文摘

萨哈(suberoylanilide异羟肟酸或vorinostat)是第一个非选择性组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂通过美国食品和药物管理局(FDA)。萨哈影响染色质的组蛋白乙酰化作用和各种非组蛋白的底物,从而影响许多细胞过程。特别是,萨哈诱导肿瘤细胞的选择性凋亡,尽管机制还不是很清楚。一系列的微阵列实验最近进行调查肿瘤cell-selective proapoptotic转录反应引起的。基于基因表达时间序列,我们提出一个新的框架,详细分析肿瘤细胞有选择性地诱导细胞凋亡的机制。我们的分析表明,萨哈选择性地破坏DNA损伤反应,细胞周期,p53表达,和线粒体完整的肿瘤样本选择性诱导肿瘤细胞凋亡。我们的结果表明可能的监管网络。我们的研究扩展了现有的研究。

1。介绍

组蛋白乙酰化作用是由组蛋白乙酰转移酶(帽子),而组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac)平衡活动的帽子1]。HDAC活动管制在肿瘤细胞(2- - - - - -6]。HDAC抑制剂是强有力的抗增殖药物引起肿瘤cell-selective凋亡细胞和临床研究(7]。萨哈(suberoylanilide异羟肟酸或vorinostat)批准在2006年10月,美国食品和药物管理局作为第一个非选择性HDAC抑制剂治疗皮肤t细胞淋巴瘤(8]。萨哈影响染色质的组蛋白乙酰化作用和各种非组蛋白的底物,从而影响许多细胞过程(9]。特别是,萨哈cell-selective介导肿瘤细胞凋亡在时间和浓度的方式而使正常细胞相对安然无恙(10- - - - - -12]。然而,萨哈的机制目前不清楚。最近,博尔登等人研究了肿瘤cell-selective proapoptotic转录反应引起的萨哈使用时序基因表达谱(13]。超过4200个基因不同的回应萨哈在正常和转化细胞基因本体论(去)14)分析与大卫工具(15]。基因诱导程序性细胞死亡和凋亡程序在SAHA-treated转化细胞丰富。bcl - 2家族基因被确定为proapoptotic基因表达签名使用异丙醇工具(智慧系统,http://www.ingenuity.com/)。这些发现提供了新的见解的转录效应HDAC抑制剂在正常和转化细胞,表明特定的分子通路在肿瘤的细胞毒性萨哈的活动。然而,博尔登等人认为只有bcl - 2家族基因是肿瘤cell-selective proapoptotic萨哈的签名。一方面,太少的基因可能满足统计学意义的门槛,因为适度的差异信号相对于背景噪音。另一方面,通路分析基于不同表达基因可能无法检测到生物过程在整个网络包括代谢途径的基因,转录程序,和压力反应,因为个体的基因表达的变化有时是微妙的16]。在这项研究中,我们提出一个新的框架,详细调查的肿瘤细胞有选择性地诱导细胞凋亡的机制。通路在肿瘤和正常细胞基因表达的一致性水平萨哈处理系统使用一种改进的评估评分方法的上下文中预定义的路径和功能类别在基因和基因组的京都百科全书(KEGG) [17],BioCarta [18),(14]。通路基因表达的变化模式一致性(TVPC)时间序列研究。显著的基因表达谱和概要文件对使用干细胞丰富(短时间序列表达式矿工)软件(19]。我们的分析表明,萨哈选择性地破坏DNA损伤反应(DDR),细胞周期,p53表达,和线粒体完整的肿瘤样本选择性诱导肿瘤细胞凋亡。我们的结果表明可能的监管网络。我们的研究扩展了原始研究的博尔登等。

2。材料和方法

2.1。时序基因表达数据集

工作的博尔登et al .,时序微阵列实验正常(BJ)和转化细胞(BJ LTSTERas)决定基因表达与萨哈治疗(13]。全基因组表达谱测量了Affymetrix GeneChip HG-U133 + 2.0数组在4 h, 12小时和24小时时间点。基因表达数据可以从NCBI下载基因表达综合(GSE43010) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。我们的实验数据集进行进一步分析来自博尔登et al。

