文摘

细胞形态学研究基金会在许多应用程序中相关细胞状态的估计,药物反应,毒性筛选。在生物医学领域,定量阶段检测活细胞的一个必然趋势。海拉细胞的形态变化,用不同浓度的甲醇使用数字全息显微镜检测。紧凑型屏数字全息系统设计基于光纤的元素。活细胞的定量阶段形象获得与数值分析相结合。统计分析表明,海拉细胞面积和平均光学厚度的12.5%或25%甲醇处理显著降低,这表明甲醇浓度较低可能导致细胞收缩。海拉细胞用50%甲醇的面积是类似于正常细胞,揭示了固着较高的甲醇浓度的影响。最大的光学厚度的细胞用12.5%,25%,和50%甲醇比未经处理的细胞,这意味着下的海拉细胞固缩甲醇的效果。所有的结果表明,数字全息显微镜提供了一种非侵入性成像替代测量label-free活细胞的形态变化。

1。介绍

细胞形态密切相关,它的各种功能和活动是现代生物医学研究基金会的纪律和生命科学。在正常的细胞培养,活细胞的大小变化显然是由于细胞增殖或细胞死亡,和生存状态的细胞也可以估计的细胞形态在很大程度上。细胞凋亡,细胞程序性死亡过程中,扮演着一个重要的角色在发展和体内平衡和形态学变化是一个典型的功能区分细胞凋亡和坏死1,2]。细胞形态也可以揭示活细胞如何受到不同的环境因素的影响或不同的医学治疗,如抗癌药物(3,4]。除此之外,在某些疾病,如糖尿病、缺铁性贫血,地中海贫血,细胞形态发生了显著变化(5,6]。比较简单的观察,定量阶段检测label-free活细胞的形态变化已成为生物医学研究的迫切需求。

光学显微镜是一个主要的和强大的工具在生物和医学研究中几个世纪。由于生物细胞几乎是一种透明的物体称为相对象,传统的灰度光学显微镜成像方法难以提供足够的细胞之间的对比和环境。荧光显微镜需要外源性标签造影剂如罗丹明、吖啶橙、绿色荧光蛋白(GFP)解决不同的问题,这可能会让活细胞光毒性和细胞毒性,并影响细胞行为不幸的是(7]。对于这些问题,开发了许多光学phase-imaging方法实现label-free视觉观察活细胞。相衬显微镜的成像技术,如泽尼克微分干涉相衬显微镜或对比(DIC)显微镜下明显提高阶段的对比或semiphase对象;然而,他们本质上是定性的方法,不能给亚细胞结构的定量信息。因此,一些技术已经开发获取细致和量化相衬成像,如傅里叶相位显微镜(FPM),希尔伯特相显微镜(HPM)衍射相位显微镜(DPM)和数字全息显微术(DHM) [8- - - - - -13]。与其他成像方法相比,DHM吸引了更多的关注研究因其特殊的优势。DHM可以检索对象的定量振幅和相位信息波前从一个单一的数字全息图,使实时检测成为可能。由于数值集中可以由波传播理论,实现DHM并不要求严格记录全息图集中图像平面上的对象,和数字的自动对焦算法可以搜索最好的聚焦图像。此外,DHM不需要任何复杂的扫描相应的配置和拥有一个简单的设置。

基于DHM无创性细胞成像在生物医学领域引起了更多的关注。Rappaz等人的生理参数测量的神经元和留有遗嘱的变形虫利用premagnification数字全息术(12,13]。Kemper等人研究了活着的胰脏癌细胞的入侵机制和抗癌药物的相互作用机制的动态检测活细胞基于DHM系统(14]。金等人卵巢癌细胞的定量成像实现通过角谱法。除此之外,他们还定量地研究了硅橡胶膜起皱的能动的成纤维细胞基于数字全息术(15,16]。宋等人利用数字全息光学相干成像跟踪的影响细胞骨架抗癌药物在组织内部使用时间进程三维(3 d)研究其自然环境测量肿瘤组织内的能动性(17]。Pavillon等人应用了数字全息显微术的早期和label-free检测小鼠皮层神经元的细胞死亡(18]。然而,它也是至关重要的,开发的有效设置DHM和扩大其新的应用程序。

