文摘
本文强调发现使用噬菌体展示影响农产品的使用。贡献噬菌体展示了我们的基本的了解各种保护性分子为保护植物和种子从食草动物和微生物进行了探讨。噬菌体展示的工具酶的定向进化增强能力的复杂聚合物降解细胞壁分子用于生物燃料的生产调查。食物过敏通常是针对组件的种子;本文强调噬菌体展示如何被用来确定种子组件(s)贡献最过敏反应以及如何发挥了核心作用在新方法减轻病人的反应。最后,使用噬菌体展示的概述在识别成熟种子蛋白质组提供保护和修复机制。蛋白质的识别特定的类优先受这样的保护和修复蛋白质导致假设关于维护的平移装置损坏的重要性在种子萌发期间静止和环境扰动。希望这些例子,将刺激使用噬菌体展示未来植物科学研究protein-ligand交互。
1。介绍
由史密斯[发展以来1],噬菌体展示已经被证明是一个强大的工具对蛋白质相互作用的研究免疫学、细胞生物学、药物发现和药理学。噬菌体展示是一个杰出的科学家确定其他分子和蛋白质有亲和力有惊人的吞吐量能力筛选与库浓度接近109病毒粒子每微升。其效用主要在于针对特定目标的生成分子探针和识别、分析和操纵protein-ligand(包括蛋白质)相互作用。现代的噬菌体展示库允许寻求属性(即,蛋白质与亲和配体(饵))是直接耦合的DNA序列编码蛋白质的非破坏性的方式。随机DNA库,或那些由cDNA随机启动后信使rna,提供一系列不同的氨基酸上下文可以转化为连续的亲和力的诱饵。复苏重叠克隆特定蛋白质的许可检查本地区的蛋白质,导演实验者的特定网站结合配体的能力。此种网站有效定位,这些信息可以用于预测目标属性作为ligand-protein亲和力的基础,指导将来的蛋白质工程工作。
这种技术,由于它的简单性和有效性,负责发现合成抗体定向进化和分子相互作用和利用。噬菌体展示的应用程序发现protein-ligand交互变得越来越复杂的效用已经承认在一个多样性的领域,包括生物活性分子的识别目标。例如,石杉碱甲是一种共生产出,与多个神经保护效应(生物活性化合物2,3]。磁,biopan方法已经用于识别目标途径受到石杉碱甲的一些药理作用负责减轻许多障碍,可能包括阿尔茨海默病(4]。
尽管噬菌体展示的效用,但技术从植物科学家得到的关注更少,除了持续计划开发一系列不同抗体细胞壁组件(5在其他文献[],讨论主题6),因此这里没有检查。然而,噬菌体展示有很多提供植物研究的其他领域。本文调查的应用噬菌体展示蛋白质-蛋白质之间的关系在各领域的发现的植物科学关心最大化作物植物的种子生产和利用的营养储存在种子,从保护作物免受有害的害虫减轻人类对种子贮藏蛋白质过敏反应。
我们在强调文学的目的是提高植物生物学家的意识技术的效用超过单独产生抗体。如果成功,噬菌体展示图应该更加突出在这些植物科学家研究分子相互作用的研究。
2。在农业应用噬菌体展示:种子生产
为什么关注种子生产?在基本层面上,有必要了解人类依赖种子种子属性是如此普遍。种子是我们的主要食物来源(70%的饮食7,8]);他们为我们的牲畜饲料,散装食品运输方法,存储、种质保存、车辆技术交付。轻率的不理解更多关于种子繁殖体满足其功能,我们所依赖的过程完全,但我们仍然知道所以很少9,10]。除了构成人类的大部分食物,最近附加用途能源存储在种子(生物燃料(11)定期导致更高的种子和全球大宗商品价格(12,13]。尽管政府试图减轻负面影响增加主食价格对穷人的12),对种子的需求作为食品和生物燃料原料和土地生产仍不断增加14]。不断增长的全球人口预计将增加谷物消费食品独自在未来30年十亿吨(2002年粮农组织,http://www.fao.org/docrep/004/y3557e/y3557e00.htm);然而产量损失预测的生物和非生物压力预计将增加15]。这些残酷的事实增加了紧迫感要求提高种子生产的所有方面的理解。当务之急是我们这么做如果我们要养活自己16]。
