文摘
理解感知环境信息和控制行为的神经机制在自然环境中是神经科学的一个主要目标。朝着这个目标的一种方法是重建神经系统模拟。尽管他们相对简单的大脑与哺乳动物相比,昆虫能够处理各种传感信号和产生适应性行为。然而,我们的全球网络系统层面上理解受限于实验约束。模拟是非常有效的神经机制进行调查,结合实验数据和假设。然而,它仍然是很难建立一个计算模型在整个大脑层面由于巨大的神经元的数量和复杂性。我们专注于一个独特的行为感觉silkmoth调查神经机制的处理和行为控制。标准的大脑是用来巩固实验结果,通过集成产生新的见解。在这项研究中,我们构建了一个silkmoth标准大脑和大脑图像,我们注册分段神经纤维网地区和神经元。原来的软件工具神经元共焦图像的分割,KNEWRiTE,分段数据和注册模块,NeuroRegister被证明是非常有效的神经元登记计算神经科学的研究。
1。介绍
昆虫的大脑是重要的神经功能系统分析模型。这是由于其相对简单的结构包含重要的大脑功能,比如感觉信息处理,学习,和行为控制机制(1- - - - - -3]。分析基于神经元的形态和神经纤维网极大地促进了神经功能的理解。特别是,无数的存在确定神经元巩固了昆虫的大脑神经网络作为模型的应用领域的神经行为学(4,5]。详细的形态学的神经元可以更容易捕获使用最近荧光技术和各种遗传技术在昆虫6- - - - - -9]。这些方法论进步导致的新见解大脑机制通过使用小而驯良的昆虫的大脑。
著名的简单昆虫行为的独特取向信息素刺激男性silkmoth,显示的家蚕。这个程序行为引发的传感信息素由激增、曲折和循环运动组件(10]。感官信号路径信息素已经被确认和内部的特征,细胞外的实验。然而,这些结果仍不足以获得全球理解从感官处理行为控制主要是由于实验的局限性。
例如,外侧副瓣(LAL)和腹侧前脑(VPC)被认为是关键区域生成命令信号控制蛾行为(10]。在这些地区,独特的触发器相关的神经反应被认为是锯齿形行为记录,并详细分析了他们的神经基质形态(11]。基于实验数据的神经网络建模和实时模拟自然环境条件下,精确的假设可以被测试来获得关键的见解产生行为的神经机制。使用一台超级计算机,我们正在开发一个仿真模型对整个神经通路基于真正的神经结构,属性和连接。即使使用最快的电脑目前昆虫大脑的ca。100000 - 1000000个神经元模拟使用详细的神经属性将测试可用的计算能力的极限。
大脑科学、标准大脑地图是用于集成和比较形态学数据取自不同的对象在不同的时间。标准的大脑已经开发了各种昆虫,如果蝇(12- - - - - -14),蜜蜂(15,16),两种蛾(17,18),蝗虫(19,20.]。这些标准的大脑已经被用于各种形态分析的神经元和大脑区域。例如,分析了确定神经元之间的突触连接大脑使用蜜蜂标准(21),研究了光学叶的形态发展大脑蛾(22]。
大脑功能通常被认为是由神经元的动力学响应。这些动力学控制的各种因素,如离子通道、细胞内信号和神经元形态。为了分析神经元及其网络的动力学性质silkmoth,我们已经将我们的实验数据集成到一个数据库(23),其中包含超过1200单神经元形态和生理实验数据的记录。利用注册信息来建立一个计算模型为研究神经机制,我们开发了一个方法和工具构建和利用大脑的标准。
大纲silkmoth标准的大脑是由平均图像二值化。大脑图像,分割区域,神经元可以在这注册的非刚性的变换。我们最初的工具从共焦图像分割的神经元,KNEWRiTE,和注册模块为斐济和ImageJ神经元形态学数据,NeuroRegister,有效的开展这个注册过程。大脑神经模拟与标准开始通过注册标准大脑中的神经元,估计他们之间的联系。本文提供的标准化方案可以结合其他方案,如VIB [24),启动建模研究和应用各种昆虫的大脑。
2。材料和方法
2.1。组织学