2.2。路径定义

好的注释基因集代表所有生物过程是有意义的和深刻的解释大规模基因组的关键数据。分子特征数据库(MSigDB)是一种最广泛使用的存储库的带注释的基因集参与生化途径(http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)[20.]。这三个数据集MSigDB v4.0: c2.cp.kegg.v4.0 (KEGG) c2.cp。biocarta (biocarta), c5.all.v4.0(去)是用于我们的通路基因分析。我们排除了少于15个基因的基因集或超过500个基因,因为小型或大型基因集可能会影响计算结果的准确性,根据GSEA(基因集富集分析)(16]。我们调查了1307个基因集的数据集(176年KEGG基因集,139年BioCarta基因集,和992年基因集)。

2.3。计算路径一致性的方法和意义

黄等人提出了评分方法(克鲁斯卡尔-沃利斯统计)的作用机制(农业部)分析基于相关系数的排名的萨哈内外基因表达谱的途径(21]。他们应用得分方法NCI60微阵列数据集(http://genome-www.stanford.edu/nci60/),发现通路基因表达一致性水平显著高于随机基因集,并证实基因表达在一个路径往往是coregulated和共享相似的表达模式22]。此外,他们发现了一个显著差异在通路基因表达之间的相干性肿瘤和正常细胞在抗肿瘤药物治疗(23]。我们应用评分法评估通路基因表达连贯性SAHA-treated肿瘤和正常样本。的分数是根据以下步骤来计算的。定义的任何途径途径设置(这里使用为例),任何基因对之间的皮尔逊相关系数计算。这些值被称为intrapathway值。然后,任何基因之间的皮尔逊相关系数和任何基因以外的途径在一组定义的路径计算。这些值被称为interpathway值。皮尔森相关系数()定义如下: 在哪里和一对基因和吗和平均基因表达值吗和在所有样品()。皮尔森相关系数(interpathway和intrapathway)是排名的真正价值。Intrapathway和interpathway值集被用作两个样本的数量来计算分数对于任何途径如下: 在哪里是样品的等级和人口;样本人口的大小吗;是样本人口的数量相比(在这项研究中);和。黄等人发现,当每一个样本人群包括至少5个观察,的抽样分布分数是一个近似的分布自由度(21]。确定他们的结论是否适合我们的研究,我们进行了以下实验。如果途径n基因,那么n基因从池中随机选择的m(20606个基因在我们的研究)和基因分数计算。这个过程重复了1000次为每个通路和随机的一部分分数比分数的实际途径被分配的通道一致性的价值。我们的研究结果表明,当一个通路包括至少15基因和不超过500个基因,明显有凝聚力的数量()通路不同略直接从获得的数量分布。因此,为了准确和方便,途径获得相干直接使用价值人口分布与1自由度(两个示例:和;等同分数> 3.84)。分配给一个负号如果intrapathway中等等级的分数值低于interpathway的排名值。因此,一个大的正数分数(> 3.84)显示高水平的基因表达中相干途径相比,一个随机的基因集。

2.4。计算方法为重要途径相干性的变化

来描述路径的变化一致性状态肿瘤与正常样本,我们定义两种变化状态:(特定的肿瘤样本的高相干但不是在正常样本),(具体高相干性在正常样本而不是肿瘤样本)。向上或向下的统计意义的变化途径相干计算如下。如果一组路径定义通路中的n基因,基因(随机路径)是由一组随机选择n基因池的总m基因(20606个基因在这项研究)。的分数随机通路与肿瘤和正常的基因表达谱进行了计算和比较。上下的比例随机路径共有1307名随机路径数。这个过程重复了1000次,背景分布的路径决定。的比例上升或下降的比例随机路径的比例大于实际的向上或向下通路被分配的值上下通道相干性的变化。在评估路径一致性的变化在每个时间点,共组24个样本是随机置换生成3随机肿瘤样本和随机正常样本。如上所述,随机路径是建立,分数的随机路径与基因表达谱在肿瘤和正常的样本是随机评估,和价值上升或下降的变化途径相干计算。

