文摘

应力松弛和结构分析是用来研究纬向分化综合cartilage-on-bone组织的微观结构对压缩系统。15 cartilage-on-bone样本分为三个组,其应力松弛反应得到三个不同水平的轴向压缩应变定义为低(~20%),中等(~40%)、高(~60%)。所有测试使用一个通道进行硬度计压头包括一个中央救灾空间设计来捕获的响应矩阵直接加载地区毗邻。每个应力松弛测试完成,同时保持施加轴向应变,样本福尔马林固定、脱钙,然后分段进行微观结构分析。Chondron纵横比被用来确定在不同区域深度相对紧张的程度。软骨的应力松弛反应定义的所有三个水平的轴向应变显示初始高度粘性响应紧随其后的是一个重要的弹性响应。Chondron长宽比的测量表明,压缩、最低水平的轴向变形仅限于表面的软骨层,而在中、高轴向应变变形扩展到midzone样品。细胞深区仍未变形的压缩级别。

1。介绍

软骨细胞外基质主要是大量水分蛋白多糖大分子约束在一个词意胶原纤维网络。组织抵制load-induced变形通过功能耦合产生的一种内在的刚度之间的high-swelling蛋白聚糖和制约纤维网络,这引起的流体流动阻力通过其超低渗透率结构。这些贡献一定是集成在矩阵应用负载响应。添加另一个级别的复杂性是纬向软骨的分化结构矩阵。关节面层平面布置的原纤维直接创建一个strain-limiting上层,通过过渡区,融入了径向中期和深区。这深区域集成结构通过区软骨下骨的钙化软骨。软骨的载荷包括整个纬向分化的结构体系的变形响应包括流体的运动组件。这样的复杂结构系统将如何应对,以纬向综合的方式,加载仍未开发。

有一些已发表的研究有助于提高我们对软骨的微观结构是如何响应的理解压缩。的研究与深度有关的回应的软骨力学加载显示,随着压缩应变,应力松弛收益有所减少(1),平均表观弹性模量显著增加(2,3]。在pericellular和细胞水平崔et al。4]表明,软骨组织压缩导致不同chondron下降高度在切向,中期和深区。最高的菌株被发现出现在切向区,其次是较小的数量在中期和深区,和水平增加的这些变化增加矩阵压缩(4]。

软骨硬化的增加随着压缩,加上变形与纬向深度的变化,是软骨力学的造型的意义。使用两相的模型王et al。5)模仿这样的不均匀性,展示了与深度有关的软骨刚度矩阵的变化导致了相应的应力变化,压力,流体速度和流体压力场。然而,模型的升值,在物质方面,在某些方面的限制程度矩阵变形可能可视化,或者身体内发生流-固耦合理论框架。例如,与软骨压缩,固体矩阵strain-level-dependent显微结构的响应(6)流体通过减少基质渗透率水平位移(1),和负载分布远离直接压缩区域(7),一些有趣的物理现实存在重大挑战的分析员在达到一个真正准确的表示软骨力学。一些解决这些挑战可能实际与深度有关的结构响应的组织可以确定,特别是在与载荷分布的方式。最近的进展目前作者试图解决这个structural-mechanical问题。

迄今为止,两个实验程序,对这个问题有明显相关性的软骨基质及其耦合流体响应变形(8,9]。首先是cartilage-on-bone样品的压缩状态的方法被使用化学固定、脱钙作用和结构分析使用微分干涉对比显微镜(DIC)。这种光学技术允许完全水化部分成像分辨率层次的结构,是高度信息关于矩阵变形的模式(8]。第二是使用压缩硬度计压头将中央通道创建两个不同的网站结构,即直接加载区域和一个间接加载通道内的救援区域发展空间(10]。矩阵变形模式的分析在这两个网站提供了新的可能性为研究流体从流量影响,基质渗透率、纤维互连,strain-limiting切向层的作用。

