文摘
人类和鼠肝小叶的球形结构意味着更多的中央细胞有更少的时间比周边地执行其功能定位细胞由于血液流经他们更迅速。这个问题可以克服更多的小叶中心的细胞是否能在高温下运转比门静脉周的细胞。本研究提出了证据,这样的温度梯度。首先,我们用数学模型来证明对小叶的中心温度升高。其次,我们检查发热蛋白的分布和热敏感蛋白的老鼠和人类肝小叶。Double-antibody染色从老鼠和人类健康的肝脏是用于视觉得分和自动化histomorphometric定量本地化的解偶联protein-2(已知产生热量)和瞬时受体potential-v4蛋白(称为高热敏膜蛋白)。这两种蛋白被发现位于小叶中心的地区主要在肝小叶。这些发现支持整个肝小叶建议温度梯度可能进化成为一个解决问题的办法,减少血液和细胞间的接触时间中心相比,哺乳动物的肝小叶的边缘。
1。介绍
哺乳动物肝脏是由近似球形小叶,大约1毫米直径(1]。门静脉和肝动脉的血液流动向心地声带之间的小叶边缘的肝细胞,退出一个激进的肝静脉的中心小叶。这个结构意味着,肝细胞以一种更小叶中心的区域更大体积的血液单位时间比一个外围地互动,简单的几何因素显示,最小叶中心的组织(~沿半径向中心75 - 85%)约有35次血液单位时间处理的体积比最外围小叶组织沿着半径(0 - 10%)。在进化过程中,机制可能开发允许小叶中心的细胞功能比周围肝细胞迅速弥补他们的接触时间减少。
从外围温度上升到肝小叶的中部地区是一种机制,允许集中位于代谢反应速率增加。使用专用microthermocouples温度梯度检测的尝试但不可行是因为不可避免的活体动物运动的文物,从热传导以及调查可能的错误。我们有,因此,寻求替代方法的调查这种可能性。首先,温度增加会随着血液流量增加肝小叶可以计算。其次,我们假设发热蛋白质,如解偶联protein-2 (UCP-2) [2),可能存在大量集中在外围地相比,蛋白质的肝小叶和已知高度热敏,如瞬时受体电位通道(TRPv4) [3,4),也可能出现在增加数量集中与外围。这两种机制可能有助于加速小叶中心的细胞功能将帮助克服减少导致的代谢效率降低细胞接触时间相比,血液流经小叶中心的外围位于肝细胞。
因此,在目前的研究中,我们模拟肝小叶的温度变化,可以预期的结果“冲洗”放热外围反应中产生的热量。我们也检查了上面所提及的两种蛋白质的位置沿小叶半径。瞬时受体电位通道的分布版本4 (TRPv4、膜通道组成)在肝小叶被检查,因为它是一种热敏蛋白异常高(功能的增加率的温度上升10°C)这是×10-20-fold而不是更平常×2-5-fold [3,4]。我们还研究了肝的分布解偶联protein-2, UCP-2(把能量生成的电子传递链中从ATP形成热生产)在肝小叶。紧主机托管UCP-2和TRPv4小叶中心的区域支持假设的进化压力会导致这种情况,因为它达到更高的小叶中心的区域的反应速率比更多的外围区域。本研究进行研究假设TRPv4 UCP-2紧密共存,可以发现主要在哺乳动物的肝小叶,小叶中心的区域虽然不一定在同一个细胞,细胞类型,或者绑定在分子水平上。
2。方法
2.1。数学建模
这是使用人类的肝脏和肝小叶的尺寸和肝的肝血流量和热量生产报告文学(见结果)。
2.2。肝脏样本和免疫组织化学方法
2.2.1。人类的肝脏
3μm部分从formalin-fixed石蜡嵌入式(FFPE)肝脏从7块男性年龄在21到63年使用的东伦敦,城市地区伦理委员会批准。在显微镜上,没有使用的组织自溶的更改或肝脏疾病的证据。一个变量数量的福尔马林和脂褐质色素必须被接受。
immunoperoxidase技术使用向量实验室ABC工具包(Ref: pk - 7100)采用脱蜡部分heat-mediated抗原后检索,使用向量抗原暴露解决方案(Ref: h - 3300在pH值6.0)。部分为TRPv4考试举行在97°C水浴了40分钟。部分为UCP-2检查微波治疗35分钟。部分被孵化用矢量实验室亲和素、生物素阻断工具包(Ref: sp - 2001) 15分钟,其次是过氧化物酶与3%的水溶液淬火15分钟。TRPv4抗体应用于部分的稀释1在50个40分钟。UCP2在稀释1抗体应用于部分20为60分钟。两种反应在室温下。靶抗原的可视化是通过使用向量(r)新星红(tm)基质包过氧化物酶(Ref: sk - 4800)申请20分钟的轻拍(-diaminobenzidine色原体解决方案)为了规避困难区分免疫反应和脂褐质和福尔马林颜料。光用苏木精复染色(吉尔的房子造)5秒没有分化证明最优。