2.5。集群和时间序列表达的比较数据

安永等人提出了一个算法专门为聚类时间序列表达数据(24)和开发了基于web的程序对时序基因表达数据的分析19]。干细胞发现从时间序列表达数据统计上显著的模式并提出了视觉和互动的结果去解释。我们使用集群和比较时序基因表达数据源自SAHA-treated肿瘤和正常样本。首先,我们定义一组模型配置文件独立于数据代表不同的时间序列基因表达模式。识别重要的模型配置文件是基于超几何测试: 在哪里代表总数量的基因,是基因的数量在感兴趣的类别,表明基因的数量感兴趣的类别和分配给模型的兴趣,和是基因的数量分配给感兴趣的模型剖面。重要的模型配置文件被用来评估微分转录反应肿瘤和正常样本在不同时间点。接下来,我们确定了模型剖面对肿瘤和正常样本之间通过比较基因表达数据和搜索的交集的基因分配给两个不同的配置文件,一个正常的基因表达谱和其他的肿瘤基因表达谱。确定基因与一致的或不同的时间序列表达式模式集肿瘤与正常样本。概要文件的重要性对计算如下: 在哪里代表总数量的基因,和概要文件是基因的数量吗在正常样本,和概要文件是基因的数量吗在肿瘤样本和概要文件是基因的数量吗在正常样本和资料肿瘤样本。最后,我们应用富集分析去确定每个基因的生物学意义。与纠正价值被认为是重要的条件。

2.6。差异表达基因的识别和路径映射

微分与萨哈治疗肿瘤和正常样本的表达分析在不同时间点(0 h, 4 h、12 h和24 h)是使用GenMAPP执行软件版本2 (25]。比较,基因被认为如果叠化超过1.5和显著差异表达(以及)。基因显著调节肿瘤样本被定义为;显著调节基因在正常样本定义为。这些基因被用来解释是有时限的转录反应肿瘤的细胞毒性萨哈的活动。对于每一个时间点,差异表达基因映射到路径使用MAPPFinder工具(26]视觉描述如何萨哈不同调控基因通路之间的肿瘤和正常的样本在不同时间点。

3所示。结果与讨论

3.1。统计分析路径一致性的肿瘤和正常样本

通道一致性是基因表达的一致性以关联强度。基因的途径被认为是调节比随机路径更加协调的方式;因此,这些基因的表达模式预计将连贯。来测试这一假说是否适合SAHA-treated肿瘤和正常样本,我们计算所有定义分数值KEGG通路,BioCarta,走了。路径的详细结果分数分布表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/867289)。得分值的随机基因集(随机路径)与肿瘤和正常的基因表达谱也进行了评估。数据1(一)和1 (b)显示分布的得分值在KEGG定义的正确途径,BioCarta,去响应随机基因集。学生的测试进行了确定分数分布之间真正的通路和随机路径明显不同。计算结果的意思得分57.98中定义的路径KEGG, BioCarta 3.05, 38.07和20.95进行肿瘤基因表达谱和KEGG, BioCarta 2.39, 18.48去正常的基因表达谱。相应的随机路径都接近于0对肿瘤和正常的基因表达谱。这些差异显著(见图1)。

如果通道一致性可以被视为反映协调基因调控,然后水平的变化可以被视为一个通路调节的变化。我们检查了各个通路的程度改变了连贯性,通路的类型,以及他们是否实现了或多或少的样品相比,肿瘤样本一致性正常。使用相对一致性状态之间的肿瘤和正常样本,1307年定义通路路径集被分为四类:(1)持续高(凝聚力对正常和肿瘤样本(227年,17.4%));(2)(凝聚力只对肿瘤样本(296年,22.6%));(3)下(凝聚力仅为正常样本(114年,8.7%));和(4)一致的低(没有凝聚力的肿瘤或正常样本(670年,51.3%))。这一发现暗示大多数通路(连贯性)不变,而一些途径(显示显著改变相干当肿瘤和正常样本比较()。此外,上升通道的比例明显高于通路(分别为22.6%和8.7%;,确切概率法),这表明通路与肿瘤样本往往比正常的途径更连贯的样本。我们进一步分析了相干性的变化不同的功能类别中定义KEGG BioCarta。对于每一个类别,上下通道的数量相比,确切概率法确定如果发现差异具有统计学意义。在代谢通路被发现(29.2%比6.6%)和有机系统(28.6%比5.7%)类别与意义KEGG < 0.05水平。在细胞周期调控通路被发现(0%比55.6%)与重要性水平BioCarta < 0.05(表1)。格雷森等人报道,HDAC抑制剂改变mrna的表达模式和与细胞周期阻滞相关的蛋白质27]。我们的研究结果证实,通路与细胞周期相关的可能是重要的萨哈诱导肿瘤的凋亡反应。

