文摘

动机。皮肤肿瘤是一种频繁发生癌症,2 - 3全球百万实例报道。紫外线和环境污染物和其他污染物可能是皮肤癌的潜在因素。细胞周期蛋白D1基因是一种严重的包括在控制通过细胞周期G1期的发展。赭曲霉毒素A是一种自然现有的霉菌毒素主要发生在食品像谷物。它负责产生单链DNA的分割和识别是致癌的。它建立了一个关键风险因素对雄性和雌性的生殖健康。方法。赭曲霉毒素A的一剂用于局部皮肤肿瘤评估申请促销活动,增生,鸟氨酸脱羧酶活性,细胞周期蛋白D1和cox - 2的表达在小鼠皮肤。在DNA的合成,增强表皮生长因子受体的激活,细胞周期蛋白D1和cox - 2的过度。主要小鼠角化细胞细胞培养是培养Waymouth的媒介。免疫印迹分析和实时聚合酶链反应(rt - pcr)是用于检测细胞周期蛋白D1和cox - 2的表达。染色质免疫沉淀反应(芯片)分析被用来AP-1转录和核之间的关系factor-kappaB (NF -κB) cox - 2和周期蛋白D1的推动者。结果。结果发现,细胞周期蛋白D1和cox - 2负责刺激OTA-induced PMK扩散和增生。影响。EGFR-mediated通路也负责肿瘤促进在线旅行社。

1。介绍

根据世界卫生组织(世卫组织)分析,的情况下的非黑素瘤皮肤癌是扩大大约2 - 3百万新诊断病例(1]。然而,紫外线(UV)来自太阳的射线检查皮肤癌的主要原因;不过,揭露更多可能的致癌化学物质包括真菌毒素无法控制,需要评估(及其毒性2]。真菌毒素的真菌下属代谢物,通常发现以及观察无法预防的全球污染物由于全球自然栖息地的真菌。

赭曲霉毒素A (OTA)是一种霉菌毒素即源于各种曲霉菌和青霉菌的家庭,这是一个熟悉的污染物中发现小麦、咖啡、香料、等,损害人类健康和畜牧业(3]。初步研究显示肾脏作为赭曲霉毒素A的主要目标器官毒性除了神经元的演变,包括肝脏以及人体抵抗系统(4]。目前,对公众健康赭曲霉毒素A是一个至关重要的警告。多个种类的真菌曲霉菌、青霉菌和链格孢属产生真菌毒素赭曲霉毒素A (5]。

霉菌毒素的赭曲霉毒素A特别针对肾脏和能够相交胎盘阻塞以及发现新创建的胎儿其破坏性影响(6]。赭曲霉毒素A的接触被确定为一个重要的威胁元素在雄性和雌性生殖系统在全球范围内。除了不利健康影响生殖系统和肾脏系统,赭曲霉毒素A的协会是钢筋的变形,肝毒性、免疫和神经毒性,可以证明在实验室以及牲畜和人类(7]。

对动物进行实验时,肾脏被公认为赭曲霉毒素A的主要意图器官毒性和致瘤性的进一步升级提示肾腺瘤发展公司与尿路肿瘤(8]。然而,访问的流行病学信息并不足以评估相关的可能威胁赭曲霉毒素A提交给人类,并广泛认识到,赭曲霉素的分子过程的解释一个温和的致癌效应将显著协助评估赭曲霉毒素A的威胁(9]。irritant-based响应被确定为致癌作用的过程的一个初步阶段(10]。许多最近的研究已经建立了环氧合酶(COX)参与肿瘤的进化过程。报告显示,在线旅行社有属性初始化皮肤肿瘤相关的氧化应激,MAPK信号传导,DNA损伤(3]。

细胞的分裂是一个主要的过程在所有生物体。在细胞分裂过程中,DNA的复制和细胞的扩张也发生。标准的细胞周期由休止期,即。,细胞G0,丢弃的周期和分裂的过程结束。这是细胞周期启动的阶段,下一阶段是相间gap1或者G1始于在细胞的大小的扩张。该检查点的G1调节整个操作安全的细胞DNA混合物的资格。在间期第二阶段被称为S期或合成阶段中DNA的娱乐。最后,细胞进入G2期细胞继续进行扩张,和这一阶段保护细胞进行有丝分裂。人类体质的皮肤是实质性器官容易受到阳光、空气污染物元素,更多的环境组件指南引发皮肤癌。

