文摘

旧世界猴分开类人猿,包括人类的祖先,大约2500万年前,但大多数基因在人类和各种非人灵长类动物非常相似,尽管他们解剖外表有很大的不同。像其他哺乳动物,灵长类动物有四个原肌球蛋白基因(TPM1, TPM2、TPM3 TPM4)都产生了大量的TPM亚型通过选择性剪接。只有TPM1产生两个sarcomeric亚型(TPM1α和TPM1κ),TPM2 TPM3, TPM4每生成一个sarcomeric同种型。我们有克隆和测序TPM1α,TPM1κ,TPM2α,TPM3α,TPM4αRNA与猕猴(Cyn)猴子心脏和骨骼肌。我们相信这是第一次报告的直接克隆和测序这些猴子的记录。在Cyn猴子的心,TPM TPM1同种型表达式的等级次序α> TPM2α> TPM1κ> TPM3α> TPM4α。Cyn猴子骨骼肌,表达式是TPM1的等级次序α> TPM2α> TPM3α> TPM1κ> TPM4α。人类心脏的主要区别是增加TPM1的表达式κ,尽管TPM1α仍是占主导地位的成绩单。Cyn猴子的心,只有在蛋白质水平TPM1 sarcomeric TPM同种型α。这与人类的心TPM1的地方α是主要sarcomeric同种型但较低数量的TPM1呢κ,TPM2α,TPM3α也发现在蛋白质水平。这些差异的原肌球蛋白和/或其他心脏蛋白表达在人类和Cyn猴子的心可能反映了在日常生活中不同的生理活动。

1。介绍

非人灵长类动物扮演关键角色在各种人类疾病的研究。由于人类基因高度同源性,猕猴属fascicularis猴,猕猴(Cyn),是一种最广泛使用的非人类灵长类动物模型在生物医学研究。他们已经广泛用于模拟人类疾病如帕金森病(1]。最近,Seita et al。2)生成转基因Cyn猴子,在淀粉样蛋白表达β前体蛋白基因用于老年痴呆症的研究。

脊椎动物心脏肌肉,心脏的cross-striated肌肉,帮助合同心脏,这是必要的泵送血液对肺和整个身体。厚,薄丝之间的合作互动在心脏肌肉生成肌肉收缩3,4]。完善,原肌球蛋白(TPM),薄丝的组成部分,与肌动蛋白和肌钙蛋白复杂交互控制收缩活动(5- - - - - -9]。不同亚型的肌纤维蛋白,例如,TPM,可能不定地调节肌肉收缩。为了理解任何肌纤维蛋白在肌肉收缩的作用在任何生物,有必要了解各种亚型的表达模式每个肌纤维的蛋白质。

交替剪接可以产生大量的拼接记录所有哺乳动物的TPM亚型(5- - - - - -7]。然而,我们很少了解的范围拼接猴子TPM的记录。正如前面提到的,猴子是最有用的动物模型来研究各种人类疾病包括心脏病。人类与其他灵长类动物分享超过90%的DNA,例如,猩猩和猴子的(https://www.sciencedaily.com/releases/2012/11/121106201124.html)。许多人类和非人类灵长类动物表型差异可能是由于基因调控的变化比差异基因本身(10]。我们当前的目标是探索各种TPM的同种型多样性基因Cyn横纹肌的猴子。我们有放大、克隆和测序的互补各种sarcomeric亚型。核苷酸序列分析给我们洞察不同的TPM亚型。

的表达模式中的每个记录猴子心脏和骨骼肌是由存在决定的。这些结果相比,那些获得相似的人体组织。使用二维蛋白免疫印迹和猴子的心对脊椎动物横纹肌溶解产物和CH1单克隆抗体特定TPM亚型(11,12),我们分离各种sarcomeric TPM亚型,随后进行质谱分析,确定TPM亚型的表达模式在猴子的心。

2。材料和方法

总rna从心脏和骨骼肌的成年Cyn猴子从BioChain采购(CA)纽瓦克。很多数量的心脏和骨骼肌提取B409007 B308110,分别。动物是成人和健康。心脏和骨骼肌样本不一定相同的动物。Cyn猴子的心提取物对2 d免疫印迹分析采购从BioChain(很多# A705219)和Zyagen,圣地亚哥,CA(猫# kt - 801)。