许多药物的活性成分不溶于水只能溶解在有机溶剂极性高(19,20.]。作为一种有机溶剂,甲醇是经常应用在体外药效学筛选。然而,高浓度的甲醇溶液对活细胞的毒性;因此,应稀释的甲醇浓度较低时用于细胞培养。此外,组织和细胞的固定是一个关键的免疫组织化学的过程。甲醇是一种常用的固定剂具有良好的渗透(21,22]。它可以去除油脂导致细胞脱水,与此同时,细胞骨架蛋白瞬间沉淀。甲醇的固定剂影响终止或减少外源性或内源性酶的反应防止自我分解的细胞为了维持组织细胞的固有形态和结构,更重要的是,保留抗原性,并防止抗原的损失或扩散。摘要海拉细胞(人类宫颈癌癌细胞)作为测试样本。细胞形态变化与不同浓度的甲醇溶液治疗DHM成像系统进行了研究。结合数值分析和图像处理,细胞的表面积和光学厚度进行了计算,结果表明,不同浓度的甲醇溶液对生活形态海拉细胞有不同的影响。

2。材料和方法

2.1。数字全息显微术的原理

数字全息显微镜定量相衬显微镜的成像方法,本质上是一种光学干涉法检测相关的相位延迟光通过测试对象。通过一个相对透明的样品时,光的强度变化很小,而光通过样品加速或减慢和带来了相应的相变,表示图1。相位延迟或提前取决于样本之间的折射率的关系和周围的环境。由于相位信息的光学路径长度称为光学厚度成正比,可以计算测试样本的深度剖面。因此,数字全息术是特别适合测量相位物体如活细胞和microoptical元素。

在一般情况下,相干光源分为两个胳膊,一只手穿过梁测试对象作为对象,另一个是用作参考光束。对象和参考光束的干涉图样由高分辨率CCD探测器记录来获取所代表的数字全息图 在哪里和是对象和参考波的复振幅分布在全息图平面上,和*表示复共轭算子。

所示(1),和是直流,是真正的项,是虚拟术语。在离轴DHM配置,这三个方面是分离,真正的术语可以被过滤在频域中提取(23]。真正的项可以使用衍射理论传播到图像平面。开发了各种算法的数值重建包括菲涅耳变换、卷积,和角谱,所有这些都可以实现快速傅里叶变换(FFT)的帮助下,我们已经分析了重叠的质量、准确性、像素分辨率,计算窗口,和这些方法的速度24]。FFT-based角谱法,这是优于FFT-based卷积方法的精度和速度。与传统的光学全息术不同,图像处理技术可以获得定量的振幅和相位分布。为了获得相位分布的数字全息图,它是至关重要的光学波传播到不同重构距离以确保获得焦点的飞机。相位畸变引起的倾斜的参考波,微观目标(MO)和其他光学元素是可以纠正的。此外,相位值的范围是有限的由于反正切函数的原则,因此将包含相位图像不连续当测试样本的光学深度大于波长。最小二乘相位展开算法是一个很好的替代获取相位信息(25]。演绎对象复振幅分布后,我们可以获得相衬显微镜的图像。

接下来,光学厚度和物理厚度的关系进行了探讨。附着的活细胞通常是沉浸在细胞培养方案如图1,总光路延迟(门诊部当)的传输波可以表示为12]: 在哪里是空间折射率不同的积分,的折射率是文化解决方案,是细胞的空间不同厚度,是文化的高度的解决方案。积分折射率定义如下: 门诊部当一个参考,可以测量计算前在的地方没有细胞。然后,可以转化为细胞厚度分布