统计分析的路径一致性在每个时间点进行肿瘤和正常样本。与上述结果相似,真正的通路被发现比随机基因集更连贯的时间点(0 h, 4 h、12 h和24 h)对肿瘤和正常样本(表2)。几个途径显示一致的相干时间序列对肿瘤和正常样本,如核糖体的类别结构成分和KEGG类别核糖体。然而,一些途径改变跨时间序列一致性状态。我们推测,这些途径可能参与SAHA-induced肿瘤特异性反应。我们发现667途径表现出一致性的变化时间序列对萨哈治疗后肿瘤样本。只有480通道显示正常样本的相干性的变化。这个结果表明,路径改变相干州肿瘤样本(分别为51.0%和36.7%;,确切概率法)。通过调查是有时限的上下通道,我们发现,大约30%的路径显示显著的一致性变化之间的肿瘤和正常样本在每个时间点。例如,DNA修复、细胞周期、p53和线粒体呼吸链途径显示肿瘤与正常样本之间的一致性变化在某个时间点。此外,上下比例的途径不同的时间序列。相比下降通道的比例上升途径明显高于0 h和24小时(0 h, 16.4%和13.2%;;24小时;20.0%和7.0%;,确切概率法)和低4 h(分别为9.2%和14.5%;,确切概率法),在12 h与无显著差异(分别为14.2%和16.2%;,确切概率法)。

3.2。通路相干时间序列变异模式的识别

如果1代表了一致性状态,0代表noncoherence状态在特定的时间点,TVPC模式0001代表一个通路与noncoherence 0 h, 4 h、12与相干h和24 h。我们的研究结果发现模式1000、0001、1001、0101年和1011年明显富集肿瘤样本和0000年模式,1100年、1110年和1111年明显丰富正常样本(,确切概率法)。我们建造256组合TVPC模式调查相关肿瘤和正常途径之间的一致性变化。模式为例,1111年和0000年代表高通路在肿瘤样本的相干性和低相干的途径在正常样本。的组合模式,43.6%(109/256)不包含任何途径,19.6%(50/256)包含只有一个途径,和12.5%(32/256)包含超过6通道。这些结果表明,大约80%的通路属于少数组合模式。因此,萨哈在肿瘤和正常细胞的影响不混乱,但组织和控制。基于广泛的组合之间的相关性的分析模式和路径功能,我们设计了一种分组策略,将所有组合模式分为五类:(1)没有回应萨哈(426通道内4模式);(2)一致的响应萨哈相同的变异模式对肿瘤和正常样本(26通路内8模式);(3)发散应对萨哈肿瘤和正常样本(240通道内88模式);(4)肿瘤特异性反应萨哈只肿瘤样本(401通道内22模式); and (5) normal specific response to SAHA for only normal samples (214 pathways within 25 patterns). Detailed descriptions of pathways belonging to each TVPC pattern and combination TVPC pattern are in Tables S2–S6. The no response and consistent response both related to fundamental biological functions. For example, the GO term structural constituent of ribosome and the KEGG term ribosome belonged to the no response category (1111 versus 1111), and the GO terms ribosome, organellar ribosome, and mitochondrial ribosome belonged to the consistent response category (0111 versus 0111). SAHA treatment had no effect on these pathways. In contrast, the combination patterns divergent response, tumor-specific response, and normal specific response involving DNA damage response, cell cycle, and mitochondrion integrity pathways might be involved in differential regulation between tumor and normal samples.

