文摘
多能干细胞中表现出相似的形态、基因表达、生长特性、表观遗传修饰胚胎干细胞(ESCs)。然而,它仍然是有争议的,诱导多能干细胞的多能性(iPSC)远不如ESC, iPSC的分化能力和ESC也可以由转录组和表观遗传学。microrna在转录后的调控的基因表达和参与许多基本的细胞过程,可能揭示答案。在本文中,我们专注于识别隐藏的microrna和印迹基因在细胞多能性之间的关系。总在iPSC microrna的表达模式和ES细胞全面分析和与人类的印迹基因,显示全球的势函数在多能水平的照片。新CPA4-KLF14地区位于染色体同源片段(chs)在哺乳动物和包括印迹基因和显著表达microrna是首次发现。分子网络分析显示,基因与基因密切和丰富模块如癌症,肿瘤细胞死亡和生存,形态。这个印区域可能提供一个新的寻找那些感兴趣的细胞多能性hiPSCs和为。
1。背景
未分化的胚胎干细胞(ESCs)分享自我更新能力和分化成各种不同的血统,这是了解人类发展的基础,组织再生,和健康的自我平衡的营业额1,2]。已经证明,只有通过添加一些因素,定义多能干细胞可以直接生成从成纤维细胞培养3,4),表现出类似的形态、基因表达、生长性能和表观遗传修饰的ESCs [5,6]。睁开眼睛的重组技术对理解细胞发育机制分配特定的命运,也必将为我们提供不同的多能性水平的问题。诱导多能干细胞的多能性(iPSC) ESCs差得多,可以通过转录组分离和表观遗传学。最近的一些研究集中在识别隐藏的ES和万能的区别,试图打破阻碍进步的基础研究和临床应用7,8]。
小分子核糖核酸(microrna)是一类非编码RNA基因的产品是22元序列中扮演重要角色的规定翻译和退化的mrna通过碱基配对部分互补网站翻译地区(utr)的消息9]。microrna是强烈的调查来确定它们在细胞发育和发展作用的机制10- - - - - -12]。有研究报道,几个microrna表达多样化在iPSC hESC多能性有很大的影响(13,14]。有趣的是,通过分析小RNA的表达模式在iPSC Dlk1-Dio3地区大型集群的microrna以及印迹基因被发现在完全多能干细胞(8]。这个印基因组区域被发现压抑与部分的多能性细胞,和这一地区异常的沉默老鼠被发现诱导多能干细胞。哺乳动物基因组印记可能是interparental遗传造成的冲突控制maternal-dependent增长的后代15),被发现与人类行为和发育障碍以及各种各样的儿童和成人恶性肿瘤(16]。虽然印迹基因附近也发现差异表达microrna在为8,17),这些现象表明,microrna与印迹基因可能会影响早期发展。为了扫描microrna之间的关系和印迹基因在调节细胞多能性的水平,我们专注于在ESC和iPSC microrna的表达谱。microrna的星团附近发现了印迹基因在大多数染色体和一个压印区,我们认为可能影响为其多能性能力将讨论在接下来的段落。
2。结果与讨论
2.1。microrna的表达分析与多样化的多能细胞的水平
我们分析了一个microrna的表达数据集存储在地理数据库包括800 microrna从正常的人类皮肤成纤维细胞(NHDFs), hiPSCs,为其18(部分4)。线性模型(19)是实现为成对比较和hiPSCs NHDFs hiPSCs,分别为和NHDFs(图1(一)),Bioconductor Limma包的。标准化和统计分析后,174个microrna识别和两两比较之间的差异表达(罗斯福)(数据1 (b)和1 (c))和131 microrna显著监管hiPSCs和为其NHDFs相比,其中,79年至少有2倍改变被认为是细胞多能性直接相关,可能控制在个人发展进步(见补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/471076)。这些结果包含14问microRNA集群邻国DLK1-DIO3印区域以及那些microRNA在多能性,重组,和细胞命运感应(13,20.]。此外,40 microrna被发现显著监管hiPSCs略有(或为),为(或hiPSCs)与NHDFs相比。这些microrna可能影响多能性水平为其和hiPSCs之间。
(一)
(b)
(c)
看到这些差异表达microrna的生物功能,microrna的目标是预测检查他们是否与细胞多能性相关。米兰达(2010年版)(21)和TargetScan(6.2版本)22]列表结合形成一个十字路口的目标预测的两种算法,加强分析的可靠性。选择基因然后使用R集体进行路径分析包。丰富通路相关神经连接和突触可塑性,如轴突引导,长期势差,生成信号通路,和钙信号通路(补充表2)。结果也显示与致癌作用包括前列腺癌、胰腺癌,胰腺癌,直接关系到细胞的发展和扩散。去富集分析也进行补充表2所示。
2.2。与印迹基因差异表达microrna集群重叠区域
为了识别之间的关联131个差异表达microrna和印迹基因,PTMCluster算法(23)是用于查找统计上显著的microrna的集群(部分4)。12个差异表达集群包括65 microrna是位于染色体,这不同于483个基点的长度(染色体4)为111 mb(染色体1)。人类的印迹基因收集从Geneimprint网站(http://www.geneimprint.com/30)和完全落在或接近上述microrna的集群区域。证明差异表达microrna丰富附近印迹基因区域除了随机分散,排列测试(执行部分4)。1000套microrna与相同的数量差异表达microrna是随机生成和microrna的富集区域的每一组集群使用相同的算法。印迹基因的数量下降或接近每个随机集的microrna的集群,分别计算并与30印迹基因定位在差异表达microrna的集群。结果表明,差异表达microrna大大丰富了附近的印迹基因()。