卢等人,耶利哥等人的折射率测量海拉细胞使用希尔伯特相显微镜基于微流体设备(26,27),结果表明折射率是。然而,细胞的折射率的变化可能发生在播种不同培养基的海拉细胞(13,28];与此同时,从(4),是空间坐标的函数,和细胞内屈光如核仁和细胞质也具有不同的折射率。的折射率改变细胞内造成的折射和添加不同数量的甲醇在我们的实验中,我们只给海拉细胞的光学厚度描述形态特性。

2.2。数字全息系统

数字全息的设置可以简化与纤维的结合(29日- - - - - -31日]。屏数字全息显微镜设计如图设置2。波长532纳米的激光源由laser-to-fiber耦合进光纤耦合器(利物浦),然后分成两臂由1×2光纤耦合器(FC)。由纤维束平行准直器(FCL)采用对象照明光束,近球形,另一个是用作参考光束。微观目标(20 x, NA = 0.4)收集的光通过样品并产生一个平面上的图像放大的实像。CCD相机放置在图像平面上的对象和数字全息图的记录。CCD相机可以生成像素图像为4.65μ米×4.65μ米大小的像素。分束器的参考光反射(BS),这使得对象之间的一个小角光束和参考光束。两个光纤衰减器(FA)的应用对象和参考臂调整强度比率提高数字全息图的图像质量。

2.3。样品制备

海拉细胞(从美式文化集合)保持在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充10% (v / v) heat-inactivated胎牛血清的边后卫,100单位/毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升、谷酰胺和2毫米。细胞在37°C和5%孵化有限公司₂。当细胞融合达到约90%,0.25%胰蛋白酶溶液用于消化细胞5分钟。然后海拉细胞被播种在6-well塑料盘子。播种后24小时,融合细胞约70%。甲醇溶液连续稀释2 -,4 -或使用DMEM 8倍。文化的上层清液代替有机溶剂稀释或新鲜的DMEM。三个稀释,每个稀释和四个副本了。每个稀释的甲醇浓度为12.5%,25.0%,和50% (v / v)。井只有细胞和没有任何有机溶剂被用作细胞控制(CC)。十二小时后,四个样品用于活细胞的形态分析。

2.4。数字处理和测量

屏数字全息系统的全息图记录过滤在频域中删除直流项和虚拟项。我们调整CCD图像平面的对象尽可能在实验中,而这是不可避免的,可能会有一个小CCD和精确的图像之间的距离飞机由于优化组件的限制。补偿实验误差,应用衍射传播距离±2毫米内重新定义获得焦点的平面的角谱的算法。使用两步相减法的相位畸变纠正的方法。在实验中,引用全息图记录没有培养基首先,然后培养基的相位全息图的图像可以获得。已经证明,它是足以记录全息图的引用之前补偿相位畸变的测量过程(32]。最后,打开阶段获得的图像是最小二乘相位展开算法,然后定量阶段活细胞可以获得的信息。为了描述细胞的形态学变化,利用图像分割提取每个细胞图像基于Matlab程序的阶段。

图像分割的过程是,首先,以减少噪声的高斯滤波和中值滤波像素。通常有几十细胞阶段的形象,因此小面积包括整个阶段图像感兴趣的细胞从减少计算复杂度,提高分割的准确性。其次,Sobel算子的图像增强和自适应阈值算法采用相位图像转移到一个二进制图像。考虑到活细胞通常比离散噪声,所以连接区域的细胞比噪音。根据这一想法,剩余离散噪声可以通过检测主要是删除连接区域的像素数量。最后,我们可以标签的位置感兴趣的细胞在二进制图像。一方面,表面积可以很容易地计算根据总像素值由细胞;另一方面,我们也可以获得细胞的光学厚度。我们更加关注最大的光学厚度和平均细胞的光学厚度。值得注意的是,光学厚度的细胞与细胞之间的差别厚度和参考厚度没有细胞。 To increase the precision of optical thickness, the reference thickness is computed by averaging the optical thickness of several areas without cells.

