文摘gydF4y2Ba
分形维数分析(FDA)是现代数学方法广泛用于描述复杂和混乱的经典方法失败时的形状。本研究的主要目的是评估的影响光动力疗法(PDT) cystein蛋白酶抑制剂(CPI)在肿瘤内血管的数量和形态增加的联合疗法的有效性与PDT和CPI分别使用。动物被分为四组:控制,只使用PDT治疗,治疗仅使用CPI和使用联合疗法治疗,PDT和CPI。结果表明,动物生存时间和深度内的坏死肿瘤明显高于CPI + PDT组与其他组。价值更高的分形维数(FD)在对照组,而最小值被发现在该集团由cystein蛋白酶抑制剂治疗。FD之间的差异观察CPI组和PDT + CPI组与对照组相比。我们的研究结果表明,分形维数分析是一个非常有用的工具在评估差异不规则形状像血管PDT治疗肿瘤。因此,FDA的实现算法可能是有用的方法在评估PDT的功效。gydF4y2Ba
1。介绍gydF4y2Ba
负责肿瘤生长的重要因素之一是血液供应。许多研究显示,肿瘤血管的解剖和空间结构比正常组织的混乱。分析血管的经典的方法之一是在光学显微镜直接计数。免疫组织化学染色是非常有用的对特定蛋白在血管壁内,例如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)集群的区别,如CD34等(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。许多研究表明,PDT负责VEGF的过度gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。然而,在如此复杂和混乱的情况下形状的肿瘤血管的经典方法评估可能会失败。分形维数分析在这些情况下可能非常有用。分形是一个形状描述可能简单的数学公式。如果这些公式迭代到无穷他们可能创建形状,我们可以放大没有结束,每一次我们可以看到无穷多的形状将洗钱是一个自相似特性。分形康托尔的集合的经典例子,科赫雪花,Sierpinski三角形(见图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
许多自然分形形状非常相似,例如,海岸线,树木,云彩,支气管和血管网络。任何上述结构构成fractal-self-similarity的主要特征。理想的工具来描述分形是分形维数(FD)。分形维数是一个形状指数,特别是它可以被定义为一种形状不规则的物体。不规则形状和行为是共享的所有的生物,包括解剖、系统。在欧式几何维数是整数,例如,0是一个一个点的维数,一个数字特征线,两个维度构建了一个表面,最后三个维度创建一个空间。分形是一个数学形式维度值之间的范围是0到3没有0,1,2,3。分形是点之间的中间形式和三维对象。FD的价值越低就越普通的形状。gydF4y2Ba
光动力疗法(PDT)是众所周知的方法治疗癌症和癌的病变。它包含两个主要代理:光和光敏剂。光敏剂在光的影响下可能诱发许多光化学反应细胞,导致细胞凋亡,坏死和自噬gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。有很多修改的PDT可增加其效率,例如,电穿孔,磨皮或封装成脂质体(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。所有上述修改增加积累光敏剂的组织。其他方式修改可以与半胱氨酸蛋白酶抑制剂PDT的组合(CPI) (gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。半胱氨酸蛋白酶家族的酶参与到传播的过程中恶性肿瘤(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
本研究的主要目的是评估的影响与CPI PDT的数量和形态的血管,增加综合疗法的有效性与PDT和CPI分别使用。为了验证这个假设,我们用分形维数分析。我们应用免疫组织化学,因为彩色antibody-antigen反应提高血管的可视化标准相比他染色。我们也旨在评估是否PDT结合CPI可能会增加肿瘤坏死的深度和生存时间的动物。gydF4y2Ba
2。材料和方法gydF4y2Ba
2.1。动物gydF4y2Ba
一百二十名女性Wistar鼠(中等重量- 200 g) 3到3岁5个月被分成四组每组大鼠(30)。实验在弗罗茨瓦夫经当地伦理委员会批准。gydF4y2Ba
2.2。肿瘤gydF4y2Ba
乳固体腺癌(gydF4y2Ba腺癌solidum mammaegydF4y2Ba)从肿瘤学研究所获得格利维策,波兰,这是植入皮肤下的悬浮在卷1厘米gydF4y2Ba3gydF4y2Ba肿瘤细胞的0,9%的氯化钠。的网站植入了腹部。gydF4y2Ba
2.3。光敏剂gydF4y2Ba
氯e6(美国前沿科学,Inc .)获得了以晶体形式,这是溶解在0 9%氯化钠碱性0 05 M氢氧化钠。光敏剂是应用于腹膜的剂量10毫克/公斤体重。gydF4y2Ba
2.4。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)gydF4y2Ba
CPI是一种礼物从y萨利赫的生物化学博士,弗罗茨瓦夫医科大学。对匀浆提取CPI的人类胎盘。抑制剂被色谱纯化方法。净化和消毒剂溶解在0 9%氯化钠,500年应用皮下注射gydF4y2BaμgydF4y2Bag每鼠剂量。gydF4y2Ba
