文摘

生物钟调节生理过程中起着举足轻重的作用,被牵连,直接或间接地在各种病理状态包括癌症。这里我们研究生物钟是由外部线索如携入的光线。使用斑马鱼细胞系,结合光脉冲的实验与仿真工作集中在同步的作用效果,我们发现,即使是非常温和的曝光剂量足以引发一些夹带,即更高的光强度或持续时间与强度的生理信号。此外,我们观察到的模拟随机效应可能被认为是一个基本特征的生物钟来解释生理信号衰减在漫长的黑暗,以及光了再同步夹带的作为一个强大的组成部分。

1。介绍

在进化过程中是连续的争夺适者生存,预测循环环境波动的能力已经成为一个强大的工具和巨大的选择优势,允许生物调整自己的行为和生物过程预期未来的机遇和挑战。它可能不是令人惊讶的,大多数生活实体,从人类1)生物蓝藻(2),利用日常计时机制,也称为生物钟。然而,这些系统通常比简单的小时钟,更多方面的特色,例如,能够适应不同的日光跨度(光周期),这样做甚至可以兼作一个有用的季节性计时器。

传统上,时间的重要性通常被认为是在行为层面上,例如,寻求不同的方式更高的生物结构日常或季节性行为符合一个内在的“时间”的感觉:花光或同步他们的盛开的时间天,更很少,夜间小时,夜间啮齿动物感知当回到安全的洞穴在黎明前的时间,或候鸟准时开始了他们的年度全球旅行。我们中的许多人也很熟悉的经验醒来只是前几分钟的闹钟,或者有一个好的感觉当我们平时吃饭的时候来到我的身边。也在这个水平,研究开始关注从治疗角度生物钟专心地,例如,在慢性睡眠障碍,或时差唤起现代旅游的手段。洲际航班,可能使我们从根本上反对时区在几小时内已经证明我们很一般的灵活性,但也明显的延迟,我们的生理节奏调整这些激进的扰动。

一样迷人的潜意识和理性的例程之间的互动与我们内心的计时器,它也是值得记住的是,存在另一个更深层次的昼夜节律。事实上,在许多生物体功能,规定,和适应的生理时间是在细胞水平上的影响,当然也包括所有生物钟在单细胞生物;但也有更复杂的生物甚至是脊椎动物,比如斑马鱼,没有中央起搏器已被确认,而许多细胞和组织包含自主生物钟(3,4]。在许多其他物种,一个中央昼夜起搏器已被确定在离散的地区或接近大脑视叶等果蝇或者是哺乳动物的下丘脑视交叉上核(SCN) (5),然而生理信号仍然密切结合细胞过程。此外,在人类,例如,最近的研究已经明确表示,不存在只有一个中央集权的生物钟,但此外自激振荡在几个全身组织(6]。这些被称为外围振荡器和似乎控制当地有节奏的事件(7]。

推测这些不同层次的生理调节起着至关重要的作用在控制分子的过程中,沟通,和单个细胞的生命周期,它是已知的,例如,有丝分裂的关键过程,或细胞分裂,严格限制在某些关键检查点,如从G2过渡到M和G1和所谓的中期检查点(8]。这种观察到的行为的一个基本原因可能是减少暴露脆弱的DNA各州的破坏性影响紫外线辐射的太阳光线和协调损伤修复功能的影响。观察等前面的人当然也极为相关开发新的诊断和治疗方法。不仅可以了解生物钟的确切作用时间和调节至关重要的细胞过程提供见解的中断状态癌细胞,但此外这些知识可能也容易和显著提高治疗过程的结果。例如,在几个模型表明,通过不同的时间管理的化疗,结果显著提高(9,10]。然而,即使这一观点,可能只有众所周知的冰山一角,最近的研究也揭示了影响生物钟的一系列的病理状态。这个宽度可能包括病例,妥协的生物钟的分子基础直接构成或导致了健康问题,其他的生物钟可能间接影响,或那些情况下,其对生理过程的周期性影响可能只是用于调整治疗方案。

一个基本研究领域需要特别注意的是,外部的刺激可能相互作用,调整我们的内心的计时器。即使物种生活在已知常数黑暗拥有生物钟,和整个各种各样的潜在环境因素已被确定包括喂养和潮汐的节奏,最突出和重要的监管机构仍暴露于阳光。即使没有光的输入,昼夜节律钟之前振荡节律周期通常接近24小时,这称为自由运行期间和特定于每个物种。在自然界中,然而,时钟是由光的输入习惯携入的24小时的日常节奏。在这种情况下,它是非常有趣的注意,在许多物种的整体信号强度生物钟也容易降低在缺乏正常光/暗周期。然而,它已经表明,单个振子继续运作,但会随着时间越来越使失调(11]。反过来,这表明主要的光只乘火车生物钟可能变得明显在考虑同步效应细胞群的水平。