正常成年人心脏RNA(很多# B712083)从BioChain采购(CA)纽瓦克。正常成人骨骼肌RNA是来自Biochain(猫# R1234171-50)和Stratagene(猫# 540024 - 41)。

2.1。rt - pcr TPM1的放大α,TPM1κ,TPM2α,TPM3α,TPM4α

互补脱氧核糖核酸是由各种rna使用低聚糖dT(除非另有提到)使用我们的出版协议8,13- - - - - -15]。随后的pcr扩增的基因和/或同种型特定亚型进行了与特定primer-pairs同种型表1。PCR扩增DNA被琼脂糖凝胶电泳分离,随后如前所述沾染了溴化乙锭(15]。各种溴化乙锭染色DNA乐队从琼脂糖凝胶切除和DNA提取使用MiniElute凝胶萃取设备(Velencia试剂盒,CA)。提取的DNA被送测序。同时,每个凝胶中提取DNA的一部分用于克隆入T /克隆向量(生活技术,卡尔斯巴德,CA)后我们的出版协议(13]。的阳性克隆的DNA提取试剂盒mini-prep工具包(瓦伦西亚,CA)。每一个孤立的DNA的T /克隆载体测序从两个方向(伊萨卡康奈尔大学生命科学核心实验室中心,纽约)。

2.2。实时定量rt - pcr

为了量化转录水平在一个给定的组织一个可以确定两个相对量化和绝对量化。相对量化用于相关基因的转录本的量等量的兴趣不同的样本。然而,绝对的量化提供了目标基因的拷贝数出现在示例。执行中存在相对量化的数据使用ΔCT和ΔΔCT方法[16- - - - - -19]。

反应混合物中含有12.5μSYBR绿色supermix l, 1μl两正负10毫米底漆,9.5毫升DEPC-treated H₂啊,1毫升的cDNA未知数,1μl系列稀释的DNA的每一个TPM TA克隆的标准,或1μl H₂O底漆控制。验证引物的特异性,PCR产品运行在实时分析后琼脂糖凝胶。TPM1中存在的α,TPM2α,TPM3α,TPM4α,每个同种型是由相应的互补基因和isoform-specific寡核苷酸设计各自的TPM的外显子9 A / B基因。中存在的策略是用于维护的特异性(或避免交叉扩增)及等高度保守的基因。isoform-specific核苷酸序列的寡核苷酸用来制造cDNA表1。

绝对的拷贝数是由标准曲线方法如前所述14,15,20.]。

2.3。2 d免疫印迹和质谱(质/女士)

提取正常的成年人的心Cyn是从Zyagen采购(美国圣地亚哥,CA)和BIoChain研究所Inc . CA。2 d免疫印迹分析是由Kendrick实验室使用他们的出版协议(21,22如前所述(14,23]。x射线胶片的叠加和Coomassie染色蛋白质凝胶表现出四个点为每个样本(补充数据4和6)。质谱分析与切除、清洗,使胰蛋白酶化蛋白质从每个所述凝胶点前(24- - - - - -26]。

2.4。数据处理和蛋白质鉴定

ProteinLynx全球服务器(身为,版本2.4)是用于处理原始数据和蛋白质识别(https://www.matrixscience.com/、矩阵科学、英国伦敦)[14,23]。