2.1。噬菌体展示利用植物对食草动物和微生物的防御
2.1.1。识别和优越的蛋白酶抑制剂的生产
植物蛋白酶抑制剂(pi)是一个防御系统采用对食草动物和微生物17]。π是一个植物保护策略,可以减弱营养同化昆虫肠道或由微生物消化蛋白酶抑制害虫的活动(18]。有很多使用的π植物自然抵御害虫(19]。π生产可以通过害虫诱导植物体内茉莉酸/病原体攻击通过通路(20.),但也受到发展的规定,他们的生产在存储刺激组织(21]。刺激下,种子,π转录脱落酸(ABA)(抑制发芽)和抑制赤霉素(GA)(萌发刺激)(22]。因此,种子内源蛋白酶活动(负责存储蛋白质分解使用的建立幼苗)降低种子发展合成期间,允许不受阻碍的贮藏蛋白质的积累,而这个障碍是缓解返青允许访问期间能源和组件构成的存储蛋白质(图1(a))。减少,通过NADPH-dependent硫氧还蛋白h系统,具体的二硫键需要传授的π抑制确认(23)也从建立艾滋病的种子π影响幼苗(24]。通常,π是热不稳定,允许人类获得完整的种子贮藏蛋白质的营养价值(其中一些蛋白酶抑制剂的(25)在熟食否认昆虫和微生物(26]。
植物通常编码一个大量的各种各样的π用于抑制多种蛋白酶和蛋白酶中亚型类害虫。蛋白酶同种型昆虫的患病率也各不相同,表现出适应性的害虫在试图克服这种植物防御机制(31日- - - - - -34]。使用噬菌体展示通知定向进化策略(35,36)或特定基因定点突变(37以更大的特异性[]的努力产生π38)或亲和力(39]害虫的蛋白酶活性部位旨在增强这自然意味着保护作物。π目标(通常是非常特定的蛋白酶40),和噬菌体展示的中心努力构建π与更大范围的目标。这种增强共性包括为π,biopan变异的多样性可以抑制蛋白酶害虫(41]。噬菌体的另一个方面display-based保护增强对方的策略,努力识别更为精细的π到目标物种(害虫)蛋白酶类(42]。
各种小说试图利用噬菌体展示收购提供更大范围的ππ是面向提供保护植物可用比传统的植物育种专家。π的开发和识别具有独特功能的表达下调特定害虫蛋白酶的活性,通过噬菌体展示或其他手段,将允许这些植物保护机制来增强现有自然植物。叠加π与不同蛋白酶目标站点可能有助于拓宽害虫易感性而拖延收购阻力π(43,44]。
2.1.2。发现Non-Protease抑制剂保护肽
噬菌体展示可以识别多肽或蛋白质,对大量分子的亲和力。肽具有高亲和力的蛋白质主要害虫的生命周期可以破坏害虫的永久或病理学(45]。一旦确定,这种肽可以改造和引入大多数作物植物内生生产,提供了一个新颖的防御植物害虫。plant-contained,这种特定的保护机制可能是作物对非目标生物的危害较小的环境比传统的杀虫剂(46]。Chemoreception-disruptive肽从肽库中选择已被证明减少寄生线虫,尽管剂量3个数量级大于涕灭威杀线虫剂控制(47]。尽管如此低得多的能力,亲和力高的涕灭威模仿乙酰胆碱酯酶,当生产在足底在马铃薯,是有效减少寄生负载囊肿线虫(46),否则很难控制因其固着习惯和位置、嵌入到植物根系中。