男性silkmoths (家蚕l,Kinshu and Showa strain hybrids) were used 2–7 d after eclosion. The brains were fixated in 1-2% formaldehyde for 20 h at 4°C. After fixation, they were rinsed in TRIS buffer, dehydrated in an ascending ethanol series with 10 min/step, degreased in methyl salicylate/ethanol to promote antibody penetration for 30 min and rehydrated. After rinsing in TRIS buffer, they were incubated with agitation for 3–7 d at 4°C in TRIS buffer containing 0.5% Triton-X 100 and 1% bovine serum albumin (TRIST-blk) as well as mouse monoclonal anti-黑腹果蝇synaptotagmin抗体(3 h2 2 d7由k·辛和从发育研究杂种细胞获得银行的赞助下研究所开发和维护由爱荷华大学生物学系,爱荷华州的城市,是52242年,美国的稀释1:15 - 1:50集中)。
在孵化后的主要抗体,样本在TRIST-blk冲洗(5×15-60 min)和转移到二次抗体(分子探针Alexa萤石488 anti-mouse, 1: 200 - 1: 250年TRIST-blk)对2 d在4°C。最后,样本在TRIST-blk再次冲洗和平原三羟甲基氨基甲烷缓冲液(5×15-60 min),脱水,水杨酸甲酯和清除。
成像在水杨酸甲酯与蔡司LSM510激光共焦扫描显微镜(LSM)和10×/ 40×0.45或1.0石油高度消色透镜的目标。图像数据注册在我们的数据库系统,债券(14合作者之间的],共享。
2.2。方法构建一个标准的大脑
我们开发了一个原始的方法构造一个标准的大脑使用共焦LSM图像数据(图1(a))。在我们的数据库中,有六个全脑图像数据集来自前部和后部的扫描。大多数这些扫描低倍镜下,是不适合大脑区域的详细划分。在我们的方法中,我们平均这些LSM图像对齐通过调整中心,通过平移和旋转方向计算的平均形状的大纲(图1(b))。二值化后的图像,标准的大脑得到的轮廓和多边形模型的波阵面OBJ格式也是斐济(图生成的图像处理软件1(c))25]。因为我们认为蛾大脑严格双边对称的,12个大脑数据集从六个人被用来构造平均大脑的形状。
高分辨率的图像数据集的大脑被注册使用的薄板样条变换斐济标准大脑(图1(d))。标准的大脑内部图像申请登记的地区和神经元。地标,参考点的变换,被分配到特征点的直接对应两个脑图像栈。基于薄板样条变换地标也用于登记区域和神经元(图1(e))。为了应用变换,有必要指定至少四个地标。此外,它是重要的地标在水平和垂直方向均匀,避免方向偏差。
2.3。软件细分和登记
一些软件工具进行评估和应用在我们的分割和注册计划。在第一步中,神经形态分割使用ITK-based分割软件,ITK-SNAP [26和我们自己的项目,KNEWRiTE。ITK-SNAP最有用,因为它运行在许多操作系统(Windows、Linux和MacOS X)和有许多有用的功能从多层图像数据中提取对象的。特别是,自动分割基于蛇算法非常有效的提取树突分支结构。
KNEWRiTE (http://invbrain.neuroinf.jp/modules/htmldocs/IVBPF/IOSSIM/index.html)也被应用于从LSM图像数据中提取神经元结构(图2)。软件,使用Qt (http://qt.nokia.com/)和OpenGL (http://www.opengl.org/GUI), Linux和Windows上运行。它有一个函数跟踪3 d树突的分支模式结构基于区域增长的方法(27并手动跟踪。高对比度的自动跟踪方法是非常有效的图像数据没有噪音,而手动分割是提取黑和瘦对象非常有用。半自动提取,这些方法的组合是最适合我们的市场细分工作。
(一)
(b)
我们的目标在注册标准大脑神经元的神经元网络的建设和近似一个现实的结构保存形态关系。神经元形态提取KNEWRiTE或ITK-SNAP存储在SWC文件格式,可以用来为各种神经模拟器生成形态描述,如神经元(28]。注册过程的标准大脑中的神经元,大脑图像栈包括神经元可以通过利用薄板样条变换注册相同的方式注册的大脑区域。然而,由于没有软件存在这个变换应用于一个SWC文件,我们开发了一个新的SWC注册插件模块,NeuroRegister (http://invbrain.neuroinf.jp/modules/htmldocs/IVBPF/IOSSIM/index.htmlImageJ和斐济。模块是基于“名字地标和登记”为斐济插件模块。我们可以应用刚性、仿射和薄板样条中所描述对象转换SWC格式使用几乎相同的操作如原始模块(图3)。
