文摘

许多研究已经表明,有很多环状RNA (circRNA)异常表达在骨肉瘤(OS),这个异常与骨肉瘤的发展。但目前尚不清楚什么circITGA7的操作系统和它做什么。在这项研究中,存在被用来检测circITGA7的表达,mir - 370, PIM1 mRNA在操作系统的组织和细胞。CCK-8试验是用来检测circITGA7对细胞增殖的影响。之后,transwell试验是用来检测细胞迁移和入侵。dual-luciferase记者化验证实的存在目标circITGA7和mir - 370之间的关系,和mir - 370和PIM1。我们发现circITGA7调节系统组织和细胞系。击倒circITGA7削弱了细胞的增殖和转移的能力。此外,我们发现mir - 370被circITGA7负监管,而PIM1正受它。功能试验验证circITGA7晋升OS进程通过抑制mir - 370和mir - 370操作系统通过PIM6增殖和迁移影响操作系统。 In summary, this study shows that circITGA7 promotes OS proliferation and metastasis via miR-370/PIM1.

1。背景

骨肉瘤(OS)是全球恶性肿瘤,发病率为0.2% (1]。然而,巨大的外科医生感兴趣的主题之一。骨肉瘤的特点之一是,它往往发生在青少年,代表一个双峰模式(2]。同时,骨肉瘤通常发生在远端股骨或胫骨近端3]。因为骨肉瘤没有癌前病变或原位癌,骨肉瘤的诊断,病变时,往往已经发生了恶性肿瘤(4]。因此,有必要进行早期诊断的研究和探索早期诊断的生物标志物和治疗5]。

分子标记的癌症筛查取决于是否有差异的分子癌症细胞和正常细胞之间的内容6]。甲胎蛋白,例如,是一种糖蛋白发现被表达在正常成人血清的含量非常低,但高浓度癌症样本(7]。同样,一些小分子,如环状RNA (circRNA),显示癌细胞和正常细胞之间的微分表达式。CircRNAs,通常产生在真核细胞中,参与细胞内各种细胞内新陈代谢的调节和微分表达式在各种肿瘤细胞(8]。例如,据王先生和李,circ_0067934基因高表达在人类非小细胞肺癌(NSCLC)。在体外实验中,抑制这个基因的表达可以显著减少非小细胞肺癌细胞的增殖和入侵(9]。同时,由于circRNA的环形结构,没有自由港口,不容易被核糖核酸外切酶降解,所以有不同的稳定和保护相比,线性RNA在细胞。因此,它被认为是一种很有前途的精密医学生物标记的肿瘤(8]。

之一的一类小分子与细胞代谢和过程密切相关的是microrna的(10]。microrna参与调节基因表达以各种方式(11]。例如,microrna的竞争性结合rna结合蛋白,从而阻止信使rna, rna结合蛋白的抑制,从而调节相关基因的表达(12]。此外,某些microrna可能退化当刺激特定的刺激因素,导致相关压抑的mrna的活化,从而调节相关基因的表达,以应对经济刺激因素(11]。同样,microrna可以作为致癌基因,或在某些情况下作为肿瘤抑制,扮演一个角色在癌症的发展13]。研究发现,mir - 223显示调节在转移性胃癌细胞。研究表明,转录因子twist-stimulated mir - 223会使表达EPB41L3转录后直接针对其3 - - - - - -nontranslation区域,从而提高nonmetastatic胃癌细胞的迁移和随后的入侵能力作为调节因子(14]。

CircITGA7小说环状RNA, ITGA7位于人类染色体12个问题。相关研究表明,circITGA7明显特异表达在多种人类癌症,直肠癌、甲状腺癌等。例如,先前的研究已经表明,circITGA7发现显著下调在结直肠癌(CRC),抑制CRC细胞的扩散和转移通过抑制Ras信号通路,促进转录ITGA7 [15]。同时,发现circITGA7还可以抑制扩散的CRC骗取mir - 3187 - 3 - p和增加ASXL1的表达。因此,circ-ITGA7可能是一个潜在的诊断的生物标志物和治疗目标CRC (16]。CircITGA7,调节甲状腺癌细胞,可以直接绑定到mir - 198,减少mir - 198的抑制作用在目标FGFR1的表达,调节TC细胞的转移和扩散,它可能是一个潜在的TC诊断或进展的标志(17]。然而,circITGA7在骨肉瘤中的作用尚不清楚。因此,本研究的重点是探讨骨肉瘤的潜在功能。