3所示。结果

3.1。克隆和测序两Sarcomeric TPM1基因亚型

完善,哺乳动物TPM1基因生成两种sarcomeric TPM1亚型α(或TPM1.1)和TPM1κ(或TPM1.2) (8,11]。两个额外的高分子量亚型,TPM1μ和TPM1ξ已确定在人类乳腺癌细胞系而不是在人类心脏组织15]。虽然预测TPM1的核苷酸序列α从各种猴子是已知的,我们所知,还没有人TPM1报道α和TPM1κ实际的核苷酸序列从Cyn猴子在文献中。因此,我们决定克隆和序列TPM1的互补α和TPM1κ从Cyn猴子横纹肌。因为TPM1 Cyn猴子序列不是可用的数据库,我们设计了一个数量的primer-pairs TPM1 PCR扩增的预测α序列解剖(毫米)可用的数据库(变体X5 (XM_001103963))。我们选择MM Cyn等也因为这些是旧世界的猴子。互补的RNA Cyn猴子心脏和骨骼肌与低聚糖dT用于PCR扩增。第一次与TPM1进行PCR扩增外显子1(+)和TPM1外显子9 b (−) primer-pair(表1),它会放大TPM1α和TPM1κ。放大的TPM1战略α,TPM1κ,TPM1μ,RNA Cyn心脏和骨骼肌中描述的补充图2和补充表1。如上所述的补充部分,TPM1κ被放大,分为两个部分使用底漆对P4 (+) / P3(−)和P (1) / P6(−)所补充表吗1。TPM1的核苷酸序列α和TPM1κ在数据描述1(一)和1 (b),分别。同时,我们比较了核苷酸序列Cyn TPM1α和TPM1κ与人类TPM1α(NM_001018005.1)和人类TPM1κ分别加入(数字)。比较核苷酸CynTPM1α与人类TPM1α和CynTPM1κ与人类TPM1κ补充数据所示3和3 b,分别。

3.2。TPM2克隆和测序α

互补脱氧核糖核酸是由RNA从猴子的心脏和骨骼肌与低聚糖dT在材料和方法部分描述。最初与TPM2进行PCR扩增外显子1 (+)/ TPM2外显子9 a2(−)引物对。琼脂糖凝胶的扩增DNA分离菌进行基因,从顶尖的凝胶和DNA提取乐队也直接测序和克隆入T /克隆载体(14]。

虽然有∼2.6%核苷酸序列的差异和人类之间Cyn TPM2a(补充图序列3 c),推导出的氨基酸序列是相同的(加入# NM_003289.4)

3.3。TPM3克隆和测序α

放大TPM3a被描述的补充部分。核苷酸以及推导氨基酸序列数据所示2和3。是指出,尽管Cyn的氨基酸序列与人类TPM3a相同但核苷酸序列有98.481%相似。两个核苷酸序列的最适合补充图所示3 d。

3.4。TPM4克隆和测序α

互补脱氧核糖核酸是猴子TPM4做好了准备αRNA与低聚糖dT TPM2如上所述α。primer-pair用于最初的放大是TPM4外显子1 (+)/ TPM4外显子9(−)(核苷酸序列表中描述1)。第二个用于筛选克隆primer-pair TPM4 qRT (+) / TPM4外显子9 (−)。猴子TPM4的核苷酸序列α(图4)是人类TPM4∼98.13%相同α序列,而氨基酸序列是相同的(27]。最适合CynTPM4的结果α和人类TPM4α核苷酸序列是在补充图3 e。的核苷酸序列Cyn TPM4α和人类TPM4α98.13%相似。

3.5。定量记录各种高分子量TPM亚型在猴子的心脏和骨骼肌

量化的任何特定的同种型基因的转录水平在一个给定的组织可以通过相对量化和绝对量化。相对量化用于相关基因的转录本的量等量的兴趣不同的样本。然而,绝对的量化提供了目标基因的拷贝数出现在示例。再次,相对表达式可以由两种方法,通过ΔCt和2^−ΔΔCt。在这项研究中,我们评估相对表达式使用两种方法,评估各种TPM亚型的绝对拷贝数Cyn猴子心脏和骨骼肌。同时,我们表现的比较分析对TPM亚型的表达人与Cyn猴子。

3.6。相对表达TPM1亚型在心脏和骨骼肌

TPM1之间的主要区别α和TPM1κ外显子2,而其他外显子包括utr是相同的。的核苷酸序列编码区域各种TPM亚型非常相似,我们互补脱氧核糖核酸基因和同种型特定寡核苷酸的3′utr TPM1(外显子9 b)α和TPM1κ,这就排除了其他原肌球蛋白基因产品的放大。