因此,原位模拟效果较低的生产中和这个责任,导致线虫控制,这也是通常的目标应用杀线虫剂具有更大的力量但只有一部分到达网站的行动。同样,噬菌体展示肽绑定游动孢子真菌病原体的识别疫霉capsici。许多zoospore-binding肽导致过早成囊的游动孢子没有任何其他感应信号。除了帮助zoospore-displayed受体的识别控制成囊,作者推测,这种肽可能代表一种新的植物防御机制(48]。随后,减少由这个土传真菌感染导致当一个保护肽表达在足底在允许其进入根际分泌一种形式49]。
2.1.3。使用在植物病毒学
噬菌体展示已经被各种植物病毒学家鉴定肽结合致病性病毒的外壳蛋白。噬菌体display-isolated肽是非常具体和高度敏感。至少,这些有诊断的潜力,因为他们可以产生与蛋白质融合作为antibody-reporter抗原分子轭合物(50]。他们也可能构成小说的基础,介绍了抗病策略。肽具有高亲和力和特异性的重要病毒蛋白质可以被识别,随后,这些肽合成能力可能引入的植物。在足底肽生产可能阻止病毒在感染细胞增殖。这种策略已被成功地用于与抗体(51),但抗体折叠通常需要一个有利于形成特定的细胞内二硫键的氧化环境所必需的功能(52]。噬菌体显示所选择的肽可能没有那么严格的要求(53]。的确,噬菌体显示所选择的肽能够绑定到大米黑色条纹矮病毒的外壳蛋白(RBSDV),当生产重组用于诊断目的,也已被证明干扰适当的外套蛋白质折叠和减少RBSDV[的致病性54]。噬菌体展示也协助各种主机系统的说明只有一边的病毒允许成功的感染和复制。使用病毒复制增强蛋白质、AC3作为诱饵,噬菌体随机dodecapeptides融合图书馆一层蛋白质翻版识别交互肽,然后从模型分析对同源蛋白质,拟南芥。路径的启示这些蛋白质是积分使得所需的事件更复杂的理解成功的病毒生命周期和多功能的作用蛋白质AC3事件导致病毒诱导基因沉默(55]。
2.1.4。在植物免疫目标的识别
已知植物是一个非常复杂和多样化的免疫系统对抗微生物(56]。第一个活跃的防线microorganism-associated时发生在植物细胞表面分子模式(mamp),如脂多糖肽聚糖或细菌鞭毛蛋白检测到模式识别受体(PRRs)。这些PRRs负责pattern-triggered免疫力(PTI)在植物57- - - - - -59]。绕过PTI、改编病原体可以直接进入植物细胞传递效应分子。作为对策,植物已经开发出相应的电阻(R)蛋白质识别这些感受器及其修改目标导致effector-triggered免疫力(ETI) [59]。PTI和ETI涉及特定家庭的蛋白质,但这两种类型之间的区别还不清楚。很明显,大量的蛋白质参与免疫过程。里奥哈等人用噬菌体展示来研究这些相互作用和识别拟南芥蛋白质能够结合细菌病原体(60]。为此,他们建造两个microbe-challenged互补的噬菌体展示库拟南芥。重组噬菌体展示植物蛋白与不同种类的交互的能力假单胞菌(病原体)被选中,biopan使用微生物细胞作为选择配体。通过这种方式,植物蛋白参与防卫反应识别和随后证实在体外结合微生物细胞的能力。使用不同菌株的假单胞菌作为诱饵允许歧视之间常见的致命细菌受体和具体目标或无致病力的菌株。
2.2。在细胞壁中的应用研究