3所示。结果
我们获得的平均轮廓蛾大脑作为登记的基本框架。然后,神经元形态模型提取LSM图像数据注册标准的大脑。
3.1。大脑的平均轮廓
大脑的平均轮廓非常重要的基础注册分割对象在大脑中。在这项研究中,左右两侧的大脑图像被视为独立的大脑假设左右对称。获取标准的大脑形状,12 6大脑样本图片。我们定义的中心食道片最大的大脑轮廓(女士:中间片)是大脑坐标系统的起源五个具有里程碑意义的点,即中央身体(CCB)的中心,中心的蘑菇体左和右肾盏(RMC, LMC)和左和右触角叶的中心,被分配到应用变换。刚性变换应用于补偿的不同位置和旋转的大脑图像数据。转换图像平均和标准的大脑形状的大脑区域提取分离光明与黑暗的地区。二进制图像和大纲的标准大脑存储在多页TIFF格式。基于多边形的表面模型也生成并存储在波阵面OBJ格式使用“创建表面”插件斐济(图4(一))。
(一)
(b)
适当使用平均形状为标准的大脑因为地区和神经元的形态学数据来自不同个体的大脑将被注册。评价标准的大脑形状,从各种图像特征具有里程碑意义的点片,是不习惯在刚性变换过程中,被分配在大脑的标准,每个脑图像数据。在我们的评估中,一组图像数据包括大脑被选为基础的标准形象。评估大纲的不同形状,我们分配15分,也就是说,三分的背侧和腹侧轮廓后# 50和中等# 80图像片和两个背侧和腹侧一点从后图像片# 123。这些地标选择边缘或在每个样本点清楚地看到和发现。的差异基本和另一个图像之间的坐标数据以欧式距离。显示的平均距离是最小的大脑图像为基准图像标准。标准差也被最小化,在这种情况下(图4 (b))。也表明,基于图基多重比较检验,两组之间没有显著差异。此外,样本的大脑的形状非常相似,与标准脑的最一般的大小和形状蛾在考虑大脑的样本图像。
3.2。市场细分方法的比较
使用KNEWRiTE软件、自动、手动和半自动方法选择高效、高质量的分割。评价其性能,我们应用这些提取三个多电脑形成树枝状物体。拔牙的对象是在四个不同的条件下执行,即,没有其他对象或噪声用“生”(图5(一个)),大对象的混合物用“偏见背景”(图5 (b)与白噪声),用“噪音”(图5 (c)与圆柱体),用“对象”(图5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
拔牙进行评估的结果根据细分的成功率,用“一致性”的意思是两个一致性测量,一个对应于失踪现有分支机构和另一个相关的检测不存在分支错误(29日]。结果表明,80%以上的结构提取正确使用手动和半自动提取方法(图5 (e))。然而,成功率较小的自动提取每一个条件。此外,半自动提取相当小的标准偏差与其他方法相比,这意味着半自动方法不容易对象形状和背景噪音。
三种提取方法也评估“差异”,这是直径之间的差异(图模型和分割结果5 (f))。手动提取的准确性是最好的,而自动的提取在大多数情况下是最糟糕的。然而,人工提取的结果强烈依赖于图像的条件。在半自动提取的情况下,精度非常高,稳定,无论对象的形状和图像的条件。我们还测试了我们的结果通过应用一个被动膜模型提取的神经元形态模型。电响应的误差最小化的半自动提取(图5 (g))。
神经形态学的结果表明,提取基于自动提取与手动调整是最好的分段神经元的模拟动态属性。最后,提取的时间不到1分钟自动提取,但多为半自动方法(图1 h5 (h))。然而,很明显,这是一个非常有效的方法分段神经元与手工方法。
3.3。大脑区域注册和神经元
是企图利用各种各样的大脑图像数据为不同的目的和个人在我们的数据库中,我们应用一种非刚性变换登记这些标准的大脑。我们利用薄板样条变换用于注册高分辨率图像数据安装在标准的大脑形状。标准的大脑和大脑区域可用于提取登记区域和神经元。