在这个新的研究中,我们利用前面的实验技术研究与深度有关的回应的cartilage-on-bone应力松弛后压缩。为了关联物理力学行为,一个简单的应用程序的一个粘弹性模型被用来量化软骨的应力松弛反应然后相比,其显微结构的变形。

2。材料和方法

2.1。样品制备

15健康牛以及髌获得2-3-year-old '牛牛被屠宰后收集并存储在−20°C。每个样品制备髌骨解冻冷自来水,和软骨表面沾墨汁确认没有表面不规则或裂缝11]。cartilage-bone块与在面对锯了~ 14×14毫米的尺寸从每个distal-lateral象限同时仔细选择一个最优平面区域。每个块包含完整的软骨和软骨下骨~ 6毫米厚度提供完整的加载支持。每个的四方块细碎的水下60-grit碳化硅和成像低倍镜下确定平均软骨厚度。块在0.15盐水就平衡了两小时之前加载,然后获得一个定制的不锈钢支架与牙科水泥。

2.2。加载协议

所有加载执行使用特殊设计的不锈钢抛光平底硬度计压头组成的两个平面mm面临隔开一个通道1毫米的空间和通道3毫米的高度。其他的细节描述了这个硬度计压头(10]。英斯特朗5543材料试验机是一种用于样品的应力松弛实验进行沐浴在0.15盐水。使用了三个不同的加载/弛豫过程如下(图1)。

过程1。5个样本压缩至20%应变在这个常数1 mm / s和维护状态,直到这个表示的应力状态是达到强迫时间曲线(所需时间,~ 30分钟)。

步骤2。五个样本加载过程1,然后建立这个后,另有20%应变加载在1毫米/秒,在这个国家,直到一个新的这个应力状态是达到(约45分钟)。

程序3。五个样本加载过程2,紧随其后的是第三个添加水平的20%的压缩应变,在这个国家,直到一个新的这个应力状态是达到(约60分钟)。

为了避免软骨破坏,三步加载应用。在初步测试直接加载到40%,1毫米/秒的速度,导致分裂软骨表面。因此3步加载协议,没有可观测软骨损伤发生在株高、深层组织压缩得到可靠地为了研究与深度有关的反应。

每个加载协议后,已经达成之后,这个压力(1),盐浴取代10%福尔马林和样本固定~ 12小时的变形状态。

2.3。光学显微镜

后加载/前面描述的固定程序,每个样本用冷水清洗以去除多余的福尔马林,然后温和的脱钙在10%甲酸解决方案3天(解决方案改变了日报)促进骨软骨地区的分节(8]。样品终于在寒冷的自来水冲洗30分钟。

中央径向切是通过每个脱钙骨软骨样例获得完整的横断面的直接和间接加载矩阵,结合渠道地区和更广泛的软骨连续。使用二次破碎样本然后速冻cryo-sectioned切片机获得10 ~ 30μ米厚的冷冻骨软骨部分接近于原始径向切。这些部分被湿安装在盐水在载玻片盖玻片下并使用(DIC)光学显微镜检查。后看多个串行部分,确认他们的一致性,一个典型的部分代表每个样本放置一边,共有15个代表薄切片。

2.4。变形场的分析

与我们之前的工作(8,9的软骨细胞是利用标记来捕获的变形响应矩阵。整个原纤维取向已被证明是与软骨细胞的长轴(12,13]。因此,通过映射的连续性软骨细胞内普遍原纤维取向的变形。纤维的进一步确认安排获得通过使用高分辨率的DIC。虽然个别纤维光学分辨率,他们倾向于聚合成更大的包生成一个定向微丝性,又反映了整体纤维组织(14- - - - - -16]。

变形的模式进行分析的概要文件和取向的变化行软骨细胞的连续性。Chondron纵横比(图2)测量上,中期和深度区域的软骨矩阵和直接压缩和通道救援区域的确定对带状矩阵压缩深度的差异。所有长度测量数字图像导入图像J数字图像处理软件。

