文摘
治疗引起的感染金黄色葡萄球菌已经成为一个挑战由于紧急的耐药菌株。Ozoroa试根提取物已被用于传统医学治疗喉咙和胸痛在津巴布韦。这项研究的目的是确定的影响o .试根皮中提取胞外蛋白酶的生产金黄色葡萄球菌。根叫收集、干燥和粉碎成粉末。获得不同的植物成份,植物提取物进行。使用两种溶剂混合物提取物进行了:乙醇:水(50:50 v / v)和二氯甲烷:甲醇(50:50 v / v)。串行详尽的提取物也表现用甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、和水。肉汤采用微量分析被用来评估的抗菌效果Ozoroa试根树皮提取物对金黄色葡萄球菌。环丙沙星是用作积极控制。定性筛查细胞外蛋白酶生产金黄色葡萄球菌BCG-skim牛奶琼脂板上使用最有效的提取。表达的蛋白水解区测量和作为殖民地的直径比的总直径殖民地+水解的区域(值)。乙酸乙酯提取被发现是最强有力的抑制剂的增长金黄色葡萄球菌抑制99%和100年的最低抑制浓度(MIC)µ克/毫升。抑制细胞外蛋白酶生产提取物的浓度成正比。在100µg / mL,乙酸乙酯提取值为0.84,表明温和的蛋白水解活性。一个值为0.94是200年观察到的浓度µg / mL和所指弱蛋白水解活性。在结论中,提取抑制细胞外蛋白酶的生产金黄色葡萄球菌。进一步研究生物活性化合物的分离和净化负责抑制细胞外蛋白酶的生产与antivirulent发现代理的重要性影响金黄色葡萄球菌。
1。介绍
细菌感染出现21的最大威胁之一圣世纪由于细菌的耐药菌株的出现。这导致了困难在治疗常见的细菌感染(1]。最严重的威胁是感染引起的耐药弯曲杆菌,肠杆菌科,肠球菌,铜绿假单胞菌,志贺氏杆菌,伤寒沙门氏菌,金黄色葡萄球菌(2]。金黄色葡萄球菌病原体的医疗关注,因为其固有的毒性(3]。的发病机制金黄色葡萄球菌是由几个毒力因素。因素包括蛋白质,α溶血素,细胞外蛋白质、趋化性抑制蛋白质、肠毒素,毒素中毒性休克综合征,和细胞外酶的生产4,5]。胞外酶是一种不同类型的酶,由细菌用于入侵。这些包括凝固酶、透明质酸酶、脂酶、葡萄球菌激酶、磷脂酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶6]。
金黄色葡萄球菌会引起各种严重感染和适应不同的生态环境。在津巴布韦,金黄色葡萄球菌与数字有关的疫情,包括食物中毒(7]。在许多发展中国家,食源性疾病的发生往往是耦合的耐药细菌(8]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)显示抗药性常用在津巴布韦(9,10]。这主要与重症监护单位(CCUs)和剧院而著名。从病人承认CCUs的转诊医院在津巴布韦,94%的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株多药耐药性(11]。细菌显示增加抵抗抗菌药物和生物膜形成是伟大的医学问题。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的生物膜比Methicillin-susceptible形式金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株12]。Biofilm-mediated感染产生对患者预后不良。因此,有必要寻找新的策略来预防和治疗biofilm-mediated感染以及减少细菌的侵袭性在活的有机体内。
工厂拥有对入侵病原体的防御机制。这包括生物活性化合物被称为植物化学物质的生产。已报告的植物化学成分提取生物活性,如抗癌,抗菌,抗氧化剂,antidiarrhoeal,镇痛和伤口愈合活动13]。这就使他们具备了成为替代治疗选项对几个障碍(13]。一些植物传统上被用来治疗一些细菌感染和这些知识提供了需要研究不同植物提取物的抗菌活动(14]。植物之一,传统上被广泛使用作为一个治疗不同的疾病和感染Ozoroa旧址试(15]。大多数津巴布韦传统治疗师使用这种植物的叶子和树皮浸渍或输液来治疗腹泻,肾脏和肝脏投诉,溃疡,喉咙感染、胸痛和血吸虫病。在某些情况下,粘贴的树叶和树皮通常应用于治疗一些皮肤疾病和感染。注入根提取物的通常由妇女分娩后口服增加哺乳(16]。目前的研究旨在确定根树皮提取物对经济增长的影响和细胞外蛋白酶生产金黄色葡萄球菌。