评估我们的方法的准确性,我们测量的差异不同的点的坐标值蛾的大脑,即建行的中心和中心的花萼(RMC, LMC)和总花梗的蘑菇体(RMP (LMP)之间的蛾大脑之间的测量标准和大脑图像之前和之后的登记。十二个地标被分配明显分割的边缘地区,如中央身体和蘑菇体花萼(图6(一))。不同的点的欧式距离标准大脑和原始图像大于40μm,但我们注册了这些明显除了LMP单向方差分析。结果表明,平均登记错误的点周围的地标,RMC, LMC,建行,分别为7.85,10.04和6.74μ分别为m(图6 (b))。然而,错误的点距离地标,RMP和LMP(仍大于15μm。很明显,登记的准确性取决于地标的选择,因此,重要的是分配地标接近感兴趣的区域或对象。在这项研究中,LAL-VPC地区手动分割的高分辨率图像数据。通过应用分段区域的注册过程,这些都是注册标准的大脑(图7)。分割的区域和神经元是一个耗费时间的过程,但登记使用利用薄板样条变换计算时间少于10分钟为每一个对象使用传统的电脑。其他地区可以注册以同样的方式。地区的平均形状和位置将统计计算通过收集更多的样品。
(一)
(b)
大量的精力花费在从LSM堆栈中提取神经元的树突结构三维图像。KNEWRiTE,原来的软件可以从LSM图像数据中提取神经结构结合自动和手动流程。我们应用这种提取神经元在LAL-VPC地区形成树枝状。几个预处理步骤应用于LSM图像数据,使用斐济和ITK-SNAP调整对比等。binarizing图像数据后,神经元形态学提取和形态模型生成半自动地使用KNEWRiTE SWC格式。提取的比例使用自动或手动过程依赖于各种条件,如神经元形态,在神经元的图片对比,图像质量相关的其他因素。在神经元的情况下用一个简单的结构,这是提取细没有任何手工操作。然而,超过10%的罚款树突手动提取和连接的神经元厚厚的树枝状。提取的神经图像数据被存储在一个TIFF格式的文件,然后在波阵面多边形模型生成OBJ格式。
分段标准大脑神经元注册了斐济的薄板样条变换。申请注册,超过四个里程碑点必须分配对大脑图像涉及分段大脑神经元和标准。NeuroRegister,原来的插件软件是应用于变换和注册SWC格式的神经元形态。确认注册是适合分析神经元的投射区和重叠的预测不同的神经元(图8)。
4所示。讨论和结论
标准形态地图册以来已经走过了漫长的道路编译串行部分的引用和大脑区域的识别。在一个标准的脑图谱的形式,他们允许实验数据的积累,同时保留形态关系和简化物种之间的比较分析。除了它的使用作为一个类似数据库的工具,我们的目标是用我们silkmoth标准大脑作为大规模神经网络仿真平台。
当大脑开始构建一个标准的,必须小心计算平均轮廓形状尽可能精确。在我们的方案中,我们指定食管的中心孔在中间片前后的方向的坐标原点的大脑,因为食道边缘的孔是清楚地看到,它的中心是容易获得的。然后,我们使用平移和旋转调整每个大脑图像堆栈。在这一过程中大小和形状保持不变。大脑的平均图像叠加计算每个像素的平均灰度值为所有12 LSM的大脑图像栈。该协议提出了构建大脑平均轮廓,可以作为测量的形状和大小的差异个人的大脑。我们评估标准的形状大脑通过计算所有单个样本的距离相应的地标。平均具有里程碑意义的单样本和标准的大脑之间的距离还不到40岁μ米,对应形状个体之间的差异(图5)。
任何大脑图像数据集可以注册通过设置地标在大脑的轮廓。我们有各种高分辨率LSM大脑的图像,这些图像在每个片注册标准的大脑与纹理映射。提取对象,如神经元,神经纤维网,大片可以注册通过应用转换标准的大脑从样本图像数据包含这些标签。通过这种方法,我们可以获取和集成神经纤维网的登记结果。进一步的目标是实现半自动或自动分割为神经纤维网和注册程序,可能应用各种变换和变形在医学图像处理技术已经在使用。
在我们的方案中,神经元的形态模型重建共焦图像数据的神经元。大脑神经元中提取图像注册到标准通过应用非刚性的变换。神经元形态模型SWC格式也注册使用我们ImageJ插件模块(图6)。神经元的形态特性建模和注册我们的方案,然后几何属性组的神经元,轴突和树突的重叠等树木,提供估计的信息有关突触连接的位置和强度。进一步的信息,如类型的离子通道,沿着探明其动态和分布,将会非常有利于模型模拟神经元的特性。
我们正在实现我们的标准大脑协议使用一台超级计算机和软件环境。我们正在建设一个平台整合形态和生理特性测量大量的个人实验。高性能计算神经元建模和模拟与实验基于该标准的大脑可能成为非常强大的工具,综合计算神经科学研究的一个新时代。
确认
作者感谢美智子Nitta,亚由美Ishii,和直Momota(兵库大学),某某的小林,Yoshiki Igarashi,孝Onojima,和(Norihiro Kosugi(立命馆大学),和难以Mori(东京大学)开发的软件和注册工作。他们也要感谢两位匿名裁判的评论。这项工作在一定程度上支持ISLiM(下一代集成模拟生活物质)。