抗原决定基的映射Metuximab CD147使用噬菌体展示和分子对接

文摘

Metuximab Licartin的通用名称,是一种新的药物肝细胞癌的放射。虽然它是一只老鼠单克隆抗体对CD147、完整的抗原决定基调停的绑定metuximab CD147仍然未知。我们批评Ph.D.-12噬菌体展示肽库和metuximab六mimotopes。下面的生物信息学分析基于mimotopes建议metuximab承认构象表位20多人组成的残留物。残留的抗原决定基可能包括T28、V30, K36, L38, K57, F74, D77、S78, D79, D80, Q81, G83, S86, N98, Q100, L101, H102,却很大,V131, P132, K191 P104。同源建模metuximab和对接的CD147 metuximab也执行。基于上面的对接模型,表位预测包含28个残留物:AGTVFTTV (23-30) I37, D45, E84, V88, EPMGTANIQLH (92 - 102), VPP (131 - 133), Q164, K191。几乎一半的残留的基础上预测mimotope分析还出现在对接结果,表明这两个结果是可靠的。预测抗原表位的metuximab基本上重叠CD147-CD147交互的接口,一个结构性机制提出了metuximab阻塞CD147二聚体的形成。

1。介绍

Metuximab HAb18的通用名称,IgG1类的鼠单克隆抗体由陈等人(1989年1]。杂种细胞生产HAb18由小鼠免疫细胞悬液的新鲜的人类肝细胞癌组织。识别的抗原HAb18因此被称为HAb18G,后来发现果蝇的同种型(2]。遗传性基因的产品有许多众所周知的名字,例如,集群分化147 (CD147),细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN),等等。在本文中,我们使用CD147以后参考metuximab识别的抗原。

CD147是免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。它参与各种生理功能如精子发生(3),胚胎植入(4),组织改造(5[],不同的病理过程,如神经炎症6),阿尔茨海默病(7],疟疾感染[8),和肿瘤进展(9]。尽管在许多细胞类型,广泛表达CD147在癌细胞表面的高纯度,尤其是在上皮来源,例如,乳腺癌[10)和肝癌(11]。因此,作为生物标志物,可用于癌症检测(12]。此外,CD147还提出一种新药目标为开发治疗与炎症、疟疾(13),和癌症(14]。CD147 Metuximab是成功案例目标。碘- 131 F标签(ab′) 2的片段metuximab据报道是安全的和有效的靶向治疗肝细胞癌的临床试验(15,16]。的注入品牌Licartin被批准作为新药物对肝细胞癌的放射国家食品药品监督管理局,中国,2005年。

metuximab绑定到CD147在哪里?答案将帮助我们理解CD147函数的机制和福利针对CD147新药的开发。使用绑定化验的一系列截短片段CD147 ectodomain, Ku等人报道,39 ltcslndsatev50段的识别的抗原决定基在CD147 metuximab [17]。玉等人停靠的阵线片段metuximab CD147的n端结构域上以一对一的方式当CD147的晶体结构ectodomain解决(18]。他们的模型和实验结果表明,残留E49, T51, D65 CD147也可能发挥重要作用之间的交互CD147和metuximab18]。然而,全景的抗原决定基调停metuximab的绑定CD147尚未提出。

抗原抗体复合物的晶体分析是最准确的方法来映射一个表位。然而,耗时,有时在技术上很困难,甚至不可能获得一个抗原抗体复杂的结晶。作为替代选择抗原决定基映射但可接受的精度较低,mimotope分析正在成为越来越受欢迎的方法,其廉价和敏捷19,20.]。在这项研究中,metuximab定义完全抗原决定基的残留物级别使用噬菌体展示和下面的生物信息学分析。结果被验证使用分子建模和对接。全景模型CD147在哪里被metuximab将提供有价值的信息和更好的解码结构基础CD147和发展相关的药物。

2。材料和方法

2.1。,biopan 12-Mer的噬菌体展示库

F (ab′) 2片段metuximab冷冻干燥粉纯度97%以上是由成都Huasun生物科技有限公司的Ph.D.-12噬菌体展示肽库显示2.7×10⁹独特的12-amino酸肽融合pIII小M13丝状噬菌体外壳蛋白是来自新英格兰生物学实验室购买。连续3轮biopannings进行的F (ab′) 2片段metuximab捕获剂涂在96 -微量滴定板,与制造商的手册中描述的修改。