本文报告努力阐明这些复杂交互通过调查特别是对同步信号的敏感性。采用对偶方法,数学模型的斑马鱼生物钟关键分子组件和各自的交互是构建和扩展捕捉自然去同步化的动力学的影响随着时间的推移和再同步。从这个鼓舞人心的关键行为框架从实验室实验与结果进行对比,在光脉冲的影响斑马鱼细胞测量不同步的人群。

2。材料和方法

2.1。斑马鱼的生物钟

斑马鱼模型不仅被认为是一个重要的脊椎动物物种一般来说,也是一个特别有趣的候选人的背景下研究生物钟和轻雾沫特别是[12]。的主要原因之一在于他们展示几个相似的哺乳动物生物钟化妆,但没有中央昼夜起搏器被发现在斑马鱼,计时看似在细胞水平上的影响。这可以工作人口斑马鱼的细胞系同时限制扭曲由于集中的耦合干扰,等等,就像在很多其他脊椎动物。此外,众所周知,单个细胞非常光敏感,具备直接夹带通路包括光色素(13- - - - - -15),允许一个强大的夹带作用由于曝光。此外,最近的研究也指出,许多其他方面的细胞生物学在斑马鱼受光照影响基因表达(16]。

观察生物振荡器一般来说,负面反馈是至关重要的,确保了网络是回到了起点,而足够的延迟保证反应不稳定在一个稳定的稳定状态。人们已经发现,振动是不可能在一个双组分负反馈循环但至少需要三个组件(17),因此分子反馈回路基于各种时钟基因已经被鉴定。现在也肯定nontranscriptional,转译后的机制,如蛋白质磷酸化。包括识别斑马鱼时钟基因时钟,Bmal,期,隐花色素基因(12]。还应该指出的是,斑马鱼时钟的特征之一是额外的副本的存在生物钟基因的关键。时钟的核心组件(参见图1)构成一个自动调整的反馈回路,时钟和Bmal1二聚化和激活的转录期(每)[18),隐花色素(哭)基因,进而抑制时钟/ Bmal1。此外,它表明Cry1a是调节了光和可以直接与特定区域的时钟(不是B)和Bmal1 (bHLH,不是B和c端域),阻止他们的能力形成一个活跃的二聚体和启动下游转录激活(19]。还有一个稳定反馈回路,Rev-Erbα和Rora基因被认为直接的节奏表达时钟和Bmal基因。

如上所述,在斑马鱼生物钟夹带主要发生在响应。接触触发光感受器,其耦合的信号途径,最后一组生物钟基因,即per2和cry1a。时钟还显示不同灵敏度重置信号;根据一天中不同的时间,光原因阶段进步和延迟或没有影响,因此这也重置的效率与水平Cry1aupregulation。它常常可以非常有用的文档变量反应相同的刺激在一天的不同时刻通过构造一个相位响应曲线(中华人民共和国),和斑马鱼的细胞株中华人民共和国显示最大的转变在主观的深夜,造成15小时的转变,在早期的主观天几乎没有相移。

2.2。实现一个数学模型

斑马鱼时钟的第一次迭代模型是基于两个联锁负面反馈循环。第一个由ClockBmal异质二聚体Per1,而第二个ClockBmal和特性Cry1a加上一个光输入Cry1a。五个常微分方程的方程如下: 的ClockBmal异质二聚体用ClkBmal,用Cry1a信使rna和蛋白质c1am和cry1a分别和Per1信使rna和蛋白质是用p1m和per1,分别。用于模拟给出的参数值表1。

解决这个系统数值的时候,发现稳定的振荡是容易实现的降解率Michaelian而不是线性衰减率和希尔系数4或更高的镇压ClockBmal Cry1a和Per1。这里,Michaelis-Menten动力学描述转换从基质到产品基于酶浓度通过可逆的形成一个es复杂,从这之后,产品的不可逆转的释放。希尔函数会改变反应的质量从一个正常的双曲反应更多的s形曲线和代表ultrasensitivity的一种形式。这个反应类型经常发生在信号通路,将在更小的范围内,唤起变化被认为是经济的细胞。数学,更广泛的协同将由希尔系数更高。