在这项研究中,circITGA7在骨肉瘤细胞的表达模式和circITGA7的角色在促进增殖,迁移和入侵检测骨肉瘤细胞。circITGA7机制的竞争性结合mir - 370来调节下游靶基因PIM1调查。我们的研究显示的潜力circITGA7 mir - 370 / PIM1轴作为筛查早期生物标志物,骨肉瘤的诊断、治疗和监测进展。

2。材料和方法

2.1。人类组织样本

相关的骨肉瘤组织和正常组织15骨肉瘤患者从安徽医科大学第三附属医院收集。研究期间是2010年1月至2018年1月。整个骨肉瘤样本来自15 OS患者和健康对照组。病人之前没有收到任何化疗,放疗、术前或其他辅助治疗。研究伦理委员会安徽医科大学第三附属医院批准的这项研究中,所有病人给他们书面知情同意在本研究中。

2.2。细胞系,细胞培养

人类OS细胞系(mg - 63,居屋,U2OS SW1353)从写明ATCC采购(马纳萨斯、美国)。细胞培养在37°C, 5%的公司₂孵化器使用rpmi - 1640中。10%的边后卫(BI、以色列),100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素作为补充剂在中。

2.3。RNA提取和存在

根据制造商的指示,从骨肉瘤组织/细胞总RNA是孤立的和相关的正常组织/细胞线使用试剂盒试剂。NanoDrop 2000 c(美国热科学)是用于RNA量化和质量检查。使用SYBR绿色PCR试剂盒(Vazyme,南京,中国),2μ总RNA是reverse-transcribed cDNA的g。随后,存在试验进行了使用QuantStudio™6 Flex(美国热费希尔)ABI 7500年根据公司的协议。引物参与本研究设计并从Sangon购买生物技术(上海,中国)。U6使用规范化的mRNA表达mir - 370,和mRNA的表达PIM1 GAPDH规范化。

2.4。细胞计数Kit-8扩散试验

细胞增殖试验是根据公司的协议CCK-8工具包(Dojindo实验室、日本)。总之,100年将近1000转染细胞μL是生长在每一个96孔板。表示时间点在图中,每个细胞治疗10μL CCK-8解决方案,随后在37°C孵化2小时。然后,Varioskan Flash多模读者mb - 580(希尔,中国)是用来测量光密度在450海里。每组五个复制使用的细胞。

2.5。Transwell迁移和入侵检测

在这个试验,transwell渗透支持了,聚碳酸酯膜是涂层与基底膜基质(美国康宁公司)(用于入侵检测)或无基底膜基质(迁移测试)。转染24小时后,上层的细胞被播种于100年μL serum-starved rpmi - 1640,然后600年μL中有10%的边后卫是添加到底层。48小时的潜伏期后,细胞的顶层transwell室和棉签擦拭,和甲醇被用来修复细胞低表面10分钟,随后,细胞被沾染了10μ克/毫升diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Solarbio、北京、中国)在室温下15分钟。200 x荧光倒置显微镜(Mshot中国)被用来拍摄和计算染色细胞在10个随机选择的字段。

2.6。Dual-Luciferase记者分析

大约5000个细胞被播种到每一个96孔板和随后cotransfected相关质粒和microrna的模仿或抑制剂。2000年Lipofectamine转染试剂使用。dual-luciferase记者经过48小时的孵化试验(美国Promega)是用来测量荧光素酶的活动。独立的测试都是一式三份。相对荧光素酶活性的标准化,renilla荧光素酶作为内部控制。设计并合成siRNAs RiboBio(广州、中国)如下:si-NC: 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ;si-circITGA7: 5 - - - - - -CCUAUAAUUGGAAGGACCUTT-3 。质粒的合成是RiboBio(广州)。

2.7。统计分析

结果显示为 。测量两组之间的差异,学生的 - - - - - -测试采用和单向方差分析被用来评估超过两组之间的差异。 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。CircITGA7调节在操作系统组织和细胞系

调查的功能circITGA7在骨肉瘤,起初,我们研究骨肉瘤组织和细胞系的表达。使用中存在分析,证明与正常组织相比,circITGA7的表达在骨肉瘤组织中显著增加(图1(一))。此外,circITGA7表达水平明显升高在两个操作系统细胞系(U2OS和SW1353)相对于正常的人类细胞系hFOB 1.19。因此,这两个细胞系被选为后续研究(图1 (b))。这些发现暗示circITGA7可以在OS发挥致癌作用。