2.5。应力松弛行为的分析

名义应力块得到的加载实验。峰值和平衡压力得到每个曲线及其比率计算。瞬时刚度响应被用来估计初始模量(MPa),作为初始计算(最大)应力除以(常数)施加应变(低、中、高)。

一个简单的麦克斯韦模型被用来量化放松反应如下: 常数””是峰值应力之前放松开始,也就是说,和恒应变,,“”是一个时间常数决定的衰减速度压力。

确保满意的麦克斯韦方程与实验数据之间的相关性都松弛曲线分为初始和随后的响应(参见代表曲线在图3),第一个代表快速压力衰减(粘性)和第二个放松反应慢得多(相对弹性)。因此,每个曲线近似与两个方程和两套参数,(MPa和秒,职责)。曲线适合从每个测试获得的数据应用手动;观察者在excel中使用“趋势线”功能检查时关系将产生的值在每个区域至少0.9。

这里应该强调我们的就业的简单的麦克斯韦模型并不代表复杂的力学行为为目的的软骨。相反,它是利用实用和方便量化潜在的机械特性的差异,特别是关于弹性和粘性响应。

2.6。统计分析

三组数据编译为每个低,中,高应变水平(即就业。低,中,高)。描述的参数,分析上面的变形场和应力松弛行为,比较,差异之间的平均值三组测试意义(使用非参数Mann-Whitney统计分析)。

3所示。结果

3.1。机械的反应

一个典型的三级加载配置文件,覆盖低,介质,和高应变水平,如图4。低应变水平测试平均初始模量为16 MPa(标准偏差),5 MPa)。平均初始模量中、高水平的压力明显增大了约175%和44%,分别为(见表插图图3)。期间的平均峰值应力达到中等水平压缩应变也明显大于获得的应变水平低了170%。的增加意味着在高应变峰值应力水平高出47%,达到在中等应变级别。

放松对所有测试最后这个压力为0.2 MPa (SD, 0.09 MPa), 0.6 MPa (SD, 0.23 MPa)和1.8 MPa (SD, 0.65 MPa)低,介质,分别和高度压缩应变水平。这三个平衡值等同于增加平衡的压力~ 200%之间水平测试。

添加了每个组件的压力平衡压力峰值的比值显著降低(表插图图3)。从低到中等应变水平这一比率降低了~ 22%,并从中等到高应变水平降低了~ 53%。

每个应力松弛曲线分为两个区域定义初始和结束反应,这样拟合麦克斯韦模型将产生相关的值在每个区域(图至少0.93)。这些地区主要被用来近似粘性快速响应(应力的衰减率)和主要弹性响应(应力的衰减速度慢)。从曲线拟合获得常数(表插图在图所示3)。

粘性地区显著增加(剪切或刚性模量的指标)从低到中等和中上等水平应变的145%和52%,分别。弹性的地区总体低于粘性区域,并增加133%和86%低到中等和中上等水平的菌株,分别。放松的时间在弹性区域明显大于粘性地区。他们也显著增加低到中等和中上等水平的菌株在粘性(198%和93%,分别地。)和弹性区域(167%和69%,resp)。

3.2。形态的反应

chondron方面比在未变形的软骨切向和midzones最高和最低深区(图5)。chondron方面比在切向层显著增加应变水平约60%。DIC的图像宽高比的增加更大的结果减少chondron的短轴(见图6)。

midzone矩阵,只有中等和高水平应变产生显著变化chondron纵横比(数字5和6)。这些变化导致高度的减少加上横向膨胀一起给纵横比小于65%的卸载。与未变形的矩阵表示,比较直接加载深区矩阵没有显著改变菌株的各级chondron长宽比(数字5和6)。