表S4(肿瘤特异性反应)表明,DNA代谢过程,去响应DNA损伤刺激和DNA修复和KEGG通路DNA复制和错配修复所有属于该模式1000和1111和DDR参与。这些结果表明,从0 h - 4 h,萨哈治疗肿瘤样本不可逆转地减少了相干DDR通路相关的基因表达。Bakkenist和凯斯坦报道,HDAC抑制剂激活DDR [28]。Groselj等人报道,HADC抑制剂radiosensitisers大影响DNA损伤和修复(29日]。罗伯特和Rassool HDAC抑制剂报道引发广泛的组蛋白乙酰化和DNA损伤和诱导细胞凋亡在肿瘤细胞(30.]。我们的研究结果表明,萨哈立即抑制DNA修复过程的早期阶段药物治疗,虽然没有影响正常样本。

表S5(正常的特定反应)表明,GO术语有丝分裂细胞周期检查点属于该模式在0000年和1100年的DNA完整性检查点和DNA损伤检查点属于该模式在0000年和0100年,GO术语细胞周期检查点属于0000年和1110年的模式。这些结果表明,通路与细胞周期检查点失去表达连贯性与萨哈治疗肿瘤样本。此外,表S6(发散响应)表明,细胞周期过程,细胞周期阶段,有丝分裂细胞周期,M阶段,有丝分裂细胞周期阶段,有丝分裂,主轴都属于0010 vesus 1110模式。萨哈治疗,细胞cycle-related通路显示是有时限的表达连贯性对肿瘤样本12 h,同时保持较高的一致性从0 h - 12 h正常样本。因此我们猜测,对于肿瘤样本,萨哈治疗导致DNA损伤积累和抑制细胞周期检查点。正确的细胞不能进入细胞周期,从而无法正确修复DNA损伤。

表S6(不同反应)表明,KEGG p53信号通路属于0101和0111和缺氧BioCarta p53通路模式属于1001年和0010年。激活p53密切相关的DNA损伤和细胞周期阻滞。洛伊等人报道,p53与DNA损伤程度(激活是线性相关31日]。除了研究作用在细胞周期检查点,p53通路在肿瘤细胞凋亡(32]。曹等人报道,抗氯碘羟喹HDAC抑制剂,导致p53的表达,从而导致白血病细胞凋亡和骨髓瘤细胞(33]。吴等人报道,p53介导减少bcl - 2的表达在人类肝癌HepG2细胞(34]。青山等人报道,激活p53表达增加伯灵顿但保持较低的bcl - 2的表达(35]。也从表S6(不同反应),细胞凋亡和细胞程序性死亡都属于1001年和0010年。萨哈治疗,apoptosis-related通路显示是有时限的表达连贯性在0 h和24小时的肿瘤样本。此外,表S4(肿瘤特异性响应)表明,线粒体相关通路完整性如线粒体膜、线粒体膜,线粒体内膜,线粒体呼吸链属于0001年和1111年的模式。这些发现表明,萨哈治疗导致形态和生理改变线粒体的完整性在肿瘤样本24小时。线粒体的完整性是维持prosurvival bcl - 2家族蛋白质,而proapoptotic BH3-only蛋白质功能的传感器细胞压力和激活内在细胞凋亡通路(36]。Rikiishi报道,HDAC抑制剂下调prosurvival bcl - 2这样的蛋白质和上调proapoptotic蛋白质如荡妇,贝克,伯灵顿(37]。因此,我们推测,萨哈治疗肿瘤样本,通过直接或间接的行动,激活p53通路,影响bcl - 2家族基因的表达和线粒体完整,导致肿瘤细胞凋亡。

3.3。时序基因表达数据的聚类分析

我们使用干细胞(19)集群时序基因表达数据。我们选择15预先制定表达谱代表各种基因表达模式在时间序列和重要的表达谱肿瘤和正常样本被识别。我们发现5概要(数字0、2、9、12和14)大大丰富了正常样本和5(数字0、2、5、12和14)大大丰富了肿瘤样本(图2)。档案数字0,2、12和14个肿瘤和正常样本之间共享。其中常见的概要文件,数字2和12是最重要的,他们代表了两种对映的基因表达模式。2号剖面显示,表达逐渐下降从0 h 24 h,而12号剖面显示逐步增加表达式从0 h 24 h(数字2(一个)和2 (b))。同样,数字0和14显示两个对映的基因表达模式。Profile 0数量下降表达式从0 h - 12 h和增加表达式从12 h 24小时;14号的表达式模式则相反。概要文件5号富集在肿瘤样本和9号被浓缩在正常样本。概要文件5号拒绝从0 h - 4 h,增加从4 h - 12 h,从12 h 24 h持平。概要文件9号从0 h增加到4 h和拒绝从4 h到24小时。基因的完整描述每个概要表S7-S16。例如,基因GATA和KLF属于2号12号和基因GLRX概要文件。Akada等人报道,表达叫KLF明显下调,萨哈治疗人类红白血病细胞(38]。格拉泽等人报道,萨哈GLRX产生基因表达的增加存在剂量依赖的相关性[39]。

