所有作者宣称他们没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

XH导致了研究设计,进行文献检索,获得数据。YW导致数据管理、数据分析、可视化,文章修改。YQ导致了研究设计,进行文献检索,获得数据。小文章写道。XE进行数据分析。我修改后的文章,给提交版本的最终批准。所有作者阅读和批准最终的手稿。Xianghua盾和王应了同样的工作。