兴趣使用纤维素和其它植物细胞壁成分作为原料在全球生物燃料生产持续增长的原因。当前的解构纤维素多糖对葡萄糖转化为生物燃料的效率较低,更昂贵的比实际的工业相关的过程。一大道正在探索更高效的纤维素转化为葡萄糖是通过增强酶促降解。它已经证明了一些多种纤维素酶和半纤维素酶保留其功能融合病毒外壳蛋白(61年,62年]。这些克隆随后可以再造工程改变(随机)感兴趣的特定区域/亲和力传授新的功能酶组合显示。酶合成的噬菌体展示库变体可以通过基板/抑制剂的筛选研究单个氨基酸传授观察/所需的属性。
项目还使用噬菌体展示库发现或改进碳水化合物绑定模块集中在这些地区的使用加强糖苷水解酶的亲和力/绑定模块构造不同的结晶形态,从而改进他们的生产力63年]。其他用途包括高度具体探讨细胞壁成分,这是至关重要的炼油我们理解植物细胞壁结构(64年- - - - - -66年]。
此外,图书馆真菌“在内”β1,4-xylanase酶变异允许同时评估的影响许多不同的个人残留在木聚糖酶抑制蛋白的亲和力67年]。后续的工作允许“在内”的发展β1,4-xylanase酶,保留其催化能力,完全在面粉中发现对木聚糖酶抑制蛋白(68年]。使用真菌木聚糖酶在食品工业中,提高营养价值和属性,但其失活的内源性抑制剂使用的食品中发现一直是行业的问题。此外,通过计算的方法,pH值稳定的酶已被大大提高导致其效用的增加在制备食品行业(69年]。
2.3。噬菌体展示使用种子贮藏蛋白质过敏症
近5%的人有某种形式的食物过敏70年]。确定食物过敏原包括种子贮藏蛋白质,可以诱发各种过敏症状(71年,72年]。噬菌体展示有协助的快速识别抗原诱发过敏的反应(73年)包括那些先前编目(74年]。一旦个人怀疑他们对一个特定的食物过敏,更复杂的组件(s)在评估引起过敏反应的食物是必要的,如果任何缓解。抗原表位从图书馆的过敏原的食物问题[75年),批评在病人IgE,可以快速和廉价地识别特定过敏原(s)导致过敏的反应74年]。例如,花生过敏很常见(~ 1%的美国人口76年),被认为是增加(77年),可以严重[78年]。噬菌体展示已经被用于精确识别蛋白质导致peanut-sensitive病人过敏的反应(79年),暗示种子贮藏蛋白质的重要和占6 8在花生过敏原标识日期(80年]。
同样,“贝克的哮喘”,一个共同的职业苦难,直到最近才知道是过敏反应引起的“面粉”组件。噬菌体展示被用来确定一个因果代理在小麦面粉本地麦胶蛋白(33%的病例),更具体地说,- - -在12%的醇溶蛋白,因果贝克的哮喘81年]。使用这样的抗原决定基显示准确识别因果代理食物过敏,一旦确定,可以调查的主题,旨在使其更少的抗原。这种方法已被用于一个项目旨在减轻过敏反应在腹腔疾病。
腹腔疾病(或腹腔)影响大约1%的人口(82年]。由组件在常用的几种谷物存储蛋白质(面包、意大利面、啤酒)。它是一种复杂的疾病方面的自身免疫性疾病和食物过敏(83年]。自身免疫反应,组织转谷氨酰胺酶(tTG)酶self-antibodies的目标只有与谷蛋白(蛋白摄入当tTG是包裹后84年,85年]。丰富的谷氨酰胺残留酶脱氨基,可以组成~ 35 - 40%的氨基酸构成醇溶蛋白的组成部分谷蛋白(86年]。抗体也专门生产对tTG-deaminated麦胶蛋白片段面筋,食物过敏的一个标志87年]。