3.4。对干细胞生物功能发现概要文件

使用干细胞的比较函数,我们提取10之间重要的配置文件对肿瘤和正常样本(19]。10概要对可分为三类:(1)不变(剖面内基因对肿瘤和正常样本显示相同的表达模式);(2)微调(基因在剖面对显示一个小差异表达谱在某个时间点之间的肿瘤和正常样本,例如,这个概要文件对数字0和2);(3)降级(基因在剖面对显示肿瘤之间的映在某个时间点的基因表达模式和正常样本,例如,这个概要文件对数字9和2)(图3)。简单地挖掘基因列表每个概要文件对不允许萨哈恐鸟的解释。一个受欢迎的方法来获得生物见解从一组识别基因是确定去过多的注释中基因集。因此,去为基因集富集分析进行了对应于每个概要文件。简要描述在每个概要对术语丰富的表3。一对走在每个条款的完整描述概要表S17-S19。

去条款相关蛋白质乙酰化修饰属于不变的形象对数字0到0,如蛋白质乙酰化作用,组蛋白乙酰化组蛋白乙酰转移酶的活动,和乙酰转移酶复杂的(表3)。萨哈的pan-inhibitor多种hdac和引发广泛的细胞乙酰化修饰水平(40]。我们的研究结果表明,萨哈治疗表达下调基因的表达与乙酰化改性从0 h - 12 h,然后移植这些基因从12 h 24 h。等此外,条款与核糖核苷三磷酸腺苷三磷酸核糖核苷代谢过程,核糖核苷三磷酸分解过程,和核糖核苷代谢过程被大大丰富了不变的概要对数字14和图14所示。这些术语表示化学反应和通路包括核糖核苷三磷酸腺苷。这些基本的生物功能相关的基因保持相同的表达谱在肿瘤和正常样本和可能不参与SAHA-induced肿瘤cell-selective凋亡反应。许多去术语DDR属于微调配置文件对相关数字2和0,如依赖DNA的DNA复制DNA代谢过程、DNA修复、细胞DNA损伤反应的刺激。我们的研究结果表明,萨哈治疗逐渐下调DDR-related基因从0 h 24小时正常样本和表达下调他们从0 h - 12 h,然后调节他们从12 h在肿瘤样本24小时。萨哈可能以不同的方式调节DDR-related基因,这证实了以前的观测。我们的结果反映了红衣主教DNA stability-maintaining机制在肿瘤和正常样本之间的区别对待萨哈导致下游通路的反应。去细胞周期相关条款属于降级剖面对数字9和2,等轴组织,细胞周期,有丝分裂,细胞周期的过程。 This indicated that SAHA treatment gradually downregulated cell cycle-related genes from 0 h to 24 h for tumor samples and upregulated these genes from 0 h to 4 h and then downregulated them from 4 h to 24 h for normal samples. STEM analysis indicated different effects of SAHA treatment on cell cycle-related pathways. The GO term mitochondrion belonged to the reversion profile pair numbers 12 and 5. SAHA treatment gradually upregulated genes related to mitochondria from 0 h to 24 h in normal samples and downregulated these genes from 0 h to 4 h and then upregulated them from 4 h to 24 h in tumor samples. Mitochondrial integrity is maintained by pro-survival Bcl-2 family proteins, while pro-apoptotic BH3-only proteins function as cellular stress sensors and activate the intrinsic apoptosis pathway [36]。因此,萨哈可能干扰线粒体的完整性,导致内在的细胞凋亡。总之,微调和降级剖面对DDR密切相关,细胞周期和线粒体完整性流程。我们建议萨哈不同监管DDR-related基因在肿瘤和正常样本和抑制细胞周期检查点功能在肿瘤样本,破坏线粒体的完整性,导致细胞凋亡。

