文摘

我们已经开发出一种新的多通道光谱成像激光扫描共焦显微镜的有效检测研究中的多个荧光标记的生物组织。本文介绍了系统的设计和关键技术。代表结果共焦成像、三维切片成像和光谱成像。结果表明,该系统适用于多种荧光标记在生物实验。

1。介绍

作为一个有效的和必要的科学仪器观察小结构,激光扫描共焦显微镜已广泛应用于组织生物学、细胞生物学、分子生物学、基因组学、胚胎学、神经学、胚胎学、病理学、免疫学、流行病学、肿瘤学、细菌学、病毒学等(1- - - - - -4]。共焦系统采用空间滤波技术消除out-of-focal-plane光。只能检测到焦平面的光。因此,该系统具有较高的空间分辨率和信噪比(5]。与此同时,光学切片的能力z轴方向,使三维成像的厚样品(6]。

共焦的概念在1950年代提出了明斯基(7]。第一个商业产品在1987年被释放。之后,共焦技术吸引了研究人员的关注,研究和发展新产品。到目前为止,各方面系统的研究了提高图像分辨率(8,9),和新功能的产品已经在市场上推出。

目前,有必要同时图像多个荧光标签组织,区别各种荧光组件(10),和实现复杂的功能实验,如荧光光漂白后恢复(收紧)[11),荧光共振能量转移(FRET) [12),和荧光寿命成像显微镜(这部电影)13]。我们因此发明了一种新的多通道光谱成像激光扫描共焦显微镜来满足这些需求。以下部分描述系统的方法并展示代表系统上的实验结果。

2。系统设计

硬件的多通道光谱成像激光扫描共焦显微镜由荧光显微镜、共焦扫描头,激光源、一个电气控制箱,和一台电脑。在系统使用模块化设计;共焦扫描和多通道光谱成像集成到扫描头;放置在多个激光器激光内阁;扫描头和激光内阁分离,避免激光振动对共焦成像的影响;复杂的电气控制部分集成到一个电气控制箱;控制软件是安装在电脑。

荧光显微镜有独立的照明系统(高压汞灯epi-illumination和透射照明卤钨灯)和光学路径视觉观察。视觉探测光路用于样品的初始观察和本地化之前切换到共焦系统。共焦系统也有一个独立的照明系统(多个激光)和探测系统(pmt)。二维光学切片、三维成像和光谱带宽选择成像可以通过控制软件来实现。

图1共焦扫描头的图,这是共焦显微镜的关键组件。内部结构如图2。它可以分为三个部分:(a)激光组合和选择模块,(b)共焦扫描成像模块,和(c)多通道光谱成像模块。

激光组合和选择模块,四个光纤耦合半导体激光器(405 nm、488 nm、561 nm和638 nm)组合成一个梁使用二向色镜,然后合并后的光束穿过AOTF。合并后的光束激光波长和功率可以调节通过改变超声波的频率和振幅。空闲空间是留给未来的额外的激光扩展升级。

共焦扫描成像模块主要由扫描镜头,x - y检流计光学扫描仪,二向色镜拨号,针孔镜头,和三个aperture-variable针孔。激光反射在二向色镜装配和引导x - y检流计光学扫描仪。然后,它通过扫描镜头和专注于物镜的样本。激动的荧光是想起同样的物镜,经过扫描透镜和二向色镜装配,并集中在针孔针孔镜头。有一个单独的二向色镜装配(包括二向色镜和荧光滤光片)为每个激光波长。多个激光,还有另一个二向色镜组装。一个aperture-variable针孔是60 x油浸物镜。第二个是100 x油浸物镜。第三个是用来平衡图像分辨率和信噪比。

多通道光谱成像模块是基于棱镜的光分离。有三种光谱检测通道。荧光的光谱是扩大了棱镜的色散。在荧光的焦平面,有两个可移动的镜子。部分或全部的荧光之间的缝隙穿过两个镜子和收集的第一个光谱通道。荧光也可以反映在两个可移动的镜子,然后又去了第二个和第三个光谱通道单独检测。有两个可移动的膜片在第二个和第三个光谱通道,可以用来控制荧光的光谱带宽通过调整位置和大小。

3所示。关键技术

多通道光谱成像激光扫描共焦显微镜所涉及到的一些关键技术,如高速同步控制的电流计扫描,三维光学切片成像、多通道光谱成像,空间细针孔滤波器技术(4),和点扩散函数的优化照明8]。前三个是共焦显微镜的基础和将讨论下段落。

3.1。高速同步控制的电流计扫描

扫描控制系统负责控制信号生成电流计。实现数据采集和硬件同步采样信号控制系统的组合和检流计扫描控制系统。它确保图像重建扫描数据的准确性。图3的图检流计同步控制系统。手臂完成用户界面的功能,计算波形数据,参数的设置对采样信号,FPGA和写操作。FPGA模块的功能实现DDS信号产生和采样控制信号生成。FPGA的DAC转换输出的模拟电压信号,用于控制的运动电流计扫描仪。