图5(一个)描述了TPM1的相对表现α在Cyn猴子心脏和骨骼肌使用ΔCt方法显示TPM1的表达水平较高α在骨骼肌。同时,更高的折叠TPM1α表达水平在骨骼肌当我们使用ΔCt方法如图5 (b)。图5 (e)和表2表明TPM1的绝对拷贝数α记录每mcg细胞总RNA∼高骨骼肌的1.7折。拷贝数结果同意提出的相对表达结果数据5(一个)和5 (b)。相反,TPM1κ表达Cyn猴子的心明显高于在骨骼肌由ΔCt(图5 (c)(图)和ΔΔCt方法5 (d))。TPM1越高κ表达Cyn猴子的心支持的表达式的结果取决于绝对拷贝数(图5 (f)和表2)。然而,TPM1相比κ,TPM1的表达α是2.3×10³和3.56×10⁴分别在心脏和骨骼肌褶皱高(在数据的比较结果5 (b)和5 (e)和表2)。

相对表达数据由ΔCt(图6(一))和ΔΔCt(图6 (b))表明,TPM2α转录水平更高的骨骼肌。TPM2的表达水平较高α在Cyn猴子骨骼肌的决心也证实了绝对的拷贝数。∼10.5折高在骨骼肌相比,心脏肌肉(图6 (c)和表2)。

在人类中,TPM2的表达α∼3.9×10²在骨骼肌相比,心脏组织。TPM2α水平在人类和Cyn猴子的心相当但∼5倍人类骨骼肌相比Cyn猴子(表2)。

相对TPM3的表情α明显高于在Cyn猴子骨骼肌相比,心肌(数据吗7(一)和7 (b))。再次,绝对拷贝数数据呈现在图7 (c)和表2指出∼36.5折TPM3的高表达α在骨骼肌。

TPM3的表达α高13倍人类骨骼肌相比,人类心肌。TPM3的表达α在人类心肌Cyn心肌高出11倍。TPM3的表达α在人类骨骼肌是大约4倍高于Cyn骨骼肌。

相对表达式(数字8(一个)和8 (b))以及绝对TPM4的表情α(图8 (c)和表2)高(1.7倍)骨骼肌相比,猴子的心脏肌肉。TPM4的表达α大约是相同的人类心脏和骨骼肌。TPM4的表达α在人类心肌19褶皱少相比Cyn心肌。TPM4的表达α在人类骨骼肌是8折不到Cyn骨骼肌。

表2表明TPM1α记录高出1.13折在人类心脏对人体骨骼肌相比,而TPM1κ高67.7折的心。TPM1的表达α是1.24×10²和3.2×10⁴褶皱高于TPM1κ分别在人类心脏和骨骼肌。TPM1的表达α相比非常相似的人类心脏Cyn心,而TPM1的表达κ人的心里高出22.4折。同样,TPM1的表达α猴子和人类心里非常相似,而TPM1的表达κ大约是3倍大的人类骨骼肌相比Cyn骨骼肌。

绝对的拷贝数的确定有助于我们评估各种TPM亚型的表达比较TPM1 Cyn心里α> TPM1κ> TPM2α> TPM3α> TPM4α。相反,Cyn骨骼肌表达TPM1α> TPM2α> TPM3α> TPM1κ> TPM4α。在人类的心,TPM1α> TPM1κ> TPM3α> TPM2α> TPM4α。在人类骨骼肌,TPM1α> TPM2α> TPM3α> TPM1κ> TPM4α。

3.7。2 d Cyn猴的免疫印迹分析心肌蛋白提取与CH1单克隆抗体质/ MS分析紧随其后

我们进行了2 d免疫印迹分析提取来自两个不同的猴子的心与CH1单克隆抗体特定sarcomeric TPM蛋白质。肽提取CH1积极点的后续质/ MS分析。质谱数据和分析提出了补充数据5和7在补充部分。表中所示的结果3显示80% TPM1确定TPM肽是特定的,我们未能发现任何TPM2 TPM3或TPM4特定的肽。这不是不合逻辑的如果一个总结TPM2的缺席,TPM3, TPM3蛋白质在所有四个景点。换句话说,只有TPM1蛋白质存在于这颗心提取。下一个问题是哪个TPM1同种型表达。是指出,15 TPM1特定肽属于TPM1α和/或TPM1μ。TPM1之间的区别α和TPM1μ外显子6。TPM1α外显子6 b而TPM1吗μ包含外显子6(图9)。虽然我们首次检测到TPM1的表达μ记录在人类乳腺癌细胞(13),我们还没有发现TPM1的表达μ蛋白质在人类横纹肌。我们没有发现任何外显子6一个特定的肽的蛋白质提取物(表3和4),我们得出这样的结论:唯一sarcomeric TPM1猴子的心TPM1蛋白质α。我们的结果有很好的一致性的结果与胡锦涛et al。(28),他们还发现只有一个高分子量的表达sarcomeric TPM1蛋白质在恒河猴,这也是一个Cyn等旧世界猴。