2.2.2。大鼠肝脏
动物工作的总体机构许可证下病理学系为这种类型的动物研究。成年老鼠Glaxo-Wistar年龄在6 - 9个月与年龄和性别和死亡控制动物在一个无关的研究肝脏块之前在福尔马林固定石蜡处理。3μm部分FFPE肝脏从11块纯种控制老鼠的年龄在6到9个月,对年龄和性别匹配。人类肝脏的免疫组织化学方法多种多样,一些细节。部分是一块过氧化物酶的3%过氧化氢处理甲醇抗原检索之前对抗原是通过使用25分钟的微波矢量抗原暴露的解决方案。TRPv4抗体应用于1在20和UCP-2抗体的稀释1 40,在室温下为60分钟。使用可视化的目标抗原的轻拍色原体(BioGenexHK 130 - 5 K) 5分钟紧随其后与吉尔的苏木精复染色。
2.2.3。得分
区域的手动评估染色被定义为门静脉周的(2 - 3细胞的地幔),小叶中心的(2 - 3细胞周围肝小静脉的地幔),和mid-zonal(包括3 - 4细胞集中中途下小叶半径)。强度得分是由一个训练有素的观察者。在视觉评分,大约12(范围7 - 16)为每个肝小叶进行了评估。使用的范围是0 - 3,这取决于肝细胞的比例显示明确的染色是零,< 15%、16 - 40%或41 - 100%。
2.2.4。验证观察大鼠肝脏的性能
观察者的性能验证通过比较视觉评分获得使用histomorphometry 1小叶的6大鼠肝部分(三个彩色UCP-2和三个TRPv4)由一个独立的观察者(自动化方法不能用于人类肝脏因为混杂的脂褐质色素的存在)。从数码相机捕获的图像(蔡司Axiocam MRc)的图像大小像素,Axiocam抓帧器先生和另外一个宏观运行下一个处理蔡司KS400半定量的图像分析系统。每带一个字段检查×40的放大,给域面积0.059毫米2。应用领域被确定的颜色(红、绿、蓝色像素采样获得的强度范围的适当的部分代表微观领域后从眼睛所需的值区分这些区域从背景)。这些像素值被应用于各个领域的研究从每个动物产生阈值的二进制图像。应用材料的面积是计算自动从二进制图像,表示为一个字段总面积的百分比。
2.2.5。数据分析
数据使用SPSS v.15检查。数据表示为意味着±标准错误的意思(s.e.m)并使用学生差异检验以及在适当的地方。值<。05年被认为是重要的。”“动物或估计的数量值,如上所述的文本。
3所示。结果
3.1。传热的数学模型从边缘到中心的人类肝小叶
为简单起见,我们首先处理传热在一个假设的小叶没有上述建议等机制与UCP-2和TRPv4进化。假设平均小叶是球形,,首先,小叶内热量的一代是统一的。让热的速度生产单位体积的组织(单位J / (m3sec)),:比热的组织,即热量需要提高温度的单位体积的组织1°C (J / (m3°C)),导热系数(J / (m sec°C))。和温度(°C)和血液速度(米/秒),分别在径向距离从球面的中心小叶。一般的传热方程在哪里表示空间梯度和是时间。在这个分析中对于稳态情况考虑,。假设扩散与对流换热传热相比是可以忽略不计的血液流动的正弦曲线。直觉可能是这种情况,因为高通过肝脏血流量。扩散项因此可以被忽视,给吗使用高斯定理,这导致也就是说,热通量()在整个球体的体积等于表面体积的总热量生产。之间的集成球的表面,,导致血流量(注意,是方向)在哪里和温度和平均血流入速度在球的表面。与体积守恒的血液流动,也就是说,,球形小叶内的温度分布可以表示为在哪里肝小叶的体积,,进入每个小叶,是血液体积流率。核心之间的温差和表面小叶的。可能会被认为是合理的温度肝脏的血液供应;在肝脏灌注的情况下,这是灌注系统的温度保存示例中,37°C。在正常动物,这将是核心温度。组织的比热容,,被认为是)基于线性插值的结果Haemmerich et al。5]。在的人,肝小叶的体积大约是0.179毫米3(毫米)和血液到每个小叶的平均体积流率大约是0.1毫米3/分钟,基于全肝体积的1.5升的接收每分钟0.83升的血(6),(假设身体表面积= 1.73 m2)。肝热的速度生产(J / (m3sec))使用在目前的计算是基于均值为0.41 W每公斤体重,获得在麻醉狗Baconnier et al。6),由Leevy et al。7],和Ersoz Ersoz [8),假定肝1/50th占身体的重量(密度为1公斤/升),肝细胞占据三分之二的肝脏的体积(即,),占几乎所有热量的一代。温度分布来源于这个模型可以与直接测量如果这最终变得可行。图1(一)显示温度的径向分布由(5),使用上述的参数值;它表明总理论温度上升从边缘到中心的小叶大约0.925°C。