3.2。CircITGA7促进OS细胞增殖、迁移和入侵体外

探讨circITGA7对OS细胞的生物功能的影响,我们使用核(si-circITGA7)沉默circITGA7表达式U2OS细胞和circITGA7水平降低了43%(图1 (c))。CCK-8化验是用来衡量其效果。它显示,击倒的circITGA7可以减弱SW1353和U2OS细胞的增殖能力(数据1 (d)和1 (e))。Transwell化验表明SW1353和U2OS细胞的侵入性和迁移功能被压制circITGA7(数字减毒2(一个)- - - - - -2 (d))。

3.3。CircITGA7可能上调PIM1 mir - 370的表达

它已经表明circRNAs可以作为竞争的rna结合microrna在胞质空间。我们评估绑定circITGA7和microrna之间使用在线生物信息学数据库(miRDB、miRTarbase和miRmap)。mir - 370被绑定为circITGA7网站证明了软件预测方法和mir - 370的表达在OS细胞SW1353 U2OS增加了2.5倍和4倍circITGA7击倒后,分别(图3 (c))。为了验证mir - 370之间的交互和circITGA7,野生型(wt)或突变体(狗)的目标网站mir - 370在circITGA7 pGL3质粒克隆。发现从dual-luciferase记者获得试验表明,mir - 370模拟大大降低了荧光素酶活动由野生型circITGA7 SW1353和U2OS细胞(数字3(一个)和3 (b))。但突变circITGA7并不影响mir - 370。此外,mir - 370 3的结合位点 - - - - - -UTR PIM1分析得到的。然后我们检查mir - 370之间的交互和PIM1 dual-luciferase记者试验(图3 (d))。PIM1表情显然是低SW1353细胞转染和mir - 370比细胞与其他处理组(图3 (e))。PIM1表达的进一步调查发现,反mir - 370的差别可能扭转对这些PIM1引起circITGA7击倒在OS细胞(图3 (f))。作为一个整体,我们的研究结果表明,circITGA7可以通过mir - 370上调PIM1表达式。

3.4。mir - 370逆转CircITGA7的效果

使用CCK-8和transwell化验,我们表明,mir - 370作为一个肿瘤抑制操作系统。结果表明,mir - 370超表达抑制U2OS细胞增殖和迁移(数据4(一)和4 (c));然而,mir - 370击倒在SW1353增强细胞增殖和迁移(数据4 (b)和4 (d))。

为了进一步探索circITGA7 / mir - 370轴的作用在操作系统中,反mir - 370被安排转染到circITGA7沉默SW1353细胞。CCK-8和transwell化验检查这种治疗对OS细胞增殖和转移的影响。在此基础上,它是发现SW1353细胞的扩散和转移抑制circITGA7,转染的差别将对这些反mir - 370可以部分逆转这种抑制作用(数字4 (e)- - - - - -4 (h))。

3.5。PMI1击倒的部分阻碍mir - 370抑制在OS细胞的影响

上述研究表明,PIM1 mir - 370的目标基因。为了继续深入调查的影响是否mir - 370 OS细胞的生理功能取决于PIM1表达式,我们使用核(si-PIM1)击倒PIM1在OS细胞转染与反mir - 370(数字4(我)和4 (j))。如图,推倒PIM1后,细胞增殖和转移SW1353和U2OS严重受阻。总之,circITGA7 OS细胞增殖和迁移的影响通过mir - 370 / PIM1轴。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,circITGA7骨肉瘤组织或细胞中表达明显高于相应的正常组织或细胞。在体外实验中,利用si-circlTGA7击倒circITGA7 SW1353和U2OS细胞。结果表明,circITGA7击倒大幅减少SW1353和U2OS细胞的增殖和检查骨肉瘤细胞的迁移和入侵。在骨肉瘤调查circITGA7的调控机制,我们发现circITGA7促进了骨肉瘤细胞的发展通过调节mir - 370 / PIM1轴。

CircRNAs缺乏自由3或5结束由于圆形结构,这使得传统的机制很难降解。这种结构特点导致很长的半衰期和细胞内稳定和circRNAs守恒。细胞内CircRNAs扮演多个角色,和一些调节基因的表达通过调节特定基因的mRNA表达(8]。其他circRNAs充当夹杂物。其他circRNAs可能结合转录因子参与肌肉发展或病毒转录。同样,circRNAs有不同的机制参与癌症的发展和进展(18]。首先,据报道,一个基因易位导致的生产一个新的circRNA,促进细胞转化,刺激细胞的活动,促进肿瘤发展和进展19]。某些circRNA差别第二,对这些基因的表达水平也会影响肿瘤恶化直接或间接(8]。已经发现过表达circITCH Wnt /减毒连环蛋白通路可能调节通过调节的活动miR-7和mir - 214抑制癌症的发展(20.]。最后,一些circRNAs肿瘤促进作用,及其upregulation可能导致癌症。据杨et al ., circAmotl1高度表达的肿瘤组织样本和相关癌症细胞系,可促进肿瘤细胞的增殖(21]。同样,在骨肉瘤circRNA也是一个监管的作用。例如,它已经发现,circrna - 0008717操作系统的发生和发展可以促进目标和竞争性抑制的监管影响mir - 203 (22]。的circRNA circITGA7研究本研究发现癌症细胞和正常细胞之间的微分表达式。这表明circITGA7可能参与肿瘤组织的开发和发展。