严格的检流计之间的同步扫描和数据采集是非常重要的。在快速追溯扫描过程中,数据没有收集。为了避免荧光光漂白,AOTF用于快速切断激光(14]。检流计之间的同步扫描控制和数据采集图所示4。同步的要求如下:(i)帧同步信号(方波的上升边)。它有相同的频率慢扫描触发信号。似乎在方波的上升边慢扫描过程。(2)行同步信号。收集数据时触发电压的高水平。整个线数据获得在每个高电平触发信号。它有相同的频率快速扫描触发信号。触发信号在扫描的高水平时,当它在低水平时的追溯过程。(3)抽样脉冲。 The sampling pulse is generated when the line synchronization signal is high. The sampling control signal is synchronized with galvanometer control voltage from the DAC.

3.2。三维光学切片成像

共焦显微成像的一个特征是,只有很薄的组织在焦平面成像时间一次。焦平面上方或下方的组织不能成像针孔的块。这个特性使得共焦显微成像适用于无损的解剖成像。在收集一系列二维图像,3-dimensinal组织可以重建的图像。

在实验过程中,样本组织需要的精确移动z方向和步长为0.2μm。一个压电nanopositioner满足要求。单步长等参数和总一步数字可以调节控制软件。这些参数是三维共焦图像的基础。图5使用虚拟仪器演示了nanopositioner的控制程序。首先,初始化定位器根据起始位置的设置,结束位置和数量的片。然后,定位器移动到开始位置,计算每个块的运动。将其保存在当前位置过程中二维扫描。之后,就搬到了下一片和一个新的二维扫描开始。这个过程是按顺序循环直到完成片的数量。在这个过程中,界面显示了nanopositioners的实际位置。

为了得到一系列的二维共焦图像,需要相对较长的时间。期间,样品应该是固定的,这就需要幻灯片和显微镜基础的支撑结构有足够的刚度。然而,它仍难以消除所有的小飘在漫长的数据采集时间。所以,后处理算法,如图像配准需要正确的漂移。

三维图像重建的一系列二维图像利用体绘制。体绘制方法重新取样收集到的三维数据,并将数据转换为二维离散信号图像显示缓存。它将三维数据,设置为每个立体像素颜色和不透明度,并生成二维显示图像根据照明和阴影模型。主要的体绘制算法包括射线铸造、轨迹跟踪和剪切变形。雷铸造是用于我们的系统。

3.3。多通道光谱成像

如果多个荧光同时很兴奋,单通道或多通道检测需要有效区分荧光组件。荧光效率、光谱分辨率、线性色散和杂散光效应需要考虑的设计。

生物样品的荧光通常是弱。光传输效率是荧光光谱仪的设计非常重要。在可见光谱中,最大效率的光栅光谱仪只是1/2-2/3棱镜光谱仪。效率降低1/4的棱镜光谱仪时远离了波长。因此,光栅光谱仪失去更多的荧光微弱信号检测。

共焦系统,光栅面积非常小,使用行号是10的水平³。理论分辨率高于棱镜。然而,所需的最小光谱带宽只是5海里。光栅光谱仪的光谱分辨率高并不是充分的利用。

与光栅光谱仪的线性色散,色散棱镜光谱仪是非线性的。在共焦系统,用户需要选择数据采集前的光谱带。因此,非线性色散对成像系统的影响不大。

棱镜光谱仪杂散光主要来自棱镜表面反射。棱镜表面增透膜后,杂散光减少到10⁻³或更少。对光栅光谱仪杂散光等来自许多来源光栅衍射能级重叠,30 - 40%未使用的能源从零阶和高订单。的非工作表面光栅槽和鬼线引起的光栅执政错误也会导致代杂散光。

所以,棱镜光谱仪优于光栅光谱仪,因此系统中使用。

由于成本限制,系统中有3个荧光检测通道。它可以根据需要扩展到有更多的渠道。多通道光谱成像系统基于棱镜如图1。每个通道的光谱范围的检测可以从400调整到700海里。最小光谱带的宽度是5 nm和最大带宽是300海里。

在系统中,常数偏差角是用来扩展频谱。光学路径旋转了90度,以确保那棱镜后的总偏差角是恒定的光的最小偏差情况。棱镜的色散常数偏差角的函数等于棱镜的顶角60度。

样品的荧光准直后集中在图像平面。棱镜是固定的,和检测中心波长和光谱带宽可以调节出口狭缝组装。在图1,出口狭缝1位于焦平面。的两个叶片狭缝,涂有反射膜,由独立30度倾斜的两边。叶片表面反射的光线进入通道2和3。狭缝中发现控制光谱带宽1 PMT 1。狭缝2和3调整光谱带宽分别在PMT发现2和3。