方法来缓解疾病的症状包括试图阻止部分使用合成醇溶蛋白,高亲和性肽,从而防止tTG行动/麦胶蛋白改性和随后的免疫刺激性抗原表位的形成。噬菌体展示发挥了关键作用的识别对麦胶蛋白肽具有很强的亲和力。这些行为抑制tTG活动对麦胶蛋白底物在体外位阻,最终目标是削弱自身免疫反应减少协会酶底物,减少炎症在活的有机体内(88年]。这个程序的第二步是醇溶蛋白的抗原表位,掩蔽的蛋白质片段抗体绑定到他们(89年]。这个项目已经通过了第一个在漫长的几个障碍为乳糜泻患者提供让人感到些许欣慰,包括证明合成肽行动阻止tTG活动对麦胶蛋白一样他们基于phage-tethered肽,它并不一定遵循[90年]。程序的等待试验确定gliadin-binding肽在活的有机体内。除了潜在的治疗用途,各种肽,醇溶蛋白蛋白质绑定到不同的网站,(89年)可以为该领域的研究人员提供有价值的工具乳糜泻。
2.4。噬菌体展示识别蛋白质Isoaspartyl甲基转移酶底物的储存种子蛋白质组
醇溶蛋白谷氨酰胺残基的tTG-mediated变更,通过脱酰氨基作用,增强醇溶蛋白的抗原性片段(91年]。蛋白质存在于干种子尤其容易受到一系列非酶的转换,其中许多是有害的92年- - - - - -99年),其中一些可能发挥作用在准备完成萌发的种子在补液(One hundred.]。无论如何,这些转换也可以导致肽被人体免疫系统或顽固的水解。例如,自发isoaspartyl形成是已知的导致自身免疫反应(101年和干扰肽降解102年)减少摄入种子产品的营养价值(103年),如果足够广泛的存储蛋白质组,将是灾难性的萌发和幼苗建立(104年,105年]。
正统的种子(27)有能力极端脱水允许他们继续生存在极端的温度106年,107年),在某些情况下,几个世纪以来28,29日]。这非凡的成就意味着种子蛋白质组是有害的风险变更为整个这一次没有足够的水给修复效果。著名的转换是有害的改变L-Asn或L-Asp残留蛋白质琥珀酰亚胺,在水,通常将不同寻常,未编码的氨基酸,L-isoAsp [108年- - - - - -111年]。在花季,isoAsp蛋白质被公认,甲基化,修复蛋白质L-isoaspartyl甲基转移酶(PIMT) [112年,113年]。
最危险的蛋白质是isoAsp PIMT的形成或有亲和力最高?由于不稳定的本质标记isoAsp和易感性的蛋白质形成isoAsp期间严格的提取必须获得样本,这些标识没有肤浅114年- - - - - -116年]。此外,丰富和容易损伤的种子贮藏蛋白质93年]使识别额外的PIMT目标蛋白质利用种子的提取物困难(116年]。
噬菌体展示使用另一种方法来缓解蛋白提取的影响的一代isoAsp虽然很大程度上去除种子贮藏蛋白质的分析(117年,118年]。一群蛋白质参与方面的翻译被发现是重要的基质PIMT种子。这导致了实现存储蛋白质必不可少的平移装置必须从一般障碍保护尤其重要,因为没有替换它们的手段(或任何其他蛋白质)或存储新创产生的转录组如果翻译是妥协在大多数细胞组成的组织和/或细胞器(119年,120年(图)出现在细胞2)。
2.5。噬菌体展示识别晚期胚胎发生客户种子中蛋白质丰富的蛋白质
恢复的目标之一,biopan PIMT1和不直接参与翻译是种子成熟protein1 (SMP1;At3G12960) (PF04927)包含了SMP晚期胚胎发生丰富(LEA)大豆蛋白同系物(大豆SMP,通用汽车PM28 (Glyma08G18400)。LEA蛋白(121年,122年)被认为帮助低湿休眠(没有水的生活),许多微生物的一个属性,地衣,一些动物和植物(123年- - - - - -136年]。这个特质支撑了几千年来农业(137年,138年),允许每个种子收获的一部分被扣留,脱水,因此,抵抗病原体的攻击,并建立第二作物,随后一年或未来几十年(139年]。