2.5。免疫组织化学gydF4y2Ba
切除肿瘤后固定在4%福尔马林,嵌入在石蜡块,使用切片机切成5gydF4y2BaμgydF4y2Ba米厚片,使用抗vegf抗体染色(美国σ)和anti-bFGF抗体(σ,美国)。可视化这些生长因子通过使用Vectastain ABC工具包(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)和以下说明收到供应商的工具。在我们的研究中我们使用1:50 VEGF和bFGF的浓度。VEGF的表达和bFGF估计血管内皮细胞通过两个独立的病理学家。gydF4y2Ba
2.6。光源gydF4y2Ba
使用卤素灯照射了,五灯(瑞士·)使用内置654波长带通滤波器gydF4y2Ba20 nm和总能量剂量−150 J /厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
2.7。治疗方案gydF4y2Ba
控制第一次天:肿瘤植入;第五天:测量肿瘤坏死。gydF4y2Ba
集团使用PDT治疗(PDT)这一天:肿瘤植入,第二天:应用剂量的氯e6 10毫克/公斤的体重,第三天:辐照,第五天:测量肿瘤坏死。gydF4y2Ba
集团被使用消费者价格指数(CPI)这一天:肿瘤植入,第二天:500年cystein蛋白酶抑制剂的应用gydF4y2BaμgydF4y2Ba每个动物g剂量,第五天:测量肿瘤坏死。gydF4y2Ba
使用PDT治疗和CPI分组(PDT + CPI)这一天:肿瘤植入,第二天:500年cystein蛋白酶抑制剂的应用gydF4y2BaμgydF4y2Bag剂量/动物,第三天:应用剂量的氯e6 10毫克/公斤的体重,第四天:辐照,和第五天:测量肿瘤坏死。gydF4y2Ba
在第五天,每组分成两个相等的子组。在第一组动物使用致命剂量的bioketan牺牲。在尸检样本肿瘤,肺,肝脏和肾脏被带到显微镜检查。gydF4y2Ba
动物从第二组都为了生存的时间估计。对于死亡的动物尸体解剖进行使用相同的协议在第一小组。gydF4y2Ba
2.8。坏死深度的测量gydF4y2Ba
显微镜幻灯片使用标准hematoxylin-eosin染色方法和明年他们评估光学显微镜(奥林巴斯BX40) 200年x放大。坏死的深度测量使用目镜格。gydF4y2Ba
2.9。评价血管的数量gydF4y2Ba
血管数量计算显微镜玻片上染色使用anti-bFGF和抗vegf抗体。我们选择随机幻灯片10肿瘤从每组(从10动物)。我们清点的数量在五个领域的血管放大视图的400 x和明年我们计算这五个领域的平均数量。gydF4y2Ba
2.10。统计分析gydF4y2Ba
每一个执行统计分析使用Statistica版本6.0 (StatSoft Inc .)。假设被验证在0 05显著性水平。由于缺乏正态分布我们使用非参数Kolmogorov-Smirnov测试。gydF4y2Ba
2.11。分形维数分析(FDA)gydF4y2Ba
我们使用计算机程序Fractalyse版本2.4 (gydF4y2Bahttp://www.fractalyse.org/gydF4y2Ba)。在GIMP版本2.4.7执行任何图形操作。Fractalyse软件使测量使用计盒分形维数的方法。分形维数(gydF4y2Ba)使用下面的公式计算gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]:gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba分形维数,gydF4y2Ba盒子的长度创建网格覆盖表面检查模式,gydF4y2Ba要求的最小数量的盒子盖检查模式。gydF4y2Ba
显微镜幻灯片使用vegf染色或anti-bFGF抗体检查使用100 x放大和血管的显微图gydF4y2Ba点解决。接下来,显微图转换成二进制白人和黑人格式。我们应用拉普拉斯滤波器使用矩阵如下所示:gydF4y2Ba 有必要使用拉普拉斯滤波器因为这个滤波器是能够产生非常精确和薄的血管轮廓gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。毕竟这些过程的显微图血管进入Fractalyse计划估计分形维数。gydF4y2Ba
3所示。结果gydF4y2Ba
3.1。各种治疗方法对生存时间的影响gydF4y2Ba
图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示每组的平均生存时间。对照组的平均生存时间是24天。最长存活时间观察组中由PDT治疗和CPI在一起,也就是说,53天。治疗组动物仅使用一个方法(PDT或CPI分别)的特点是类似的生存时间,也就是说,43天。每组的平均存活时间与对照组相比有统计学不同。gydF4y2Ba
表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示的比例完全治愈(完整的反应)每组动物。动物被视为完全治愈存活时间65天或更长时间时,没有发现明显的肿瘤。比例最高的治愈率在PDT + CPI组,也就是说,33岁的33%。PDT组达到13日33%,CPI组中这一比例只有67%。在对照组中没有一个动物存活65天或更多。gydF4y2Ba