通道救援区(图7为每个应变水平)表现出不同的形态。特别是矩阵挤压(即水平。,the extent of bulge formation) increased progressively with increasing strain. The transition from the directly loaded region to the channel relief zone revealed the extent of shear for each strain level (Figure8)。在低应变水平剪切边界(见虚线图8(一个)- - - - - -8 (c))仅限于通道救援区域,而在中、高应变水平的边界扩展到直接加载区域(见虚线图8)。在中等应变级别直接加载地区剪切边界位于靠近关节面,而在高应变水平形成更大的深度(比较图8 (b)与8 (c))。

的高应变也显示样品两套斜交叉剪切带(~ 45°)隆起地区(图9(一个))。重要的是,这些斜带叠加在强烈的径向流行”(见白色箭头指向曲线线条图9(一个))表明矩阵从深区径向和横向运动双方的直接加载区域。obliquely-directed线之间有轻微的横向乐队周期约10μm。在较高放大这些小乐队被显示的结果重复波峰径向纤维表现出一个同相褶(数据9 (b)和9 (c))。软骨细胞在这些小乐队被严重扭曲的(图9 (d)),这种扭曲消失在不同的剪切带边界定义的终止(见插入图10)。

直接加载区域和救济之间的区域有一个有趣的观点融合三个对比变形字段(图11)。以前称为“三相点”10]这一独特的变形模式也显示如何突然剪切之间直接加载区域内以及直接和间接加载区域加载(指区域X, Y,和Z在图11)。

4所示。讨论

本研究旨在整合关节软骨的两个重要特征,即其纬向相关的微观结构对加载和非线性应力松弛行为。当我们使用一个简单的麦克斯韦模型来描述的应力松弛行为cartilage-on-bone应该注意,更复杂的理论模型,例如那些由阮和Oloyede [17),Julkunen et al。18),李et al。19),和棕色等。20.),试图提供一个更全面的软骨力学。通过集成机械和结构响应我们的目的是探讨关节软骨的复杂微体系结构如何影响其承载的行为。

我们的数据表明,有一个depth-related机械反应,这样不同层次的快速压缩后的应力松弛可以与微程序级的变形模式。微观结构图像表明,在低压力只有切向层参与抵抗变形,同时增加压力从低到中等陪同导致增加刚度,结构,可见订婚的mid-zone矩阵。与所需的额外压力增加介质的应变水平高,下一个矩阵影响的地区是位于主要是横向和间接加载地区,从强烈的剪切带形成明显的通道救援区(图8 (c))。

相比之下,深矩阵变形,chondron方面表示的比率,仍相对冷漠各级压力。这样的解释,然而,有限的一项研究发现,报道再菌株之间的非线性关系和局部细胞外基质(ECM)株(4]。具体地说,它是发现,在高当地条件ECM菌株明显细胞似乎低于ECM (4]。因此,因为ECM菌株没有测量在目前的研究中,明显缺乏chondron变形深区可能并不真正代表矩阵变形。然而,根据硬度计压头下的变形场的观测特征(图8),有一个渐进的横向分配的应用压缩负荷增加径向深度,这进步的压力衰减增加径向深度可能是一个重要因素缺乏深度测量变形的区域高水平的压力。

像预计的那样,组织膨胀减压区更明显的中、高应变水平相比,在最低的压力。然而,凸起曲率之间没有显著改变介质和高应变levels-rather斜的强度增加,counter-oblique剪切带形成后者。这表明,尽管表面的最大应变效应限制在抵抗变形可能已经达到中等水平的压力,越来越多的矩阵整合上面这个介质应变水平涉及更复杂的变形模式(见图8)以及相对突然的剪切断层形成的“三相点”矩阵变形模式(见图11)。

值得注意的是,这种“三相点,”位于直接加载区域附近的边缘通道空间,包含一个不同的剪切不连续上部和更深层次的区域之间曾被证明产生的“人字形”模式在矩阵压缩变形诱导(8,16,21]。在相同的三相点有一个融合的三种不同的软骨细胞排列(见区域X, Y,和Z在图11)造成雪佛龙变形场会议在减压区径向排列矩阵。这个融合产生的剪切带是最强烈的剪切存在不连续的地方上凸出部分的矩阵。此外,剪切带的形成,主要发生在中期更深层次的区域矩阵(图9),是一个明确的迹象明显的横向互联互通的纤维结构有助于限制上升流的程度的组织救援区域,同时促进侧软骨内的负荷重新分配矩阵。