然后,我们专注于染色体的microrna的浓缩区域1,5,6,7,9、14和16包括大部分的microrna(蓝色)和印迹基因(粉红色)(图2)。线表示两两交互作用,而虚线代表microrna的预测目标基因。白的基因预测的目标基因印迹基因。microrna - 143, microrna - 145, microrna - 146 a位于5号染色体基因基因具有相同的目标,这是一个Ras基因家族的成员位于染色体1。基因功能的一个重要因素在许多生物过程涉及细胞周期进展、分化、细胞增殖、细胞凋亡和细胞生存水平的Ras表达式(24- - - - - -26]。此外,基因已经通过不同的信号通路诱导肿瘤发生[27,28]。miRNA-7a、miRNA-7f miRNA-7d集群9号染色体上有相同的目标基因CPA4 / CASP8,原本认定为发起者半胱天冬酶和主要功能在细胞凋亡的死亡受体通路(29日,30.]。许多研究还探讨了caspase-8 nonapoptotic函数的意义及其机制(31日,32]。miRNA-29a、miRNA-29b-1 miRNA-29b-2集群7号染色体上有相同的目标基因最老成的/ PEG1,损失会导致宫内生长迟缓和异常的产妇(33]。两个CPA4和最高明的印迹基因,位于染色体上。此外,polyubiquitin基因哥伦比亚大学与许多目标间接和直接的互动。中断的哥伦比亚大学的绝对数量降低胚胎肝脏的造血干细胞(34)和胚胎致命性缺陷胎儿肝脏发育(35]。泛素也表现出各种功能的表型包括细胞发育和细胞周期进展(36,37]。
2.3。microrna印CPA4-KLF14地区编码与细胞多能性的水平
先前的研究已经显示Dlk1-Dio3地区哺乳动物将激活细胞多能性水平(8]。在这里,我们也找到一个类似的7号染色体上的印CPA4-KLF14区域编码microrna和印迹基因,我们认为这可能会影响细胞多能性的程度。在我们的结果中,大量的hsa-miR-29a和hsa-miR-29b减少,而hsa - mir - 593和hsa - mir - 182万能和为其超过NHDFs增加。尽管mir-29a / b hiPSCs和为减少,他们在为比hiPSCs进一步下跌。mir-29a / b的抑制可能提高细胞重编程效率,先前的研究已经显示(38]。距离的表达水平将直接影响细胞多能性的程度。这个地区还包括五印迹基因,CPA4,最高明的,MESTIT1 COPG2, KLF14。基因附近mir-29最高明的是预测的目标基因。此外,KLF14 KLF4一样的家庭,这是一个众所周知的转录因子,并将重置体细胞表观基因组在诱导多能干细胞生成(39]。同线性映射人类和其他哺乳动物之间构造,分别合并在一起(图3)。CPA4-KLF14地区位于染色体同源的基因组片段守恒的内容片段(chs)在小鼠(),大鼠()、牛()、狗(),和鸡肉()(见部分4和补充图1)。这部分地区的基因内容和顺序保存在进化过程中反映了重要功能microrna和印迹基因之间的关系和可能影响细胞的命运联系在一起。
2.4。差异表达microrna和印迹基因之间的相互作用
后查看全局属性之间的差异表达microrna每一对电池,我们检查了这11个microrna的细节改变显著则与ESCs表达水平是否会影响多能性程度。分子网络分析了使用异丙醇系统显示microrna的关系及其相关基因(图4)。基于拓扑中,这些差异表达microrna(蓝色)与印迹基因(红色)。疾病和功能分析表明,该网络是由基因主要集中哥伦比亚大学,TP53等模块的应用和丰富癌症、皮肤病和条件,有机体的发展、组织发展、细胞死亡和生存,肿瘤形态学(补充表3)。
有趣的是,哥伦比亚大学也集中在图2并强烈与几个印迹基因,如EGFL7 KBTBD3, CHMP2A, ZC3H12C。与此同时,应用和TP53与哥伦比亚大学以及其他印迹基因。P53是首次发现的直接抑制因子Nanog在制40]。同样,p53进一步证明功能在细胞凋亡和分化为(41,42),会使神经干细胞的增殖和自我更新和造血干细胞(43,44]。P53与mir - 100、miR-30c miR-23b, mir - 125 - 5 - p和mir - 199 b - 3 - p。应用编码细胞表面受体和跨膜前体蛋白β淀粉样蛋白,减少几个细胞信号通路相关的神经发生(45),抑制神经干细胞的增殖通过激活PI3K通路(46]。这些表明,印迹基因相互作用直接与多能性相关的基因。
这里,mir - 373, mir - 371 - 5 - p,和mir - 106 b显示相同的表达改变,但不同范围的hiPSCs和为其NHDFs相比,这表明这些microrna应该调节在某种程度上为维持细胞多能性的能力。研究报道,mmu - mir - 290 / hsa-mir-371/372/373集群滋养层干细胞中表达和功能在细胞自我更新47,48]。出于同样的原因,其他microrna可能支持细胞多能性不同的表达水平。与此同时,其他microrna所示网络连接与p53大多可能在维持细胞多能性工作。