3.5。确定肿瘤Cell-Selective Proapoptotic萨哈机制

TVPC和阀杆的结果分析表明,萨哈在DNA的伤害途径治疗诱导微分响应。我们研究了DNA的伤害基因的表达谱,发现,RAD9 PARP1, BRCA1, CHK1,相关(RAD53)和CHEK2 SAHA-treated的高表达的肿瘤样本。Broustas和利伯曼报道,几个基因包括RAD9 PARP1, BRCA1参与DDR和维持基因组稳定至关重要41]。RAD9编码一种适配器蛋白质与DNA损伤检查点特征函数的响应(42]。PARP1编码chromatin-associated酶,保利(ADP-ribosyl)转移酶,这是依赖于DNA和参与康复DNA损伤(43]。BRCA1基因编码核磷蛋白是重要的转录,DNA双链断裂的修复,和重组44]。Heideker等人报道,DDR激活依赖于对丝氨酸/苏氨酸激酶的活性如CHK1和相关(RAD53) [45]。CHEK2包含forkhead-associated蛋白质相互作用领域必不可少的激活来响应DNA损伤。域是复制块迅速磷酸化反应和DNA损伤(46]。基于上述pathway-scale gene-scale分析,我们推断萨哈治疗可能会导致各种形式的DNA损伤肿瘤样本,可以激活下游信号通路对DNA损伤的积累。在pathway-scale分析中,通过整合两个方面TVPC和阀杆的结果分析,我们推断萨哈治疗不同监管p53通路相关基因表达谱,细胞周期,线粒体的完整性和细胞凋亡(pathway-scale分析)。p53通路的核心信号通路介导这些内在细胞凋亡后生物过程之间的交互。因此,在gene-scale分析,我们进一步调查的相关基因p53的表达,细胞周期和细胞凋亡通路在肿瘤和正常样本。使用GenMAPP [26),我们确定为每个时间点的差异表达基因,绘制细胞周期和细胞凋亡通路。图4显示多个时间点的比较之间具有不同的基因表达的肿瘤和正常细胞周期通路中的样本。ATR没有不同的表达和ATM下调在12 h;p53在12 h调节肿瘤样本。P53是一种肿瘤抑制蛋白包含转录激活、DNA结合,和寡聚化域,应对不同的细胞压力来调节靶基因的表达,可以诱导细胞周期阻滞,DNA修复和细胞凋亡47]。ATM属于PI3 / PI4-kinase家人和调节各种各样的下游包括p53蛋白。ATM和密切相关的激酶ATR主控制器所需的细胞周期检查点通路细胞DNA损伤反应和基因组稳定(48,49]。然而,我们发现,ATR和ATM未激活,从而不启动激活p53肿瘤样本。Kotsinas等人报道,CDKN2A (ARF)介导激活p53的DDR轴除了ATM / ATR通路(50]。肿瘤抑制蛋白p53 ARF稳定,与E3 ubiquitin-protein交互连接酶MDM2、p53负责降解[51,52]。ARF一直高表达,MDM2表达下调后4 h(图4)。因此,东盟地区论坛和MDM2可能激活p53的主要原因之一12 h的萨哈治疗后肿瘤样本。我们进一步发现CCNE1(细胞周期素E1) CCNE2(细胞周期蛋白E2),和CDK2都调节,而CDKN1A P21和CDKN1B (P27)肿瘤样本中表达下调。细胞周期蛋白E1和E2属于高度保守的细胞周期蛋白家族,与CDK2形成复合物,函数作为监管CDK2的子单元。的细胞周期蛋白E-CDK2复合物所需细胞周期G1 / S过渡。他们在G1-S积累阶段边界和退化是通过S期细胞进展(53- - - - - -55]。P21和p27是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。他们结合,抑制细胞周期蛋白E-CDK2复合物,因此函数作为监管者的G1细胞周期进展。P53诱导高p21和p27的表达和调节细胞周期G1 p53-dependent逮捕在应对DNA损伤的积累56,57]。然而,激活p53并未导致高p21和p27的表达,因此,细胞周期蛋白的形成E-CDK2复合体没有有效抑制(图4)。细胞周期蛋白E-CDK2复合物激活E2F家族蛋白通过与视网膜母细胞瘤蛋白(58]。Massip等人报道,E2F1转录激活p53和参与细胞凋亡诱导59]。总之,我们建议在肿瘤样本DNA损伤积累激活p53但没有导致失去功能的细胞周期阻滞,因为DNA损伤检查点。过度形成的细胞周期蛋白E-CDK2复合物诱导E2F家族的高表达E2F1和E2F2等,进一步导致p53激活。这导致p53的正反馈调节。

