文摘

背景。修改(N)6-methyladenosine (m6A)和m RNA6需要一个监管因素在癌症发展。米的贡献6及其蚀变在食管鳞状细胞癌(ESCC)仍不清楚。结果。ALKBH5低ESCC组织中表达,总m6水平是增加ESCC组织比正常健康组织的演讲。pcDNA3.1-ALKBH5重组质粒转染到kyse - 150和eca - 109细胞。ALKBH5负责的超表达显著减少总额的m6eca - 109和KYSE150细胞水平,抑制增殖能力,迁移,细胞入侵。结论。ALKBH5 demethylase低表达在癌症恶化的ESCC ESCC进展和作为一个重要组成部分。

1。背景

食道癌(EC)居全球癌症发病率和第六第七引起癌症的死亡率,在全球范围内(1]。两个主要的病理条件EC的鳞状细胞癌(ESCC)或皮肤癌和腺癌(EAC)或远端食道癌,具有明显不同的风险因素,地理分布和治疗策略。在中国,电子商务占大多数的癌症死亡率,其中ESCC是最主要的亚型(80%)(2]。中国ESCC病例占全球的一半的负担ESCC患者和90%以上的亚洲的(3]。病人通常诊断为先进的(4]。目前,存活率ESCC情况下仍然很低(5]。

N6-Methyladenosine (m6)被称为一个修改的RNA在哺乳动物6]。米6是由复杂的编辑的甲基转移酶(“作家”METTL3 / METTL14 / WTAP / RBM15 / ZC3H1 / KIAA1429)和通过demethylase(“橡皮擦,“ALKBH5和FTO)。“读者”(YTHDF1/2/3 YTHDC1/2 HNRNPA2 / B1, HNRNPC, HNRNPG, eIF3, IGF2BP1/2/3,和Prrc2a)能选择性地识别m6修改后的RNA和执行特定的生物功能。修改的6启动RNA代谢,包括RNA降解、运输、定位,和翻译(7,8]。

许等人构建一个预后标志由HNRNPC ALKBH5,预后标志的发展可以作为一个独立的预后标记(9]。此外,郭等人确定EC患者的预后特征包括ALKBH5和HNRNPA2B1 [10]。

在这项研究中,我们将明确的功能ALKBH5 ESCC的恶性增长和入侵细胞在体外。

2。结果

2.1。ALKBH5 ESCC低表达

首先,基因表达的演讲ALKBH5测量在23个ESCC组织样本使用中存在和包含IHC。图1(一)显示的相对mRNA水平ALKBH5低ESCC组织中表达,也就是说, 。包含IHC的结果表明,ALKBH5丰富的蛋白表达在正常食管组织(图1 (b))。然而,ALKBH5蛋白的基因表达显著降低ESCC组织(数字1 (b)和1 (c))。数据统计起诉,ALKBH5高度表示在78.26%(18/23)的正常和健康的食管组织,但只有39.13%(9/23)的中高度表达ESCC患者的组织(图1 (c), )。补充说,m6一个水平ESCC被ELISA检测(图1 (d))。总美元6在ESCC水平高于正常食管组织(图1 (d), )。总之,有一个总m的显著增加6ESCC组织水平和ALKBH5的表达与正常食管组织相比明显减少。

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图1
ALKBH5 ESCC组织低表达。信使rna (a)和蛋白质(b)的表达ALKBH5 23对ESCC和使用中存在和包含IHC邻近正常组织样本。(c)包含IHC的数据统计。(d)总m6由ELISA ESCC和正常组织。(e) ALKBH5蛋白质明显在eca - 109和KYSE150 pcDNA3.1-ALKBH5质粒的转染后细胞(OE)。NC:消极的控制。 。
2.2。由ALKBH5 ESCC细胞的增殖抑制作用

pcDNA3.1-ALKBH5质粒转染到ESCC细胞(OE),和function-gain实验进行。见图1 (e)明显,ALKBH5在eca - 109和KYSE150 pcDNA3.1-ALKBH5质粒的转染后细胞( )。此外,过度的ALKBH5显著降低总m6水平(数据2(一个)和2 (b))。关于ESCC细胞及其扩散,CCK-8(图2 (c))和克隆形成(图2 (d))分析表明,ALKBH5抑制ESCC细胞增殖及其增长。