2.3。随机效应的重要性

尽管所有模型,从本质上讲,必定会简化真实世界的过程,它往往是一个复杂和苛刻的挑战到达一个合适的平衡,确保真实的表示和充足的预测能力一方面,和易于实现和一个足够“快速”的决议。一个方面,很多的关注近年来在这一领域是许多生物过程在本质上是随机的,与属性,可以在状态空间不同状态之间的随机移动。换句话说,脉动量和不确定物质分子的相互作用在微观层面产生噪声和随机事件,这经常藐视确定性模型的假设,即给定初始状态总是导致相同的状态在一个特定时间之后。

也非常值得关注的本质这吵闹并不局限于外在,而是发现即使克隆,即基因相同,细胞表现出明显的偏离在RNA和蛋白质含量(11]。从这之后,它已经成为了一个重要的角色明显落在固有噪声(20.],无法控制和源于相关事件在启动子/ DNA结合事件的机会,mRNA转录和退化,翻译,以及蛋白质相互作用。为了理解这个观察,它可以有助于记住基因只出现在一些(例如,一个或两个)复制和转录因子分子在成千上百的顺序。

此外,现在明白,噪音,而不是简单地作为一个不可避免的损害,甚至可以利用生物;例如,在双稳态系统的细胞可以选择从两个表型甚至在统一的基因和周围环境促进适应变化的环境。在昼夜节律钟的情况下,还发现,在某些情况下的全局信号平均nonoscillating平级,单个细胞可能仍有功能振荡器,尽管广泛波动的峰值,从而“取消”彼此的信号(11]。为了研究随机行为的突出在斑马鱼生物钟的造型,模拟扩展是数值求解随机微分方程(SDE)噪声项驾驶随机漂移的物质浓度。

实现sd是基于ODE模型上面所描述的那样,但是最终的浓度在每一个时间步长受到噪声项,这里常数白噪声在维纳过程的基础。SDE的模型刺激在Matlab中实现使用“sde_euler”功能。应该注意的是,维纳过程非常复杂的数学和几乎无法区分,因此具体的规则必须设计来处理这种随机微积分,两个最广泛使用的版本被伊藤和Stratonovich随机微积分。在这里,使用Euler-Heun方法是利用Stratonovich类型。

2.4。光脉冲的实验

从上述理论模拟后,实验室实验调查暴露的同步效果斑马鱼细胞系人口在一个光脉冲,以及可能的阈值特别是这种同步,是利用生物发光分析进行的。

这些实验的period1-luciferase记者细胞株用于监测基因表达和昼夜振荡器的发展。合成转录激活时,荧光素酶的酶与底物荧光素,可以添加到培养基中,释放光生物发光的过程。这种生物科技可以系统地检测并测量每秒钟数(CPS)。虽然理论上也可以观察单个细胞水平,实验设置和生物荧光检测更具有挑战性的,作为一个单独的细胞产生光子(相对较少5]。因此,大多数生物荧光实验利用种群不同的细胞系,每人举着一个特定的时钟报告基因构造,因此让我们看看不同的转录活动与高时间分辨率。

在这个特殊的光脉冲实验中,现有的per1-luciferase使用斑马鱼细胞系和其创造的细节可以了(18]。的per1-luciferase细胞被镀一式四份的96孔板(约细胞每包含0.5毫米虫荧光素)在媒体。对于每一个光强度,使用一个单独的板块,板块被保存在一个黑暗的孵化器5天前的数据记录。当时光脉冲进行强度和持续时间显示数据。生物荧光监控在帕卡德TopCount NXT闪烁计数器。光脉冲,盘子被从帕卡德闪烁计数器和保持在一个黑暗的房间,直到光脉冲在所需的强度。

最后,在量化同步异步的细胞群,强度等措施振幅衰减或振幅脉冲后,基本趋势是移除数据集使用希尔伯特变换。这种趋势可能发生在生物荧光昼夜节律在培养细胞有几个原因和影响的定量分析。首先,细胞培养的反应不同的治疗方法是可变的和可能受到行踪不明的因素的影响。其次,细胞培养的节奏表现出阻尼(即。方差非平稳)。第三,这些节奏经常显示不稳定的基线(即转移。,mean nonstationarities) that changes from experiment to experiment, or even from sample to sample. The procedure to remove baseline drift that can mask the circadian rhythm is quite simple and involves subtracting a 24-hour moving average from the raw data.