总之,200年的样本稀释至浓度μ在0.1 g / mL NaHCO3 (pH值8.6)。100年μL以上的解决方案被转移到一个96孔板和孵化一夜之间在4°C温和搅拌容器在湿润。井涂有缓冲作为消极的控制。涂层解决方案从井中删除,盘子被监听到一个干净的纸巾去除剩余的解决方案。每个也充满了阻断缓冲区(0.1米碳酸氢钠缓冲pH值8.6 + 5毫克/毫升BSA)。板是孵化1小时在4°C。阻塞的解决方案是删除,板被监听到一个干净的纸巾去除剩余的解决方案。每个迅速被6乘以1% TBST (Tris-buffered盐水0.1%渐变20)。洗盘子里盘旋而反复当涂层和确保每个包括双方是涂布和彻底清洗。2×10¹¹噬菌体与100年从图书馆涨跌互现μL TBST和转移到涂好。板是在室温下孵化与温柔的摇摆45分钟。然后,上层的移除,盘子洗与200年的十倍μL TBST缓冲区。绑定噬菌体筛选了100μL 0.2 glycine-HCl (pH值2.2)+ 1毫克/毫升的组织。洗出液被转移到一个埃普多夫管和中和立即通过增加30μL 1 M Tris-HCl (PH9.1)。滴定后,洗出液被放大大肠杆菌应变ER2738文化附加两个平移使用相同的空斑形成单位的总在每一轮噬菌体。第三个平移实验后,最后洗出液与ER2738宿主细胞混合,稀释和扩散LB-Xgal / IPTG盘子。二十个孤立斑块被随机挑选和DNA测序的放大。

2.2。基于Mimotope分析抗原决定基映射

上显示的肽噬菌体推导出选择从DNA测序的结果。数据首先清洗使用的工具SAROTUP套件排除任何可能的target-unrelated肽(21- - - - - -23]。左边肽被映射回CD147基于其表面的晶体结构(PDB: 3 b5h)使用EpiSearch程序默认参数(24]。每个肽是曼联的映射结果CD147被metuximab抗原决定基。

2.3。分子建模和对接

变量的序列重链(VH)和轻链(六世)metuximab提取从美国专利US7638619数量25]。加入相应的基因库的VH和六世ADC21949.1 ADC21950.1,分别。序列是手动检查。只有部分的VH和21 - 130 20 - 136六世被提交到RosettaAntibody服务器构建的模型变量域(metuximab阵线”(26]。为每个框架区和metuximab互补决定区(CDR),最好的模板被用于同源建模(见表1)。

如表所示1,H3循环metuximab没有任何序列的匹配。这是因此建模RosettaAntibody服务器从头开始的(26]。十大能量最小化模型给出的服务器,和上面的(参见图1)是用作受体对接。

CD147的3 d结构单体(3 b5h链C)然后停靠的阵线模型使用程序ZDOCK框架metuximab地区阻塞(27]。使用ZRANK结果评估和优化使用RDOCK [28,29日]。顶部一个对接模型从理论metuximab-CD147 RDOCK是复杂的。metuximab之间的接口和CD147然后用程序计算比萨(30.]。CD147一侧的一个被视作产生的抗原决定基分子对接。

3所示。结果与讨论

3.1。平移的结果分析

每一轮的平移后洗出液的效价从10增加³,10⁴到10⁶空斑形成单位/毫升,指示一个高效浓缩的噬菌体特别metuximab绑定。第三个平移后,20个噬菌体克隆被随机挑选和DNA测序。推导的氨基酸序列表中列出2。

如表所示27从biopannings获得的独特的序列。其中,肽YPHFHKHTLRGH是最频繁的。仅仅通过目视检查,这些肽可以分为4组,即P1和P2、P3和P4, P5 P6和P7。

3.2。抗原决定基Mimotope映射结果分析

这些肽在SAROTUP检查使用工具套件。有趣的是,据报道,肽DFDVSFLSARMR也曾成功从Ph.D.-12使用蛋白质tonB噬菌体展示肽库大肠杆菌(31日]。为了避免任何可能的锤头,这种肽是基于mimotopes从下面的表位映射。左边肽被一起使用的输入EpiSearch程序(24]。默认参数,他们映射回CD147单体基于表面的晶体结构(PDB: 3 b5h,链C)。分析发现两种解决方案集中在残渣Lys191(得分= 0.780)和Leu101(得分= 0.713),分别。对于每一个解决方案,每个肽是曼联的高分补丁让整个表位预测metuximab识别。