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图2
ALKBH5抑制ESCC细胞增殖。总美元6eca - 109水平,与pcDNA3.1-ALKBH5 KYSE150细胞转染质粒(OE)点状化验(A)和ELISA (b)。eca的扩散和增长- 109与pcDNA3.1-ALKBH5 KYSE150细胞转染质粒(OE) CCK-8 (c)和集落形成(d)分析。NC:消极的控制。 。
2.3。由ALKBH5 ESCC细胞的凋亡诱导

负责细胞凋亡信号调节肿瘤细胞的增殖。因此,ALKBH5的影响过度凋亡的信号的eca - 109和KYSE150细胞检测。流式细胞术表明ALKBH5过度后,凋亡细胞比例显著增加,伯灵顿表达式和裂解caspase3增加,和Bcl2表达式(数字有所下降3(一个)和3 (b))。总之,ALKBH5超表达在ESCC细胞诱导凋亡信号。

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图3
ALKBH5诱发ESCC细胞凋亡。(一)流式细胞术检测细胞凋亡的eca - 109与pcDNA3.1-ALKBH5 KYSE150细胞转染质粒(OE)。(b)的表达apoptosis-related蛋白质免疫印迹。NC:消极的控制。 。
2.4。运动性抑制ESCC ALKBH5细胞

迁移和入侵eca - 109与pcDNA3.1-ALKBH5 KYSE150细胞转染质粒是解释说。如图4(一),入侵细胞的数量与pcDNA3.1-ALKBH5转染质粒都明显减少。此外,ALKBH5显著降低迁移细胞的超表达数字ESCC细胞(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。

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图4
ALKBH5抑制ESCC细胞迁移和入侵。入侵(a)和迁移(罪犯)的eca - 109与pcDNA3.1-ALKBH5 KYSE150细胞转染质粒(OE) transwell和伤口愈合化验。NC:消极的控制。 。

3所示。讨论

米6修改和RNA m6监管因素导致癌症恶化。其中,某些m6监管因素被发现是ESCC的进展和预后显著相关。例如,METTL3 ESCC中高度表达,明显与病人预后[11]。此外,过度METL3促进增殖和入侵ESCC细胞(12]。张等人检测基因表达的比例6348年相关蛋白质ESCC组织利用ELISA和发现表情METTL3和METTL14 ESCC病理组织明显调节,而FTO的表达式和ALKBH5明显下调,而正常组织。这是符合我们的研究发现在23个ESCC组织样本使用RT-qPCR和包含IHC。本研究还发现总m6利用ELISA ESCC组织的水平。与m的表达水平一致6监管因素,m6一个水平ESCC组织显著增加。

然而,许等人分析161 EC的RNA转录组数据样本和11 TCGA正常组织样本数据库,并没有发现重要的微分表达式FTO和ALKBH59]。这个结果可能会影响到肿瘤组织样本的病理亚型或缺乏正常组织样本。然而,他们仍然发现预后信号组成的HNRNPC ALKBH5基于队列。此外,刘等人找到一个显著高表达的基因FTO ESCC组织微阵列(13]。ALKBH5, FTO的同系物14),使用m的FTO保持平衡的水平6在转录组(15]。这一结果似乎与我们的研究。然而,我们的研究未能发现FTO的表达水平和机制。

基因不同的米6一个修饰词基因可能是ESCC风险有关。的rs2416282 YTHDC2启动子被确定为风险明显与ESCC [16]。这种等位基因影响转录因子的结合。此外,推倒YTHDC2表达显著抑制ESCC细胞的增殖(16]。然而,徐TCGA等人的基因突变分析EC队列通过cBioPortal数据库(9]。结果表明,遗传变异的频率YTHDF1, ZC3H13, KIAA1429 7 - 8%,和最常见的变化是放大。其他调整因素的频率小于3%。他们认为这些监管的基因表达水平的变化因素并非由基因变化引起的。

此研究表明,利用质粒pcDNA3.1 ALKBH5蛋白过表达,发现ALKBH5有助于抑制癌症。我们的研究报告的贡献ALKBH5表达式来改变ESCC的人类细胞的生物学功能在体外。这些结果指出ALKBH5参与ESCC的恶性增长和积极响应。

4所示。结论

结束,ALKBH5 demethylase是低表达ESCC组织。ALKBH5调节总m6ESCC的水平细胞和贡献作为一个实体ESCC进展的关键。然而,我们没有探索ALKBH5同系物FTO的表达和作用,我们也没有披露的分子过程,调节ESCC ALKBH5表达的差别,对这些组织。