图5显示多个计算比较不同细胞凋亡基因表达在肿瘤和正常样本。萨哈治疗24小时后,遗嘱执行人caspase-2, caspase-3,和caspase-7特别是肿瘤样本中高度表达,表明起始的不可逆的细胞凋亡。Caspase-8和死亡受体FAS和TNFR表达并不高,而内在细胞凋亡相关基因如细胞色素C(本体),Smac(暗黑破坏神),caspase-9, Apaf-1明显高表达。这个结果表明,细胞凋亡反应肿瘤样本开始通过内在而不是外在的细胞凋亡途径。我们进一步发现bcl - 2家族蛋白是肿瘤和正常样本之间的不同表达。凋亡蛋白bcl - 2家族如bcl - 2和BCL2L2肿瘤样本中表达下调,而proapoptotic bcl - 2家族蛋白质如坏和BCL2L11调节。汤普森等人报道,bcl - 2的表达和Bim在癌症细胞系带来进一步的阻力或敏感性,分别HDAC抑制剂治疗(60]。我们建议萨哈治疗导致激活p53的描述。P53是凋亡bcl - 2家族蛋白的抑制剂和激活剂的proapoptotic bcl - 2家族蛋白质。P53激活改变凋亡和proapoptotic蛋白质之间的平衡,导致线粒体外膜透化作用(MOMP)和不可逆转的固有细胞凋亡在SAHA-treated肿瘤样本。

基于上述分析,我们提出一个可能的调节模型的肿瘤cell-selective萨哈(图诱导细胞凋亡6)。在肿瘤样本,DNA损伤积累由于萨哈治疗移植激活p53的东盟地区论坛和表达下调MDM2。P21和p27的表达下调他们不调解细胞周期阻滞后p53激活。表达下调p21和p27不抑制细胞周期素E1和细胞周期蛋白E2形成细胞周期蛋白和CDK2 E-CDK2复合物。的细胞周期蛋白E-CDK2复合物激活与RB E2F1的交互。E2F1对p53激活后G1-to-S过渡。激活p53蛋白质会使凋亡bcl - 2家族(例如,bcl - 2)和移植proapoptotic bcl - 2家族蛋白质(如坏),改变凋亡和proapoptotic蛋白质之间的平衡,诱导MOMP。MOMP引起线粒体本体(细胞色素C)释放到细胞质中形成复合物caspase-9和Apaf-1进一步激活实施还存在(例如,caspase-3)。这些过程导致不可逆转的固有细胞凋亡。

4所示。结论

我们提供一个新的分析框架对时序基因表达谱阐明肿瘤的机理cell-selective proapoptotic萨哈引起的反应。Pathway-scale TVPC和阀杆确定通路分析的显著改变肿瘤和正常样本之间的一致性级别和配置模式。特别是,通路相关的DNA损伤反应,DNA修复,细胞周期,p53,线粒体呼吸链,线粒体的完整性和细胞凋亡明显富集。Gene-scale GenMAPP分析确定通路相关的DNA损伤反应,细胞周期,p53和线粒体完整性直接影响肿瘤cell-selective萨哈诱导细胞凋亡。基于我们的研究结果,一个可能的监管SAHA-induced模型提出了肿瘤的细胞凋亡。我们的研究扩展了原始研究的博尔登等。提出了时序基因表达谱分析框架是可操作的、可扩展的解释抗癌药物的恐鸟。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。61172183),吉林省自然科学基金,中国(没有。20130101148 jc),长春科技局、中国(没有。12 zx55)。

补充材料