4所示。讨论

克隆、序列分析和后续的蛋白表达模式sarcomeric TPM1亚型,TPM2 TPM3, TPM4基因支持这样的结论由几位著名科学家,大多数human-monkey(猩猩)的差异是由于基因调控,而不是基因。核苷酸以及推导氨基酸序列分析表明,没有多少区别人类和猴子对TPM亚型。的转录水平的表达各种TPM亚型在心脏和骨骼肌也比较人类和猴子。然而,TPM1的表达水平κ成绩单在猴子的心是高于其他脊椎动物的心除了人类(11和目前的研究)。在猴子的心,该表达式是TPM1α> TPM1κ> TPM2α> TPM4α> TPM3α,而猴子骨骼肌中的表达是TPM1α> TPM2α> TPM3α> TPM1κ> TPM4α(数据5- - - - - -8)。

虽然记录的表达式模式各种sarcomeric TPMs Cyn与人类肌肉相似的表达模式相应的蛋白质是截然不同。我们发现TPM1的存在α蛋白质在Cyn心中只有(表3和4)。目前,我们没有任何的解释缺乏其他sarcomeric TPM表达式Cyn心中尽管TPM1的可探测量的存在κ,TPM2α,TPM3α,TPM4α除了平移控制记录。我们的研究结果是在良好的协议与胡锦涛et al。28他也只发现TPM1α蛋白质同种型心脏组织从三个恒河猴,另一个旧世界猴物种如Cyn。

这些结果在Cyn与人类相比,而TPM1α心脏的主要sarcomeric TPM同种型;TPM1量较低κ表达式也被检测到我们和其他几个实验室(8,11,15,29日,30.]。同时,TPM2量较低α(11,29日,30.)和TPM3α蛋白质(12,30.)被发现在人类的心。

灵长类动物血统被认为是∼6000万岁(31日]。古时的灵长类动物从一个共同祖先分化新世界的灵长类动物∼3100万年前。黑猩猩和人类不同于其他类人猿∼6 - 7百万年前(32]。属、人类进化∼200万年前,科学家们表明大幅进化改变了各种器官,如大脑和心脏33]。刮胡子et al。34)广泛的研究报道比较心的形状和各种活动的黑猩猩、大猩猩和人类。虽然大猩猩和黑猩猩花很多时间睡觉或者是相对不活跃的,它们可以非常活跃在短时间的抵抗运动(战)如爬树和战斗。这些类型的活动可能创建一个压力对心血管系统的压力。猴子也遵循类似的模式的活动。相反,人类在其早期发展狩猎,花了很多时间收集,后来农业生存。换句话说,人类的生存依赖于终身中等强度耐力运动(EPA),它创建了一个心血管体积压力。当左心室(LV)结构和功能比较,刮胡子et al。34]表明,人类LV具有特性,增加心输出量,从而使EPA。此外,人类还LV演示表型可塑性以及各种体育活动的变化。这些研究结果清楚地表明功能区别人类和猴子的心。因此,它可以说是逻辑来检测不同的原肌球蛋白亚型和其他心脏特定的蛋白表达在人类和非人类灵长类动物的心。一个尚未解决的问题是为什么mrna为不同sarcomeric TPM亚型是如果不需要相应的蛋白质各种心脏活动。这是紧急使用如果需要它们吗?没有各种TPM的蛋白质在猴子的心,然而,可以解释为平移控制相应的成绩单在猴子的心。

数据可用性

生成的数据和分析在当前研究可从相应的作者。

伦理批准

本研究进行商用组织提取核酸和组织特定的猴子rna。因此,一个特定的机构动物保健和使用协议不是必需的。然而,综述了协议和批准机构生物安全委员会IBC # 169 (d·k·杜布),IBC # 321 (j·w·桑格),IBC # 212 (b . j . Poiesz)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Syamalima杜布,林恩雅培,奥马尔•Elsekaily Samender s Randhawa吉恩·m·Sangerand约瑟夫·w·桑格和伯纳德j . Poiesz同样起到了推波助澜的作用。