3所示。结果与讨论

实验进行了如上所述的光脉冲持续时间15分钟,1小时光强度从1000到0.1不等μW厘米⁻²,短时间低强度选择确定的光量可能足以造成影响。光谱波长400 - 700纳米,假设一个波长520 nm范围的辐照度对应的光子通量0.0043 - 43μ摩尔米⁻²年代⁻¹。15分钟和小时实验的生物发光的痕迹中可以看到数据2和3,分别。

痕迹是使用24小时去趋势移动平均后的振幅光脉冲和衰变率测定使用希尔伯特变换。衰变速率和幅度分析的结果图中可以看到4。

这些数据表明,随着光脉冲的长度或强度增加,人口振荡幅度增加。在单细胞水平,斑马鱼细胞实际上保持振荡,甚至在黑暗中。缺乏振荡在人口层面都可以解释为一种desynchronous人口。光同步人口只有现在的振荡可以看到人口水平。

的衰变率的增加似乎更高的光强度和更长的光脉冲。可能是同步的人口越多,因此具有更大的个人选择振荡器被迫共同的阶段,越快同步状态没有夹带信号的衰减,作为单独的振荡器,并有很强的散度迅速离开这个州。然而,这方面的模型实验证明很难探索和比较单一细胞实验是昂贵的设置,特别是在所需的大规模验证个体变异的影响。像预期的那样由于更高层次的同步,振幅也会增加更高的光强度和更长的光脉冲。

考虑到光子刺激细胞的数量与光强成正比乘以时间,有趣的是,10μW厘米⁻²15分钟有一个较低的初始振幅比1μW厘米⁻²1小时,这意味着细胞不仅考虑光子的数量。为了检查如果光脉冲也有直接的影响,第一个完整周期的数据点被删除,再次分析,表明有趣的是原始之间的衰变率和“削减”数据非常相似;只有振幅小,正如所预期的那样。

取得以上提供的实验数据,我们试图复制模型中模拟可变相位响应的影响,即光可以提前或推迟的昼夜节律,或没有影响取决于光脉冲的具体时间,从而调整时钟异步人群共同的阶段(见图5比较的确定性和随机模拟)。实验装置是在硅片近似;即1000随机振荡器不同步的没有光和随后暴露于不同强度的光脉冲。由此产生的痕迹被发现在图6。

比较和对比在生物荧光测定实验中获得的结果和相应的模型模拟,看来重要行为方面已经被相对基本近似模型。当然,需要谨慎行事解释这些结果。尽管读数为每个单独的光脉冲运行是基于4个人井,似乎对应不同的痕迹,实验设计可能仍然受到扭曲。事实上,由于昼夜节律钟的信号衰减的本质在斑马鱼似乎是由随机漂移自由运转时间和由此产生的失调个人手机振子,很明显,这个随机性还透露自己在实验设置。想模拟运行时,反过来,它可以指出详细的检查,例如,山峰的时机对个人基质不对应于在文献中报道的(例如,Cry1a据报道,白天的峰值,但在模拟峰值结束的晚上)。这个令人费解的观察结果进一步突出了生物钟的复杂性,以及该模型在这个阶段捕获一组行为,而不是其他人的。

另一个结果出来,然而,事实是,没有确凿的或更高的下限同步效应检测范围的光强度。而似乎有一个相对恒定的光刺激的强度之间的关系和产生整体振幅的15分钟的光脉冲。小时脉冲,另一方面,有些水准似乎发生在更高的强度,这表明线性关系不再适用,可以推断出某种饱和的影响。这将是有趣的实验进一步探讨它在额外的强度和脉冲持续时间。看来曝光后振幅的变化可能是由于再同步异步个人振荡器,和在这种情况下,它可能是认为强脉冲成功协调单个振子的阶段更从平均水平。证实,然而,只有15分钟的光脉冲通常足以唤起一个明确的回应完全异步的细胞群。

4所示。结论

总之,这项研究的结果支持这个建议,个人之间的同步振荡器在细胞层次构成的重要组成部分产生一个稳定的生理信号。反过来,外部夹带的光似乎使这些振荡器,而随机影响让他们疏远。这个看似无害的观察实际上包含重要意义治疗癌症和其他疾病。不仅是重点之前,更好地理解这里的生物钟可能杠杆通过其强大的控制影响其他细胞过程;相反,也有更多的底层实现,这在循证医学的时代和它的关注明显减少确定性的理解“做A导致B”可能被忽略。即随机行为不仅是一个分心,也可能是一个基本组成部分的基本生理过程及其调节的功能。因此,它应该是一个重要的挑战对未来更好地理解和学会使用这种固有的变异性,也了解基本细胞生物学利用固有的随机噪声。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。