环氧酶的酶仲裁员是炎症的过程,负责花生四烯酸转化为前列腺素和血栓素。Cyclooxygenase-2由有限细胞计数和显示由进步促使元素(11]。这种蛋白质的overdemonstration中确定各种传染性肿瘤还包括肺癌、前列腺癌和乳腺癌12]。

Cyclooxygenase-2高环氧酶的诱导形式通常在癌症组织(13]。控制蛋白质和细胞周期蛋白D1是一个g1期checkpoint-based也可能原癌基因特征的不同,参与过程中不同种类的肿瘤的发病机理。已经建议细化以及细胞周期蛋白D1的超表达是一个相当不寻常的发生主要和tumor-acquired前列腺细胞系。细胞周期蛋白D1的致癌特性提出的协作与ras或腺病毒E1A转化培养细胞(14)连同其超表达转基因小鼠,总结在乳腺癌的创建。细胞周期蛋白D1确定是首席胞内细胞外的中介指标如有丝分裂原控制扩散的过程。

2。材料和方法

2.1。化学物质

在线旅行社(霉菌毒素赭曲霉毒素A), TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) 2-mercaptoethanol DMBA (7, 12-dimethylbenz [α)蒽)和三羟甲基氨基甲烷缓冲液从西格玛奥德里奇,美国;牛血清白蛋白,乙二胺四乙酸二钠盐,phenylmethylsulfonyl氟化物,和蛋白酶抑制剂鸡尾酒集我是来自热费希尔科学;反β肌动蛋白、anti-cyclin D1 anti-p-NF -κB anti-c-fos烂醉如泥的(奶粉),anti-c-jun, anti-p-IκBα从Bioz获得;anti-p-ERK1/2、anti-p-EGFR anti-p-JNK、anti-COX-2 anti-p-Akt, anti-p-p38从Abcam获得。(³H]胸苷和[¹⁴从PerkinElmer C]鸟氨酸得到。所有使用的化学品是优质和纯洁。

2.2。动物研究

七至八周大白化小鼠(称重 )从成都得到漂亮的实验动物有限公司有限公司动物设施。小鼠适应条件下按提供的标准协议和颗粒食品和水随意。一个12 h黑暗/光周期 温度是由维持湿度高达50 - 55%在动物的房子。所有的实验都是正式获得伦理委员会批准,和标准程序实验。

老鼠的帮助下剃一个阿哥斯电推剪(Argos,英国)。所有的头发被完全使用脱毛霜前一周的实验开始了。的老鼠没有任何头发生长的迹象被选作实验。老鼠牺牲使用颈椎脱位经IAEC(机构动物伦理委员会)和规则制定动物牺牲最小的痛苦过程。

2.3。实验设计

进行tumor-based研究白化小鼠被随机挑选了六组与8动物。所有的动物都被关在单独的笼子里。实验是按照协议(表1)。

2.4。制备小鼠角化细胞细胞培养

主要鼠角质细胞被隔绝白化病老鼠解释Yuspa et al。(1974)。新生的老鼠幼崽被安乐死,然后用70%乙醇消毒。剥去皮肤是蘸trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸溶液(0.25%)在37°C 2.30小时。表皮被撤Waymouth皮肤层,然后切碎的介质(热费希尔科学)与10%胎牛血清(西格玛奥德里奇)。孤立的细胞被允许附加在5%的培养板有限公司₂在37°C 2.30小时。然后,媒介一直无血清培养系统取代KGM-2(角化细胞生长medium-2)氯化钙(0.03毫米)。

2.5。选择安全、无毒的OTA剂量

5-dimethylthiazol-2-yl MTT (3 - (4) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)比色测定用于确定noncytotoxic剂量的赭曲霉毒素A (OTA)。