4所示。实验结果

图6显示了系统设置。(一)激光源,(b)是x - y检流计光学扫描仪,(c)是nanopositioner,探测器(d)。系统中,油浸客观UPLSAPO从奥林巴斯使用100 x。NA是1.4和工作距离是0.13毫米。超级高度消色透镜目标充分补偿两个球形色差从紫外到近红外区。照明源从馆半导体光纤激光器集成公司。纤维单模保偏。激光的波长405 nm、488 nm、561 nm和638 nm。输出功率是35 mw。光学扫描仪从剑桥6215 h技术使用。PMT H10720从滨松。 Despite the small size nearly equal to photodiodes, this PMT delivers high gain, wide dynamic range, and high-speed response. PCI 6132 from National Instruments was used as data acquisition board. It has 4 simultaneously sampled analog inputs, up to 2.5 or 3 MS/s in warp mode. The ADC resolution is 14 bits. Experiments of the confocal imaging, 3-dimensinal sectioning imaging, and spectral imaging were accomplished based on the system.

4.1。共焦成像实验

在实验中,波长488纳米的激光照明源。生物组织准备从分子探针slide-mouse肾脏部分。幻灯片包含16μm低温恒温器的部分小鼠肾脏沾荧光染料的结合。Alexa萤石488麦芽凝集素,一个绿色荧光凝集素,用于标签的元素肾小球和曲小管。成像区域是。结果如图7。肾小球和曲小管明显区分。它可以观察到,共焦图像只是从一个非常薄的组织切片(焦平面),共焦成像的特点。部分的黑暗区域意味着没有组织,这是完全不同于传统的荧光显微镜。从传统的显微镜获得的图像是由厚的部分。在焦平面组织信息以及焦平面的上方和下方显示。所以,整个图像对比是退化。

4.2。三维解剖成像实验

样本和激励源是一样的实验中使用分段4所示。1。成像区域是。三维图像,nanopositioner (Nano-Z100,疯狂的城市实验室)被用来移动的样本Z方向。步长为0.2μm和样本感动100步。因此,100年获得的序列图像。然后从这100图像三维图像重建。他们是如图8和9。这两个图的图像8集中在两个不同的深度吗z的位置。两幅图像之间的距离是1.2μm。它可以被观察到的细节组织改变。

4.3。共焦光谱成像实验

改进的光谱仪探测器和入射狭缝前添加删除。针孔成像在入射狭缝,一个圆形的狭缝成立。出口狭缝取代了狭缝的位置和宽度可调。荧光染料的光谱波长638纳米的激光Cy5兴奋的图所示10 ()。光谱的带宽是50 nm。尤其是荧光带宽还是可以通过改变狭缝的位置和带宽。通过计算,50μ米狭缝与2.5 nm频谱带宽。这是显示在图10 (b)。

在实验中,波长405纳米的激光照明源。生物组织是鼠肾脏切片从分子探针。片,核与blue-fluorescent DNA DAPI染色复染色。图像区域。全光谱图像和图像如图2.5 nm带宽11。在这两种图像,核显然是观察。荧光光变得软弱和信噪比变得更糟的是当频谱带宽降低。

系统利用多种荧光照明组件同时和多个检测通道共焦成像。每个通道可用于光谱成像和光谱分析。棱镜用于分离光谱,光利用率更高,而光栅的方法。这是非常重要的弱荧光信号。此外,杂散光的棱镜相对较小。所以图像可以获得更高的信噪比。由于同时实现多通道光谱成像系统的缺点是,许多地方需要同时控制。因此,控制系统非常复杂,需要同步的所有部分。此外,图像的实时显示需要密集计算的图像重建和处理。高性能的图形工作站是必要的。

5。结论

介绍了我们的新开发的多通道光谱成像激光扫描共焦显微镜。系统设计和关键技术(如高速同步,控制电流计扫描,三维光学切片成像,和多通道光谱成像)。实验结果表明,该系统能够multifluorescent光谱成像。我们的多通道光谱成像激光扫描共焦显微镜有许多优点。首先,它可以同时激活多个染料和有效区分各种荧光组件。系统中,四个405纳米的激光,488 nm、561 nm和638 nm被用作照明源。激光源模块是可伸缩的。额外的激光扩展可供用户的升级。其次,不同的光谱成分相同的染料可以成像,位满足生物实验的要求。三个荧光通道同时实现多个光谱成像检测。 The detected spectrum’s central wavelength and spectral width can be adjusted individually for each channel. The information from the detected spectrum is fully utilized. Thirdly, the illumination and shading model was improved, and 3-dimensional image reconstruction algorithm was optimized especially for confocal sectioning images. The image reconstruction time was greatly decreased from 30 seconds to 15 seconds.

确认

这部分工作是支持SIBET Y052031205和Y053011305的项目,国家自然科学基金委资助61201117,和NSFJ格兰特BK2011331。