5。方法

5.1。病人和组织样本

本研究招募了23 ESCC患者诊断和接受手术切除,没有新辅助/辅助治疗。组织样本被切除后病理证实。

5.2。细胞培养和转染

kyse - 150和eca - 109细胞系被用于执行这项研究。选中这些细胞系细胞银行获得中国科学院。RPMI 1640媒介文化这些细胞系补充10%的边后卫。文化条件有限公司5%2和37°C。ALKBH5 cDNA synthesization执行和克隆到pcDNA3.1表达载体。随后,细胞转染重组质粒是由Lipofectamine 2000试剂。

5.3。RT-qPCR

从组织或细胞总RNA转染重组质粒提取24 h和合成的互补。GADPH是一个内部参考,ALKBH5的相对表达水平计算使用2——∆∆CT方法。

5.4。免疫组织化学染色分析(包含IHC)

组织样本formalin-fixed,石蜡包埋。石蜡样本制成组织切片的厚度。组织部门接受deparaffinization、补液和微波治疗。屏蔽后,组织部门是孵化ALKBH5抗体(ab195377 1: 500年,兔单克隆抗体,Abcam)和biotin-labeled二级抗体。染色是由增强的DAB显色装备,和组织部分脱水和固定。

每个部分的分数是积极的产品比例的染色细胞( )和染色强度评分( )。 分数包括0(< 5%,-),1(5 - 25%,偶尔的),2(25 - 50%,聚焦),和3(> 51%,分散)。 分数包括0(负面),1(弱),2(媒介),3(强)。得分高于3被认为是高ALKBH5的表情。

5.5。米总6水平检测

米总6检测水平进行衡量组织样本的总m6A水平或细胞转染重组质粒为24小时。ELISA, EpiQuik m6一个RNA甲基化定量酶联免疫试剂盒(p - 9005 - 96, Epigentek)使用。点污点分析,试剂盒试剂分离总RNA,信使RNA分离和浓缩的mRNA隔离系统Polyattract®(A-Z5300 A&D技术公司)。被暴露于紫外线7分钟后,信使rna与优化交联Amersham Hybond-N+膜。与PBST缓冲区,清洗后膜被5%的脱脂牛奶和anti-m孵化6抗体,合衬底的止动剂西方Chemilum用于染色(默克密理博)。

5.6。免疫印迹

蛋白质被里帕可溶性缓冲区和sds - page凝胶电泳用于分离蛋白质的乐队和最终的蛋白质乐队转移到PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭膜。随后,细胞膜是孵化与初级抗体和二级抗体。增强化学发光合衬底(Menlo Park, CA)被用于化学发光的可视化。

5.7。细胞增殖检测

CCK-8试验,2000细胞/被播种在96孔板。培养一段时间后,旧的媒介被删除,添加了一个新的媒介CCK-8试剂含有10%。的吸光度值每在波长450纳米测量与微型板块的帮助读者。执行集落形成试验,1000转染细胞提取和播种在每个微型板块6-well板,和细胞培养进行了长达两周。的克隆形成结晶紫沾0.1%。

5.8。流式细胞术检测

胰蛋白酶化的细胞是没有添加EDTA和resuspended执行 细胞/毫升绑定缓冲。FITC-Annexin Vπ被添加到细胞悬液。充分混合后,FACScan流式细胞分析仪系统(BD生物科学,圣何塞,加州)立即用于检测。

5.9。流动性分析

transwell化验,悬浮细胞在无血清培养基添加到参议院。执行后24小时的时间,固定的细胞;室的底部细胞存在膜,4%多聚甲醛用于细胞固定和结晶紫染料细胞染色。伤口愈合执行分析,创建了一个伤口的细胞单层细胞刮刀的帮助。脱落细胞进行的清洗与PBS。培养为一个指定的时间后,图片拍摄和伤口愈合率计算。

5.10。统计数据

数据用SPSS 20.0进行分析。学生的 - - - - - -测试和单向方差分析被用来测试组之间的差别。 被认为是具有统计学意义。

数据可用性

和/或使用的数据集进行分析本研究可从相应的作者有效的请求。

伦理批准

伦理委员会批准是来自河北北大学第一附属医院开展这项研究。

书面知情同意是获得所有的病人。

的利益冲突

没有利益冲突声明。

作者的贡献

所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项研究是由河北省的关键科学和技术研究项目在2021年。号码是20210831的资金。