2.6。免疫印迹分析

免疫印迹分析cox - 2和细胞周期蛋白D1在皮肤组织进行孤立的从动物治疗组。从每组随机选取三个老鼠。最初,在第一组动物一剂0.2毫升丙酮的对照组。然后,动物组2 - 8给出了局部应用100 nmol /鼠标赭曲霉毒素a (OTA)后来牺牲后1、3、6、12、24、48和72小时。~ 2厘米²皮肤被从每个动物,细胞溶解产物从老鼠的皮肤是准备免疫印迹分析。

主要鼠角质细胞治疗有或没有赭曲霉毒素A (OTA)的免疫印迹分析细胞周期蛋白D1, cox - 2, p-Akt, p-EGFR, p-JNK, p-ERK1/2》κBαp-NF -κB, p-p38细胞收获时,固定的时间点和PBS(磷酸盐)洗。然后,裂解radioimmunoprecipitation试验(冷)和磷酸酶和蛋白酶抑制剂。蛋白质得到10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶当时electrotransferred聚偏二氟乙烯膜。

膜被使用%脱脂奶粉和屏蔽解决方案20 - 0.1%渐变和磷酸盐,然后孵化使用抗体所提到的制造商。这一过程伴随着孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(Kementec)。化学发光的帮助下被绑定二级抗体增强Amersham™ECL™免疫印迹检测试剂(西格玛奥德里奇)。蛋白质的墨迹reprobed平等在装货β肌动蛋白。

2.7。转染和荧光素酶检测

主要鼠角质细胞被保存在一个six-well板(10⁶每口井)增长到60%融合。一个jetPRIME®Polyplus-transfection与质粒DNA转染工具包用于使转染细胞所提到的制造商。评估的影响,cox - 2和细胞周期蛋白D1子行动,一个测试运行,每一个使用荧光素酶转染(1μg)和启动子的实验周期蛋白D1的1745个基点。

在第二个实验中,主要鼠角质细胞转染与荧光素酶记者(1μcox - 2 g)和催化剂是897个基点。在接下来的实验中,巨细胞病毒(豆类Bio)作为启动子荧光素酶报告(1μg)转染主要鼠角质细胞;这是一个积极的控制。

16小时后,转染细胞治疗5.0μM赭曲霉毒素A (OTA) 24小时。一步™的荧光素酶检测系统(BPS生物科学)是用于测量荧光素酶的活动。发光是记录在一个光度计(热费希尔科学)。量化为每个细胞蛋白质的溶解产物是由BCA (bicinchoninic酸)蛋白质分析。

2.8。实时聚合酶链反应(rt - pcr)

试剂盒试剂(ABP生物科学)是用于隔离总RNA从小鼠表皮以下提到的制造商的步骤。mRNA的表达细胞周期蛋白D1和cox - 2在初级鼠角质细胞的帮助下确定逆转录-聚合酶链反应(15]。总RNA收集从vehicle-treated或OTA-treated主要鼠角质细胞通过制造商的指令(热费希尔科学)。互补脱氧核糖核酸是由rt - pcr扩增和SYBR绿色检测系统(西格玛奥德里奇)。量化的信使rna,我们使用3μg RNA合成互补DNA(互补)通过逆转录反应(SensiFAST™互补脱氧核糖核酸合成装备,Bioline,子午线生物科学)。在一步法rt - pcr进行过程治疗总RNA RNase-free DNase由试剂盒OneStep rt - pcr设备。200 ng RNA被每一个模板示例的反应。

确保放大的完整性,样本一式三份。引物配对(表2)被用于测量mRNA的表达细胞周期蛋白D1和cox - 2。GAPDH(甘油醛3 -磷酸脱氢酶)作为内标。

PCR条件是15分钟95°C和四十周期为30秒(95°C), 30秒(55°C), 30秒(72°C)所引物的制造商。基因表达式被规范化β肌动蛋白mRNA表达水平对于每一个样本。