(一)
(b)
现在考虑另一种情况,也没有UCP-2效应,热生产问不同肝小叶这样的半径当地的温度耦合线性吗也就是说,在这是热生成率在肝小叶的表面温度在哪里吗,是热生成率的增加每10°C温度上升。在球坐标,控制方程在哪里和。与体积守恒血液流动,,我们可以独立的变量和在上面的方程:它可以解决,使用的边界条件,作为在哪里。中心之间的温差和小叶的表面。
在图1(一)温度的分布在肝小叶的半径和5。与热产生的情况统一整个小叶,进一步增加温度在中部地区的小叶当热产率增加的温度。在温度上升,从边缘到中心的小叶大约1.12°C。在图1 (b)与肝血流量的减少,核心温度变化(运动)情况介绍,也就是说,没有温度提高由于UCP-2和蛋白质3或5。
3.2。肝组织化学染色UCP-2和TRPv4
档案组织化学染色人类和大鼠肝组织UCP-2和TRPv4(图2胞质,出现粗颗粒和气泡。最高的意思是%应用领域在中央静脉周围的区域在老鼠和人类肝脏(数字2和3)。UCP-2和TRPv4都集中在最小叶中心的细胞,在人类和老鼠的肝脏(由自动化histomorphometry证实大鼠,见下文)。在其他地方,有温和的染色,主要在肝细胞构成的单层限制门户的板束,但mid-zones很少。
(一)老鼠Liver-TRPv4
老鼠Liver-UCP2 (b)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。自动化Histomorphometry鼠肝脏
自动化histomorphometric %免疫染色面积的测量UCP-2和TRPv4 6大鼠肝脏、视觉评分进行验证,证实了带状手册上找到得分的差异。(单向方差分析、自动histomorphometric数据,大鼠肝脏,意味着% UCP-2染色,集中了9.63%,2.12%在中部地区和1.46%在门户区和集中的意思是% TRPv4 7.095%, 1.53%在中部地区和1.63%在门户区。)
3.4。手工染色评分之间的相关性UCP-2和Trpv4
手工染色分数之间有很强的相关性UCP-2和TRPv4网站结合在一起(见图4);例如,在大鼠肝脏、两个蛋白质之间的相关系数为手动评分是0.895(枪兵),这表明大约80%的intralobular UCP-2选址和TRPv4可能由生理要求TRPv4(和其他可能的高度温度敏感蛋白质)在一个相对温暖的环境。在人类肝脏,相关系数,手动评分TRPv4和UCP-2(枪兵)为0.881,表明~77.6%的intralobular选址这些蛋白质可能是同样的决定。
(一)
(b)
4所示。讨论
我们已经证明,利用数学模型,热洗从外围肝小叶的中央部分,也表明,发热和异常热敏感蛋白共存,在小叶中心的主要区域,在老鼠和人类的肝脏。这些数据支持了假设温度梯度存在于肝小叶,小叶中心的温度增加,可以弥补减少接触时间用于血液与小叶中心的细胞,隐含在肝小叶的球形。
这些发现有一些影响。首先,即使没有UCP-2,肝小叶的小叶中心的区域会有更高的温度比小叶的门静脉周的区域,因为“冲洗”的外围地产生热量,以整体的径向温度梯度在0.9 - -1.2°K的顺序,根据intralobular热产生的分布。线性插值TRPv4等表明,一种蛋白质,其特定的函数10 - 20的2),这个函数增加了2.4倍(即,)的气温上升1.2°K在小叶中心的区域。其次,对流“冲洗”门静脉周的反应中产生的热量不足以产生高度的小叶中心的温度要求提高利率的反应(例如,谷氨酰胺的合成、细胞色素的解毒糖原形成的系统,或者通过葡糖激酶(9,10)在有限的小叶中心的组织而产生的额外的热量集中位于UCP-2可以这样做。第三,小叶中心的主机托管的蛋白质的功能展示高温敏感性(TRPv4)发热蛋白质UCP-2表明这个主机托管进化,因为它提供的功能的好处在小叶中心的细胞区。第四,由于要求之间的平衡是小叶中心型结节ATP生物合成的,和其他反应,和需要提高上述原因的小叶中心的温度,额外的解释,虽然不那么明显,主机托管UCP-2和TRPv4外围细胞的外层不太明显。可能是必要的糖质新生和尿素生成,已知最大最外围区在每个小叶(11- - - - - -13),是最好的实现增加UCP-2而提供的温度高蛋白质如TRPv4可能有一些额外的功能,不确定,在这个网站。然而,由于糖质新生和尿素生成的要求特别高的ATP,门静脉周的的数量分开可能是有限的。