重要的是太明显的横向分配负载之间的关系为不同的应变和应力松弛的反应水平。在所有三个预定应变水平使用,因为使用的相对快速的加载(1毫米/秒),软骨的最初反应矩阵近似瞬时附近流体flow-independent弹性行为。应力松弛的初始阶段,即粘性响应(见图表图12)将实现通过约束矩阵的流出液通过最初最大限度水合胶原蛋白/蛋白聚糖网络。重要的是这种外流是通过流体的侧向位移的硬度计压头是无孔的,不同级别的矩阵所示的侧向变形的微观结构数据。水平增加的压力,矩阵变得更紧凑的渗透率降低,这将占增加弛豫时间()记录的粘性阶段应力松弛的反应。

通过增加应变水平从低到中等高,软骨矩阵逐步巩固,和粘性响应相应减少,直接固体承载增加。这就解释了为什么在最低压力水平有一个较大的粘性响应没有任何检测mid-to-deep区矩阵变形。因此,很可能最后这个压力在低应变水平反映了主要是矩阵产生的膨胀压力增加蛋白聚糖的浓度与最低的应变状态。相比之下,在最高压力平衡压力的测量大多near-consolidated固体的弹性阻力矩阵,也就是说,一个可移动的流体的大部分已被删除(22]。平衡压力较低的菌株可能因此被利用作为一个指示器的内部肿胀的潜力和因此可能有用的评估矩阵变化与退行性变的早期阶段有关。这些早期的改变将包括损失的完整性水合蛋白聚糖组件和减少他们的截留效率与原纤维destructuring如前所述的扫帚et al。23]。

应力松弛的第二阶段,即相对弹性反应?提出第二个放松阶段代表的粘弹性响应日益巩固“固体矩阵”进行变形由于流体位移到间接加载区域(图13)(在此上下文中使用的术语“固体矩阵”是指固体组件(主要是胶原蛋白和动力分配和任何仍然剩余流体压力盛行的这个)。这样的解释比较支持从封闭压缩应力松弛反应使用多孔硬度计压头(如使用Soltz Ateshian, 1998)与无侧限压缩使用无孔隙的硬度计压头(例如,在目前的研究和使用24])。应力松弛曲线Soltz和Ateshian报道25)没有显示第二阶段弹性响应,而麦克拉的反应等。24)非常类似于目前的研究。这种差异在应力松弛曲线响应可以被归因于一个局限与nonconfined测试协议,在后者,横向流动的流体可以发生到周围的矩阵。麦克拉et al。24)也比较健康和退化软骨的应力松弛反应和显示矩阵退化第一粘性迅速放松的阶段发生,其次是第二个弹性阶段表现出最小压力随着时间的推移进一步衰退。

活跃的流体流动过程当然不能想起,只有他们的后果导致这个州被化学固定这个加载状态。然而,我们的“通道硬度计压头”实验提供了一种方法捕捉形态之间的复杂的相互作用结构,机械反应,cartilage-on-bone系统中的流体流动。实际上通道空间允许软骨在其不同的带状区域变形的方式管理完全由限制(我)strain-limiting切线区,(2)软骨下的锚固板,(3)纤维网络的互联互通,并(iv)内在肿胀可能限制在一个可变形的纤维网络。

最后,许多当前的计算基于模型的软骨结构简化所需的程度是有限的。希望我们的显微结构的发现,直接链接到可测量的机械反应,将有助于软骨的持续发展模型,结合更高程度的结构现实主义。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢提供的慷慨资助伍尔夫费舍尔和莫里斯和菲利斯Paykel信任、叉骨信托(NZOA)和马斯登基金(RSNZ)。杰西卡·戴利和Geran张也承认实验贡献。