分析基因的信使rna可以确定表达式的帮助下循环阈值(Ct)方法。β肌动蛋白作为内部控制,和平均Ct值计算目标基因的表达。

2.9。鸟氨酸脱羧酶(ODC)酶活性

动物被分成六个小组,每组5动物估计鸟氨酸脱羧酶酶活性(表3)。

动物牺牲后4小时的治疗,和皮肤的分析解剖了胞质ODC活性衬底的帮助下(¹⁴鸟氨酸。

2.10。(³H]胸腺嘧啶核苷掺入评估细胞增殖

在每个被分为三组有5个动物评估小鼠皮肤的细胞增殖。第一组是局部使用0.2毫升丙酮作为对照组。第二和第三组治疗霉菌毒素赭曲霉毒素a - 100 nmol / 0.2毫升丙酮,分别由24和48小时。两个小时之前牺牲所有的动物,³H]胸苷是腹腔内和皮肤管理收集。然后,(³H]胸腺嘧啶核苷掺入试验进行(16]。

2.11。免疫沉淀反应试验

确定之间的关系AP-1转录和核factor-kappaB (NF -κ与cox - 2 B),细胞周期蛋白D1的推动者,染色质免疫沉淀反应(芯片)进行了化验,皮尔斯™磁性芯片工具包(热费希尔科学)和制造商的指示。染色质免疫沉淀反应是用p65 (2.0μg)(表4),以及一只兔子IgG抗体在一夜之间在4°C。5μl(每个样本用于PCR扩增,和PCR产品(50μl)加载在琼脂糖凝胶。

PCR混合物被放大5分钟1循环(94°C),和随后35周期为30秒94°C, 30秒55°C, 45秒72°C和最后10分钟(72°C伸长)。芯片分析进行三次准确的结果。2%琼脂糖凝胶用于PCR。

2.12。组织病理学

一小部分的皮肤是孤立的,在生理盐水洗(冷)的解决方案,然后缓冲福尔马林溶液固定在10%。部分是嵌入在石蜡后加工,5毫米厚的部分被削减和染色使用)(苏木精和伊红)。图像进行显微镜检查(徕卡显微镜DM1000)和徕卡相机DFC295被捕。

2.13。免疫组织化学

免疫组织化学的过程[所执行17]。组织固定在切割并且deparaffinized福尔马林。幻灯片是孵化1:50兔单克隆抗体anti-anti-cyclin D1和1:1000稀释兔多克隆抗体anti-COX-2 / cyclooxygenase-2(圣克鲁斯生物技术,CA)。苏木精染色用于对比染色细胞核。积极的控制也染色,分别。

2.14。增殖细胞核抗原免疫染色

Formalin-fixed组织通过deparaffinization,让他们在去离子水保存在一个微波5分钟和阻断内源性过氧化物酶。幻灯片是染色使用鼠标单克隆抗体对细胞增殖核抗原所提到的(18]。

2.15。BrdU疣状

标本注射BrdU孵化了一个anti-BrdU抗体1:25(热费希尔科学),随后FITC anti-mouse免疫球蛋白(西格玛奥德里奇)。

2.16。统计分析

所有的测量数据进行SPSS 19.0统计软件。学生的 - - - - - -测试和单向方差分析被用来比较两个或两个以上的组。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

苏木精和伊红染色,从小鼠皮肤和组织显微照片对照组和治疗组:DMBA / TPA和DMBA / OTA。箭头在组织增生是肿瘤发生率的展示后24周的研究。表皮层中的扩散显然是在治疗组(DMBA / TPA和DMBA / OTA)。鳞状细胞癌显然是在治疗组,而与正常对照组正常组织学剖面层。增生也指出在治疗组中明显表现出促进肿瘤在治疗组(图1)。

可见肿瘤被发现在DMBA /霉菌毒素赭曲霉素治疗和DMBA / TPA治疗结束时(图24周研究2)。然而,在对照组中,几乎没有肿瘤。

表皮在所有控制和组织病理学观察到治疗组动物。可见退化和扩散在皮肤层指出DMBA /霉菌毒素赭曲霉素治疗和DMBA / TPA治疗与对照组相比结果(图3)。

疣状进行所有组的老鼠。老鼠注射BrdU注射然后牺牲后4天的实验。石蜡部分为BrdU染色和分析(图4(一))。同样,增殖、凋亡和细胞死亡的帮助下分析了生物标志物;因此,半胱天冬酶、GFAP和DAPI疣也执行(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。