确认

这个项目是由NIH AR量57063人从NIAMS / (JMS和jw),税务师/ NIH资助数量HL高080426 (JMS和jw)和医学系的医科大学和芭芭拉科普癌症研究基金会人民党。

补充材料

放大各种TPM1亚型通过rt - pcr和/或嵌套式rt - pcr与同种型特定primer-pair(年代)。(A)互补dna由总RNA Cyn心脏或骨骼肌与oligo-dT被放大TPM1外显子1 (+)/ TPM1外显子9 b(−)放大TPM1一对引物α,TPM1κ,TPM1μ,TPM1ξ。(一)巷1:心;巷2:骨骼肌;巷3:引物控制。(B)分离DNA胡同间1或2图2的一个与TPM1稀释,然后放大。外显子2(+)/外显子9 b TPM1 (−)κ或TPM1ξ(图2 b通道1和2,巷3是底漆控制)。同样,孤立和随后稀释DNA从车道1或2图2与TPM1放大。外显子2 b(+) /外显子9 b TPM1 (−)α或TPM1μ巷4和图2巷5 b, 6巷在哪里底漆控制。(一)巷1:心;巷2:骨骼肌;巷3:底漆控制;巷4:心;巷5:骨骼肌;巷6:引物控制。(C)放大DNA从每个线如图2所示(2巷巷1对心脏和骨骼肌)凝胶中提取并进一步放大TPM1exon 1(+) /外显子2一对(−)底漆TPM1的放大κ和TPM1ξ。(一)巷1:心;巷2:骨骼肌;巷3:引物控制。(D) TPM1放大κ和TPM1α在Cyn心脏和骨骼肌。初始放大DNA如图2进一步放大2 TPM1exon (+) / TPM1exon TPM1 3 - 4 (−)κ和/或TPM1ξ心里(巷1)和骨骼肌(巷2)。初始放大DNA(如图2所示)放大TPM1exon 2 b (+) / TPM1exon TPM1 3 - 4 (−)α或TPM1μ在心脏(巷4)和骨骼肌TPM1(巷5)κ或TPM1ξ:巷1:心,巷2:骨骼肌和巷3:引物控制。TPM1α或TPM1μ:巷4:心脏,巷5:骨骼肌和巷6:引物控制。(E) TPM1放大α,TPM1μ,TPM1κ,TPM1ξ。最初的放大DNA(如图2所示)进一步放大TPM1exon 6 (+) / TPM1exon 9 b TPM1 (−)μ或TPM1ξ。没有可见的乐队表明TPM1的缺失μ或TPM1ξ在猴子的心(巷1)和骨骼肌(巷2)。最初的DNA扩增子也进一步放大TPM1exon 6 b (+) / TPM1exon 9 b TPM1(−)目标α和TPM1κ。强大的乐队在巷4(心)和巷5(骨骼肌)表明TPM1的存在α和/或TPM1κ。TPM1μ和/或TPM1ξ:巷1:心,巷2:骨骼肌和巷3:引物控制。TPM1α和/或TPM1κ:巷4:心脏,巷5:骨骼肌和巷6:引物控制。补充图2。表达TPM3α和TPM3 Cyn心脏和骨骼肌。(A)互补dna与RNA从Cyn心脏和骨骼肌利用低聚糖dT。第一次与TPM3进行PCR扩增外显子1 (+)/ TPM3外显子9 b(−)引物对。随后进行了嵌套PCR与TPM3 exon1A (+) / TPM3 exon9B (−) primer-pair(图5)。巷1:心,巷2:骨骼肌和巷3:引物控制。从图5 a (B)放大DNA稀释,进一步放大了TPM3外显子6 (+)/ TPM3外显子9(−)由TPM3 TPM3](图5 B)和外显子6 B (+) / TPM3外显子9 B (−) primer-pair TPM3α。巷1:心,巷2:骨骼肌,TPM3n巷3:引物控制。巷4:心脏、巷5:骨骼肌,TPM3巷6:引物控制α。