进一步洞察小叶函数可能被考虑了在运动变化。在开始锻炼,体温上升明显,小叶血流量的减少(7,8可能导致小叶中心的变暖;这可能维持小叶中心的功能,从而限制葡萄糖释放到大气环流因为葡糖激酶的活性(集中位于(10)加速。在这个阶段,肌肉糖原用于燃料肌肉功能。在后期,当肌肉糖原耗尽,更多的葡萄糖,来源于肝脏糖原和肝脏糖质新生,被释放,可助长肌肉和大脑。本研究的一个限制是没有道德的手段获取肝脏样本绝对正常的人类受试者。样本因此获得尸检患者死于原因可能导致肝脏病理学和肝脏正常组织学外观在常规染色。然而,结果的相似性在老鼠很可能这两个蛋白的小叶中心的分布无关的死因在人类主题和可能是一般的哺乳动物的现象。进一步限制是信息的缺乏对人类肝热生产(),合成需要使用的数据在麻醉狗获得数学模型。
纯粹的理论计算对流温度分布(即。,在没有增加的UCP-2)小叶的半径(5)取决于小叶半径。在哺乳动物肝脏,小叶和平均半径大于正常在至少三个怀孕情况下(14),在部分肝切除术后再生小叶(15),在成年动物(老鼠)编程限制怀孕和哺乳的母亲的蛋白质摄入量(12]。这是感兴趣的(5)表明,温差小叶的表面和中心将与小叶的半径增加,可能导致进一步的加速小叶中心的新陈代谢在较大的小叶。这可能是有益的在母体蛋白质的老鼠胎儿编程限制肝脏重量不增加(这越来越少,但更大、小叶(12),也在部分肝切除术后肝再生(15])。
可能的主机托管UCP-2 TRPv4发生偶然?小叶中心的染色UCP-2和TRPv4一起占据了大约0.1%的小叶体积(不含肝小静脉),从自动化领域分数数据计算。发生的概率小叶中心的主机托管的TRPv4 UCP-2偶然因此只(例如,),进一步支持了假设进化压力导致的主机托管UCP-2 TRPv4,可能支持这两种蛋白质的存在在一个单层小叶肝细胞的表面,同时也可在任何其他网站比小叶中心的区域。
如果我们的解释的角色小叶中心的主机托管UCP-2 TRPv4是有效的,该解决方案如何进化的小叶中心的问题?一种可能性是,temperature-based补偿机制是生理的必然性门静脉周的地区产生热量的冲洗放热反应途径;结果小叶中心的变暖不足,额外的变暖,UCP-2证明是有益的。(另一种解释16- - - - - -20.]肝小叶的UCP-2的功能是,它提供了一种机制,通过降低线粒体膜电位,限制了生产活性氧等自由基(呼吸电子传递链的副产品(等),从而减少后续细胞损伤能量释放等被转移至其他ATP形成热生产。虽然这可能发生,这种解释并不符合UCP-2我们报告的径向分布,因为如果是这样的话,人们会期望UCP-2主要集中在小叶的边缘因为这是主要的糖质新生和尿素生成高度ATP-dependent通路和地方活性氧生成的副产品等,因此,在其最大的可能。然而,目前的研究表明相反的情况下,小叶中心的区域显示的最高UCP-2浓度在老鼠和人类。
重要的影响可能来自UCP-2及其启动子区域的遗传多态性,报道在人类21,22]。虽然这些多态性UCP-2功能的影响尚不清楚(2),功能丧失多态性,如果不是补偿UCP-2蛋白质活动增加,可能导致葡萄糖耐受不良和2型糖尿病由于低glucokinase-mediated小叶中心的葡萄糖摄取[4)由于减少热刺激。同样,损失函数UCP-2多态性也可能导致代谢性酸中毒的风险增加,由于相对开关谷氨酰胺合成的氨解毒(小叶和proton-neutral)尿素生成(门静脉周的和proton-generating) (23]。功能多态性可能导致小叶中心的细胞损伤的结果相对高热的反复发作。这种效应可能尤其可能发作期间以来乙醇摄入酒精脱氢酶是最活跃的小叶中心的区域(9]。只有少数嗜酒的发展成肝硬化,比较不同的频率UCP-2多态性与那些没有肝硬化患者肝硬化人群的饮酒会感兴趣的。最后,当前的研究关注可能的存在,和功能的后果,组织内的温度梯度在微观层面,在这种情况下在肝脏,题目之前无人关注的领域。
利益冲突
没有利益冲突。
承认
本文由MRC / EPSRC纪律弥合倡议给予w·王(g0502256 - 77947)。