LEA蛋白的复苏PIMT1是有趣的,因为它可能表明这LEA蛋白需要保护从isoAsp形成PIMT1保留其功能,形成一个互动的网络的一部分蛋白质的保护机制现存的种子。本文分别插入突变体的LEA在两个不同的拟南芥间无法进入二次休眠种子暴露时supraoptimal (40°C)萌发温度前几天被放置在允许温度(25°C) (117年]。特定表型的表现失去这样的LEA的功能建议它维护的重要子集蛋白质参与环境条件下种子的蛋白质组内存后迄今为止经历了自吸(supraoptimal温度)。高温和/或干燥一段时间后的自吸重要环境因素被认为和转录组和蛋白质组改变相应的,但之前根突出,将使它所代表的蛋白质组和集成环境信息有害的条件。这需要保护机制被调用以确保heat-stressed /脱水蛋白保留其功能以便萌发恢复适当的时候它离开一旦种子水化(140年]。Dubrovsky [30.]指的能力恢复萌发的种子点他们进展脱水前作为“种子水化记忆”(图1(b))。
LEA蛋白保护环境因素的概念,获得了花季时期,体现在热敏蛋白质组,可以并入他们的角色帮助的生存在成熟干燥失水,静止或吸入后(141年,142年]。一些heat-labile分子的功能障碍(s),不受SMP1保护时,结果在种子,不能“记住”supraoptimal温度它经历了因此行为不当,完成萌发时立即删除25°C而不是进入热休眠(图1(b))。
有必要确定与目标蛋白质SMP1 LEA蛋白的同事,因为这些将候选人控制二次休眠的诱导由于高温(117年),但这是不知道。事实上,不确定性关于LEA蛋白是否存在服务专门一般“垫片”分子(“分子盾牌”或克劳德)只是防止有害聚合在失水或如果他们能充当保护者特定的个人目标分子所谓“客户分子”(143年- - - - - -145年]。因此,重组SMP1和大豆通用汽车PM28同族体被用作诱饵在两个不同的温度和屏幕有两个独立产生的拟南芥种子,噬菌体展示库(146年]。,biopan这些重组LEA同系物证明蛋白质相同的客户,甚至同一地区同一蛋白质的客户,一直都检索鱼饵在两个不同的温度146年]。客户端蛋白质识别没有单个靶蛋白与PIMT1屏幕,然而那些参与翻译中又突出保护目标蛋白质进一步巩固竞争保护蛋白质参与翻译至关重要维护正统的种子的寿命(图2)。
3所示。结论
可怕的后果的预言人类如果食品(种子)生产不大幅增加是研究人员调查种子生产的刺激努力理解这个事件的复杂性。经常了解寻求位于protein-ligand或蛋白质交互的水平。在这方面,噬菌体展示已经被证明是非常有用的发现这些相互作用及其后续操作结束。本文强调,第一次,噬菌体展示的影响对农业研究关心的种子产量。努力保护作物植物的种子生产能力种子和保护自己独家人类使用/消费已经成功地使用噬菌体展示。噬菌体展示的辅助酶的生产专门用于食品加工,使营养更容易获得。它还提供专门的方式确定种子的因果代理(s)过敏,和迹象表明,它可能是仪器提供的第一个手段减轻seed-related疾病的影响突出。噬菌体展示的使用允许见解种子内生的自然保护和修复机制,允许一个更根本的理解事情在胚胎发生后期,静止,和萌发;简而言之,使种子如此优秀的繁殖体。
确认
本项目部分由一个NSF IOS(0849230),孵化,McIntire-Stennis (AD421短剑),美国农业部种子格兰特(2011 - 04375),ABD和弗雷德里克·麦克马斯特爵士研究奖学金。