3所示。结果与讨论

在实验中,海拉细胞治疗与不同浓度的甲醇成像在塑料盘子。未经处理的细胞的形态见图3(一个)。细胞排列定期与多边形的形状或钻石,这表明,细胞大多生长附着在一个健康的状态。除此之外,值得注意的是,自然死亡或衰老的细胞会发生尽管培养良好的状态。衰老死亡的细胞,细胞逐渐失去附着的能力,成为圆形表面张力下的解决方案。如虚线框所示的图3(一个),很显然这是一种典型的舍入死亡细胞。希望这种细胞,不仅面积变化成一个圆形,而且细胞厚度有一个可见的变化,可以由数字全息技术优。在图18正常细胞3(一个),他们的平均光学厚度rad 0.99,平均最大的光学厚度吗是2.89 rad。这里,平均最大的光学厚度的定义是最大的光学厚度的平均值计算细胞。舍入细胞在虚线框中,其平均光学厚度成为高3.47 rad,其最大的光学厚度是6.45 rad。因此,超大的光学厚度可能是一个表征这种不正常的细胞。

与不同浓度甲醇溶液对生活形态海拉细胞有不同的影响。因为中间代谢物如甲醛和甲酸引起的过量的甲醇会损害细胞在某种程度上。细胞形态处理12.5%、25%和50%甲醇是如图3 (b),3 (c),3 (d),分别。我们可以看到,细胞形态处理甲醇有明显变化,特别是细胞形态处理甲醇12.5%和25%。

56个细胞的大小分布处理0%或12.5%甲醇是描绘在图4直观地,和坐标表示表面积()和平均光学厚度()的细胞。比较图4(一)与4 (b)平均细胞面积和光学厚度分布在不同区间,这意味着相应形状的变化。

定量地描述形状变化,56个细胞的信息从每个浓度,提取和参数包括区域,平均光学厚度(),平均最大光学厚度(),以及相应的标准差(SD)表中列出1。实验数据分析使用的统计学意义测试和(方差分析)方差分析基于社会科学统计软件包(SPSS) 16.0版本。方差分析显示显著差异存在的上述四组之间的参数()。然后细胞控制的集团之间的差异,探讨了甲醇治疗组。海拉细胞用12.5%或25%甲醇,面积与正常细胞相比显著降低(),这表明,甲醇浓度较低可能导致细胞收缩。海拉细胞用50%甲醇,该地区是类似与正常细胞(),验证甲醇浓度较高的固着效果。然而,仍然有显著差异和(),只能检测到相位图像。细胞的形态学特征处理25%甲醇显示显著差异三个参数,,()。此外,细胞治疗的平均最大的光学厚度12.5%,25%,和50%甲醇比未经处理的细胞,这意味着下的海拉细胞固缩甲醇的效果。

4所示。结论

它最近迫切需求定量检测活细胞的形态在生物医学和生命科学领域。海拉细胞的形态学变化,甲醇处理的解决方案是基于数字全息显微镜测量。甲醇,作为一种有机溶剂,通常用来溶解一些药物浓度较低,也适用于组织和细胞浓度高的固定。后使用屏数字全息系统记录全息图,活细胞的相位图像是由数值分析计算。图像处理的协助下,活细胞的表面积和光学厚度计算来描述细胞形态定量。方差分析显示四组之间的显著差异()。与CC组相比,和海拉细胞治疗的12.5%或25%甲醇显著减少,哪个验证甲醇浓度较低的毒性,可能会导致细胞收缩。海拉细胞用50%甲醇,类似与正常细胞(),它揭示了固着较高的甲醇浓度的影响。此外,细胞治疗的12.5%、25%、和50%甲醇比未经处理的细胞,这意味着下的海拉细胞固缩甲醇的效果。所有的结果表明,数字全息显微术是一种非侵入性成像方法检测label-free活细胞的形态变化。

作者的贡献

王y, y杨同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作为中国国家自然科学基金资助(号。61077004,61107002,61205010),北京市自然科学基金(没有。1122004),研究基金会对中国高等教育的博士项目(没有。20121103120003)。