3所示。结论
在这项研究中,我们检查了pluripotency-associated microrna的表达在人类的ESCs,万能,NHDFs和识别之间的显著相关性microrna在印迹基因区域集群。然后我们讨论的一个小区域7号染色体上,包括显著microrna表达以及四个印迹基因。编码的microrna在这个集群已经验证涉及细胞重编程和扩散和目标附近的印迹基因最高明的。尽管这种关系的意义,不知道这个印CPA4-KLF14区域位于内容守恒chs的哺乳动物,可能在转录调控和处理过程中发挥了重要的作用。同时,我们构建的交互网络之间的差异表达microrna印迹基因,发现那些microrna并与印迹基因直接或间接通过其他基因。无论分子功能,印CPA4-KLF14地区观察到我们的研究可能提供一个新的寻找那些有兴趣不同的多功能hiPSCs之间的水平和为。
4所示。方法
4.1。转录组概要分析
微阵列数据集GSE16654 1 NDF线5 iPSC线,和3 ESC线从地理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。每个样品有三个生物复制。如前所述(49从ndf),则生成异位表达的转录因子KLF4定义,OCT4、SOX2,和原癌基因,而为其获得人类胚胎内细胞团的。等各种万能资源virus-integrating万能,vector-free万能干细胞,protein-directed重编程细胞则显示类似的生物属性对人类的ESCs和属于同一类别的细胞则在我们的研究中。常规分析包括归一化和统计差异进行使用R包。差异表达microrna被线性模型确定两两之间的细胞类型。
4.2。识别基因集群区域
PTMCluster [23)是最早发现统计上显著的天车网站集群使用位置距离树在相同的蛋白质。在这里,为了定义集群microrna的地区,我们调整算法和搜索microrna在染色体和表达的不同价值评估计算集群中的microrna是否足够近的空间随机分布, 在这里,是染色体的长度。microrna的数量在整个染色体。是邻居之间的最大距离microrna在集群区域。是集群中的差异表达microrna的数量。重要的集群地区将被选中,如果它满足价值和网站数量达标作为工具推荐(;)。
4.3。排列测试
找到那些microrna和印迹基因之间的物理位置,从Geneimprint收集所有印迹基因(http://www.geneimprint.com/)。我们扫描总210人类印迹基因在染色体,发现30下降或附近(最多6 Mbp)我们12个microrna的集群。排列测试被执行验证印迹基因是否丰富附近其他比多能性相关的microrna附近随机出现。在该测试中,1000套的microrna的数量差异表达microrna是随机选择从800年microrna在概要文件。每组的microrna被集群PTMCluster算法和印迹基因的数量下降或附近的microrna的集群每个随机集,分别计算了相同的标准。测试只有37置换测试(1000)30多个印迹基因,或附近的microrna的集群,这表明印迹基因差异表达附近富集microrna的集群在我们的研究()。
4.4。分子网络分析
目标基因通过米兰达(已知的microrna的预测http://www.microrna.org/microrna/home.do)和TargetScan (http://www.targetscan.org/)。十字路口的一部分结果被认为是目标microrna基因。创新路径分析(IPA)系统(智慧系统,http://www.ingenuity.com/)是用于浓缩和疾病分子网络模块。它收集数据从多个层次和各种实验平台提供了一个全面的通路资源,包括信息从文学、基因表达、基因注释。确切概率法确定实施疾病或功能模块是否富含感兴趣的基因。音标帮助我们提供洞察分子和化学相互作用,细胞显型,和疾病进程自己的感兴趣的分子和结构相关的多功能网络。
4.5。同线性地图建设
我们使用CHSMiner [50]构造同线性映射为人类和其他哺乳动物。它检测到CHS两个基因组之间基于共同的孤单,让每一对CHS基因内容给定的概率值来反映CHS是两个独立和随机下令基因组中观察到。chs包括CPA4-KLF14之间的地区人类和老鼠,老鼠,牛,狗,鸡被确定,分别补充图1所示。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Liyun唐元,晓燕参与研究的设计和执行统计分析。Binyan张先生执行同线性分析和疾病的浓缩。Guohui丁研究的构思,参与其设计,帮助起草。所有作者阅读和批准。
确认
这项研究支持由国家高科技研发项目(863)(2009 aa02z304 2012 aa020404),国家重点基础研究计划(973)(2011年2006 cb910705 2010 cb529206, cba00801),中科院研究项目(kscx2 - yw - r - 112, kscx2 - yw - r - 190,和2011 kip204),中国国家自然科学基金(30900272)和SA-SIBS奖学金计划。