ODC活性测定,(¹⁴鸟氨酸作为衬底。 对照组(图5)。

一个依赖于时间的分析是由应用OTA局部(³H]胸苷对小鼠皮肤的DNA。皮肤被从车辆和在线旅行社(100 nmol /鼠标)治疗小鼠24小时和48小时。(³H]胸苷是对前2小时杀死老鼠注射放射性测量的表皮DNA c.p.m. /μg DNA(图6)。

在线旅行社的影响对cox - 2和表皮层的细胞周期蛋白D1蛋白表达小鼠进行评估。动物牺牲,cox - 2和细胞周期蛋白D1蛋白表达测定通过表皮蛋白溶菌产物在免疫印迹(图7)。

皮肤肿瘤的评价后应用DMBA / TPA和DMBA / OTA白化小鼠后每周TPA / OTA的应用也显示。肿瘤的总数记录每周(图8)。

5.0的影响μM OTA决心EGFR磷酸化和Akt在初级鼠角质细胞免疫印迹(图9)的帮助下anti-p-EGFR和anti-p-Akt抗体。反β肌动蛋白是用来检查加载这些墨迹。

4所示。讨论

蛋白表达的细胞周期蛋白D1和cox - 2修改了OTA管理局在老鼠的皮肤(数字1和3)。细胞周期蛋白D1和cox - 2是著名的标记肿瘤细胞增殖和促进,分别。因此,局部应用100 nmol /鼠标OTA, cox - 2的表达和细胞周期蛋白D1蛋白被西方墨点法评估。大量的细胞周期蛋白D1蛋白进行靶向治疗和cox - 2真皮表达是注意到在72小时的实验(图7)。

肿瘤的促进作用,诱导细胞增殖是在老鼠的皮肤。局部应用的DMBA诱发肿瘤也跟着旅行社申请皮肤癌的发展(腹泻)(图2)。增生显然是在组织病理学分析同一治疗组(图1)。肿瘤中突出了DMBA / TPA-treated组后16周和DMBA / OTA-treated组20周后的应用程序。

EGFR(表皮生长因子受体)表皮生长因子的结合位点。在对照组,表皮生长因子受体导致扩散和监管收到从各种生长因子刺激的冲动。因此,在线旅行社应用激活表皮生长因子受体的影响也进行了分析。5.0在治疗角化细胞μM OTA, p-EGFR水平升高。因此,调节细胞增殖的刺激产生是由于OTA(图9)。

许多标记已确定像鸟氨酸脱羧酶活动增加,促进皮肤肿瘤增生,DNA合成增加。增加角质细胞增殖、增生和炎症是一些重要的因素导致皮肤肿瘤的发展和进展。在这项研究中,我们观察到在线旅行社的作用对小鼠皮肤ODC评估活动,皮肤增生,增生、肿瘤生成的数量,等。发现场外活动增加的响应生长因子也像TPA的肿瘤促进剂。

cox - 2的表达和细胞周期蛋白D1蛋白增加小鼠的表皮中OTA治疗后评估在这项研究中,以获得他们的参与肿瘤生成的意义,增殖,开发和发展在其他组织和皮肤。过度的细胞周期蛋白D1蛋白与细胞周期调控;因此,很明显它会导致肿瘤的转换。cox - 2是一个重要的标记的肿瘤促进也刺激前列腺素E2的形成。在一个研究中,据报道,皮肤在COX-2-deficient致癌作用显著降低了80%,细胞周期蛋白D1-deficient老鼠(19]。

5。结论

总之,研究发现强有力的证据表明,OTA诱发皮肤肿瘤的扩散是一个至关重要的因素促进表皮生长因子受体的激活,细胞周期蛋白D1, cox - 2的基因。这些结果将有助于人类造成的风险评估,从而预防肿瘤促进设计策略。

数据可用性

数据共享不适用本文没有生成数据集或在当前的研究分析。

伦理批准

这是伦理委员会的皮肤病医院,南方医科大学。

的利益冲突

没有利益冲突,金融或否则,由作者声明。

作者的贡献

作者参与本研究的贡献如下:同意负责所有方面的工作在确保问题相关工作的准确性或完整性是适当的调查和解决:杨赛、押加温;实质性贡献概念和设计、数据采集和数据分析和解释:杨赛、押加温;并起草文章或极度修改重要的知识内容:杨赛、押加温家宝。