如表所示3和4,两个抗原表位预测EpiSearch相似大小和残渣成分。例如,他们都包含22残留。此外,11残留在斜体印刷表3和4相同的两种解决方案,表明两者之间的一致性在某种程度上的解决方案。如图2没有,大部分残留的解决方案。1定位在域2 CD147和解决方案的主要部分。2是表面的域1。两种解决方案重叠CD147的两个域之间的区域。

当参数准确性截止(允许不匹配)是集从3(默认)2(更严格的价值),只剩下2解决方案。因此,解决方案2可能是一个更准确的预测,我们认为这个解决方案是通过噬菌体展示和mimotope分析表位预测。

据报道,肽的频率不绑定相关的强度和肽的多样性是重要的在分析(32]。因此,所有肽治疗同样在我们的研究中,虽然他们出现在平移结果完全不同。事实上,P1 mimotope YPHFHKHTLRGH,最常出现的肽,并没有比其他人更表位残基当所有这些肽映射回CD147的表面并与对接的结果。

我们也使用其他工具,如PepMapper33- - - - - -35]解释噬菌体EpiSearch显示数据,并得到了一些结果相似。这使得上面的预测甚至令人信服。

3.3。从分子对接表位映射的结果

上面的计算模型从RDOCK结果显示metuximab可能结合构象表位。如图3,表位预测包含28残留:23 agtvfTTV30 I37 D45、E84 V88 92 epmgtaN我QLH102年,131年副总裁P133 Q164,K191年。

其他9个模型的十大RDOCK姿势也被用于计算理论的抗原表位。结果表明,其中7人是相同的一个模型。7日的抗原决定基派生模型是有点不同。除了包括所有残留如图3,它还包含残留N44 T48 F89。只有抗原决定基来自第五模型是完全不同于上面的模型。自十大模型的计算结果相当符合上面,我们相信在图所示的表位3是合理的。

虽然有争论的作用分子对接表位映射,可以非常准确的分子对接的结果。2001年,蓝宝石等人解决b12的结构,对hiv - 1中和人类免疫球蛋白。他们停靠gp120 b12和预测识别的抗原决定基b12 (36]。六年后,gp120和b12复杂的晶体结构是解决和真正的抗原决定基被发现几乎一样的预测(37]。随着metuximab-CD147结构复杂尚未解决,我们的对接结果的准确性目前无法验证。然而,当mimotope分析和分子对接的结果比较,发现重叠。例如,几乎一半没有残留的噬菌体展示解决方案。2还出现在对接的结果(见粗体部分的残留3.3)。噬菌体展示和分子对接之间的一致性表明,预测是可靠的。

3.4。结构洞察Metuximab机制

CD147中存在多种形式,如单体、二聚体、聚合物(18]。已经观察到,CD147可以绑定可溶性CD147 [38]。最近,崔等人发现二聚作用是必不可少的CD147促进肿瘤入侵通过MAPK通路(39]。解决了晶体结构的CD147 (3 b5h)四个单体之间的相互作用(即链。连锁,A, B, C, D) CD147可能代表四种可能的方法来形成一个CD147二聚体(18]。两个CD147单体5月两个细胞的细胞膜相互作用通过n端结构域(域1)就像公元前交流或二聚体形成。可溶性CD147也可以绑定到另一个CD147在细胞膜通过其c端域(域2),这是类似于广告二聚体。链D和D′之间的相互作用被认为是由于晶体包装,主要由59 gvvkeda66 [18]。

非常有趣的是,预测抗原表位metuximab基于噬菌体展示或分子对接重叠交流之间的接口,公元前,和广告调光器。巧合的是,非特异性D D′二聚体是唯一的例外,没有交集的抗原决定基metuximab。因此,至少metuximab机制之一是阻止CD147-CD147交互。因此,从筛选phage-displayed随机肽库获得肽也可能阻塞CD147通路具有广泛的应用前景。

4所示。结论

根据分析的结果对分子对接和噬菌体展示的实验中,我们得出这样的结论:metuximab识别构象表位20多人组成的残留物。这些残留物主要定位在CD147和很大程度上重叠的n端结构域表面CD147-CD147交互的接口。阻塞CD147-CD147二聚体的形成可能metuximab函数的一个重要机制。

确认

作者感谢匿名审稿人的宝贵的建议和意见,导致本文的改进。这部分工作是支持由中国国家自然科学基金会拨款61071177,新世纪优秀人才计划的大学(ncet - 12 - 0088)。

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