结果在图1显示心脏(巷1)和骨骼肌(巷2)表达高分子量TPM1成绩单,直接DNA序列分析后,发现存在TPM1a(图1),表明它可能是最具TPM1同种型。结果在图1 b(巷1和线2)表明,猴子的心脏和骨骼肌表达TPM1k。结果描绘在图1 c建议略高的表达TPM1k骨骼肌相比,猴子的心。结果如图1 d还表明,TPM1k略高的表达比骨骼肌在Cyn猴子的心。然而,表达TPM1a水平Cyn猴子心脏和骨骼肌是相似的。结果图1 e所示显示缺乏高分子量TPM1同种型与外显子6 a,因为没有带巷1中是可见的(心)和巷2(骨骼肌)。这些结果表明缺乏TPM1的表情μ和TPM1x Cyn猴子心脏和骨骼肌。相反,一个强大的心里放大(巷4)和骨骼肌(巷5)引物对TPM1exon 6 b (+) / TPM1exon 9(-)表示的表达TPM1a或TPM1k Cyn心脏和骨骼肌。事实上,核苷酸序列分析(图2 a和2 b)支持RT - PCR数据。图2描述了放大TPM3 DNA Cyn猴子的心(巷1)和骨骼肌(巷2)。放大DNA可以从TPM3a或TPM3n或两者兼而有之。图2 b中给出的结果表明,没有可见的正确大小的扩增子TPM3外显子6 (+)/ TPM3外显子9 b (-) primer-pair。缺少6外显子引物的PCR产物表明可能没有检测到表达TPM3n在猴子的心(巷1,图2 b)和骨骼肌(图2巷2,b)。结果显示的表达在Cyn TPM3a心脏和骨骼肌。的表达水平低得多的比骨骼肌Cyn猴子的心。核苷酸序列分析证实Cyn猴子TPM3a表达式。核苷酸以及推导氨基酸序列在图4中给出。 It is to be noted that the TPM3a amino acid sequence of Cyn and human are 100% identical.补充图3。核苷酸序列的比较Cyn TPM1α,TPM1κ,TPM2α,TPM3α,TPM4α与相应的序列最适合人类的。(一)Cyn TPM1α与人类TPM1α。(B) Cyn TPM1κ与人类TPM1κ。(C) Cyn TPM2α与人类TPM2α。(D) Cyn TPM3α与人类TPM3α。(E) Cyn TPM4α与人类TPM4α。补充图4。2 d免疫印迹分析和提取从成人Cyn心。(一)Coomassie彩色猴成年心肌蛋白在凝胶。(B) PVDF过滤器与CH1单克隆抗体染色后用二次抗体如上所述在材料和方法,随后接受ECL和暴露于x射线胶片。发达x射线胶片叠加在顶部的Coomassie彩色第二凝胶以及Coomassie彩色PVDF过滤器。四个点,1,2,3,4,标志,切除,用于提取蛋白质的后续的质谱分析。补充图5。识别多肽的氨基酸序列提取点1,2,3,4 2 d后免疫印迹分析成人Cyn心用CH1单克隆抗体(# 1)蛋白质。红色字母表示被质谱肽序列。他们的位置在整个TPM1肽序列α显示。补充图6。2 d免疫印迹分析和提取从成人Cyn心(# 2)。(一)Coomassie彩色猴子成人心脏(# 2)蛋白在凝胶。(B) PVDF过滤器与CH1单克隆抗体染色后用二次抗体如上所述在材料和方法,随后接受ECL和暴露于x射线胶片。发达x射线胶片叠加在顶部的Coomassie彩色第二凝胶以及Coomassie彩色PVDF过滤器。4点1、2、3和4是显著的,切除,用于提取蛋白质的后续的质谱分析。补充图7。识别多肽的氨基酸序列提取点1,2,3,4 2 d后免疫印迹分析成人Cyn心用CH1单克隆抗体(# 2)蛋白质。红色字母表示被质谱肽序列。他们的位置在整个TPM1肽序列α显示。补充表1。PCR产品规模放大通过各种TPM1和TPM3底漆对用于这项研究。(补充材料)