在这项研究中,我们主要讨论了circITGA7在操作系统的功能和机制。研究已经阐明,circITGA7的表达在骨肉瘤组织中显著低于paracancer组织。同样,circITGA7在骨肉瘤细胞系的表达水平也低于正常结直肠粘膜上皮细胞系FHC及其表达水平与操作系统相关的负面肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期。体外实验表明,circITGA7可以绑定到hsa - mir - 370 - 3 - p上调其目标基因NF1水平抑制Ras途径,进一步减少Ras蛋白水平和Erk的磷酸化水平和Akt,最后发挥作用在抑制骨肉瘤的生长和转移。有趣的是,之前的研究表明,circITGA7显著下调在结直肠癌(CRC),抑制CRC细胞的扩散和转移以各种方式(15,16]。我们的结果不同于以往的研究,circITGA7抑制CRC细胞。我们发现体外淘汰赛circITGA7基因的细胞株抑制骨肉瘤细胞的增殖,减少骨肉瘤细胞迁移和入侵的能力。一些研究表明,mir - 370的功能实现主要通过调节mir - 370的活动目标。例如,云冈等人发现mir - 370目标FoxM1在大广场功能作为一个肿瘤抑制细胞癌(LSCC) [23];张等人表明,microrna - 370肿瘤抑制作用通过瞄准FoxM1在急性髓系白血病(24]。

小分子核糖核酸是小不到30-nucleotide长非编码rna。然而,microrna扮演非常重要的角色在细胞的生命活动,影响细胞的各种生理和代谢活动,包括增殖、分化和凋亡[25]。有越来越多的证据表明,异常upregulation microrna的差别或对这些基因与多种人类肿瘤的发生和发展。例如,miRNA-29c抑制肺癌细胞的迁移和入侵26]。同样的,研究表明,mir - 370具有潜在的致癌效果通过直接针对PDHB基因促进黑色素瘤的发展(27]。研究表明,mir - 370抑制直接针对PIM1肝癌或肝细胞癌,和类似的结果被发现在食管鳞状细胞癌(ESCC) [28]。mir - 370阻碍直接针对PIM1细胞增殖和肿瘤生长。PIM1是丝氨酸/ threonine-specific激酶1参与肿瘤细胞的发展[29日]。PIM1是一种癌基因,可以促进结直肠癌(CRC)的生长和转移。它的表现和CRC的发展呈正相关,可以预测患者的预后CRC (30.]。PIM1明显在胆囊癌症(GBC)组织,及其表达水平与临床恶性肿瘤和不良预后呈正相关。PIM1是一种很有前途的治疗目标治疗人类GBC [31日]。三阴性乳腺癌(TNBCs)肿瘤细胞模型,PIM1表达式与几个涉及转录因子MYC基因转录信号。TNBC PIM1 malignant-cell-selective目标,PIM1抑制剂有可能用在敏化TNBC化疗所致凋亡细胞死亡(32]。我们的结果表明,circITGA7调节mir - 370的活动,从而影响PIM1的活动,这促进OS细胞的扩散和转移。

本研究仍存在一些局限性。首先,我们使用骨肉瘤组织样本的数量在研究小。其次,mir - 370的表达模式和预后价值和PIM1应进一步探索。因此,进一步的研究需要阐明mir - 370的潜在机制和PIM1骨肉瘤。

总之,在这项研究中,我们发现通过一系列的实验,circITGA7海绵可以作为竞争性抑制mir - 370的活动,调节骨肉瘤细胞的生理活动通过mir - 370 / PIM1,从而促进骨肉瘤细胞的发展。这提供了生物标志物的可能性早期筛查、诊断、以及后来的治疗监测的操作系统。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Chuanwu方参与研究设计、数据收集、统计分析、数据解释,手稿准备、文献检索和集资。王副主任参与数据收集、统计分析、数据解释,手稿准备,文献检索,集资。Dongliang郭和运行方处理研究设计、数据收集、数据解释,手稿准备,文献检索。朱停进行数据设计、文献检索和基金集合。