3.2。各种治疗方法对坏死的影响深度gydF4y2Ba
图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba显示了平均深度内的坏死肿瘤。价值最低的是观察对照组(5毫米)。单独应用PDT和CPI增长坏死引起的深度(PDT 9、20毫米和80毫米的CPI)。这些值与对照组相比明显不同。没有统计学差异的群体PDT和CPI分别被应用。最高的价值(87毫米)的坏死指出深度由PDT治疗组和CPI在一起。gydF4y2Ba
3.3。各种治疗方法对血管的分形维数的值gydF4y2Ba
图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba显示了血管的FD的价值。在对照组更高的价值,也就是说,1135年价值最低的是组中观察到由cystein蛋白酶抑制剂治疗(0933)。FD之间的差异在CPI与对照组相比,观察组和PDT + CPI组(0982)。PDT组的分形维数是1037。gydF4y2Ba
表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示血管与分形维数的平均数分析。最低数量的船只是在对照组(10为bFGF VEGF和8)。更高数量的血管观察PDT组VEGF和bFGF 15(17)和PDT组+ CPI bFGF的VEGF和12 (18)。gydF4y2Ba
4所示。讨论gydF4y2Ba
我们的研究结果显示,光动力治疗结合cystein蛋白酶抑制剂会导致增加治疗相比其他方法的有效性。更高的有效性与CPI PDT导致动物生存时间更长、更深入的坏死肿瘤。相结合的尝试cystein蛋白酶抑制剂的光动力治疗似乎是合理的和积极的协同效应观察在我们先前的实验(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
光动力治疗的整个机制还不清楚。旁边的破坏细胞因其光毒性反应,PDT影响血管。肿瘤内血管非常重要目标肿瘤破坏的方法。许多研究表明之间的时间应用光敏剂和辐照损伤中发挥着关键作用。大鼠软骨肉瘤,血管中实现组内重大变化后辐照5和30分钟静脉benzoporphyrin导数的应用。在一组180分钟后辐照病理病变血管内不太密集的(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。血管网络的特点是高度复杂的空间安排。欧几里德几何,因为它适用于线性和常规形式,不应该应用于生物对象,他们的一个最重要的特性是不规则的形状。血管网络可能大致认为是分形。大多数的自然形状类似于分形。树木,云彩和神经元网络是很好的例子。分形维数描述这样的形状是一个非常有用的参数。许多研究显示显著差异在FD之间正常和肿瘤组织的价值或低品位和优质的肿瘤。这种依赖的例子是低级的区别血管平均FD肾癌(gydF4y2Ba)和高品质(gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。肾癌的特点是高强度的坏死gydF4y2Ba与gydF4y2Ba在肿瘤坏死。在肝肿瘤平均FD的值是1,62相比,周围的组织中gydF4y2Ba(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。上面的结果显示表明,肿瘤血管网络的混乱比周围的组织。gydF4y2Ba
我们的研究结果表明,FD组中发现的最高价值,这可能表明,血管的网络在这里比其他群体更复杂。应用PDT, CPI和两种方法一起导致减少的分形维数。FD在PDT的最低价值+ CPI组,从而表明联合治疗结果在混乱的安排的血管。FD的比较与血管的数量显示血管的形状变成更多的普通但数量的船只是相似的gydF4y2Ba。gydF4y2Ba后出现类似的结论PDT的船只数量的比较和PDT + CPI组。在提到组织血管的数量增加,伴随着FD价值的减少。血管数量的增加在PDT + CPI可能建议强化血管生成。血管生成可能的结果反馈的应对破坏血管在PDT和VEGF的分泌增加和bFGFgydF4y2Ba3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。旁边的船舶数量的增加降低分形维数证明血管直径减少(降低分形dimension-near 0,形状更类似于点可能被解释为直径的减少)。gydF4y2Ba
分形维数分析血管可能是一个非常有效的工具,使比较血管表面的形状和分布。FD是广泛使用的分析各种形状的可视化技术例如x射线照片,超音波和电脑断层gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。分形维数的分析需要过程,使检查形状和背景的分离。微观的幻灯片使用常规hematoxylin-eosin方法染色颜色差的动态自动分离,这可能会让困难检查形状。计算机系统需要强烈的对比图像(非常有用对CD34染色分析血管)和特殊的算法来寻找形状也需要检查(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
5。结论gydF4y2Ba
我们的研究结果表明,分形维数分析是一个非常有用的工具在评估差异不规则形状像PDT-treated血管肿瘤。因此,FDA的实现算法可能是有用的方法在评估PDT的肿瘤的功效。gydF4y2Ba