2。材料和方法
2.1。试剂和材料
本研究中使用的所有化学试剂购自Sigma-Aldrich(达姆施塔特,德国)。正己烷、DCM,丙酮,乙酸乙酯,甲醇,乙醇用于拔牙是试剂级和蒸馏前使用。营养琼脂媒体(1 g / L肉膏,2 g / L酵母提取物、5 g / L蛋白胨,5 g / L氯化钠,15 g / L琼脂,pH值为7.4±0.2 )和营养肉汤媒体(15 g / L蛋白胨,3 g / L酵母提取物,6 g / L氯化钠,1 g / L d -葡萄糖,pH值为7.5±0.2 )分别用作增长和浓缩媒体。环丙沙星和3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)也从Sigma-Aldrich购买(达姆施塔特,德国)。
2.2。工厂收集和准备
的根叫Ozoroa试凭证数量BR1 F1用于本研究从城市森林在里士满,布拉瓦约,津巴布韦(5′6”;2018年11月33 E′7”)。民族植物学的调查是由r . Makurira女士(生物技术和生物化学、津巴布韦大学)采访9传统治疗师在布拉瓦约省(津巴布韦)导致识别Ozoroa试贝克(f)。r .蕨类植物。&答:蕨类植物。分类认证的工厂是由植物学家的身份在国家植物园津巴布韦的哈拉雷。根叫洗,干在烤箱 ,和地面使用机械磨细粉。总提取的粉末样品浸泡在两种混合溶剂:50:50 (v / v) DCM:甲醇和50:50 (v / v)乙醇:水。串行详尽的提取、七与不同极性溶剂用于浸渍粉样品。溶剂正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水。浸渍时间后,所有的混合物被过滤澄清,用绘画纸滤纸1号(Sigma-Aldrich,达姆施塔特,德国)。滤液被允许风扇在室温下晾干。滤液被擦干,称重,并存储供以后使用。
2.3。抗菌测试
提取物的抗菌活性是评估使用汤采用方法(17]。根树皮提取物进行了测试金黄色葡萄球菌国家反恐怖主义中心的6571(英国索尔兹伯里文化收藏、英国公共卫生)。股票的解决方案是由溶解在二甲基亚砜(DMSO)提取。两倍稀释的提取在营养肉汤分发96孔酶标。一夜之间液体的文化金黄色葡萄球菌细胞被调整到0.5麦克法兰的标准做出最后2×10的浓度6CFU /毫升。剂被放置在每一个和孵化24小时在一个孵化器(实验室的医生TMMIDSCI有限公司美国谷公园)。环丙沙星是作为积极的控制而营养肉汤和DMSO溶液的混合物作为消极的控制。细菌悬液没有提取物被用作生长控制。预培养阅读记录在590 nm使用Genios Pro标(位于瑞士苏黎世Tecan Group Ltd .)。Postincubation读数记录后24 h和细胞MTT试验进行可行性测试。分析涉及的每个,MTT染色孵化至少2 h,然后观察颜色的变化。
2.4。确定最低抑制浓度和最低杀菌浓度
确定最有效的提取的麦克风,400股票的解决方案µg / mL的提取制备。两折叠系列稀释在96孔酶标被做使用营养肉汤获取以下浓度:200年,100年,50岁,25岁,12.5,6.25,3.125,1.562和0.781µ克/毫升。细胞暴露于提取被孵化24 h和麦克风。的最低抑制浓度(MIC)确定的最低浓度的提取没有明显的增长金黄色葡萄球菌被观察到。确定最有效的提取的MBC,接种从井一半麦克风,麦克风,麦克风接种在营养琼脂板的两倍。板是孵化,24小时后观察。的浓度没有明显的增长金黄色葡萄球菌观察是MBC指出。
2.5。筛查胞外蛋白酶的生产
筛查的生产胞外蛋白酶是由蛋白酶活性的检测方法在琼脂板被Vijayaraghavan和文森特18)做了一些调整。一夜之间的文化金黄色葡萄球菌细胞标准化做出最后1×10的浓度6CFU /毫升。营养琼脂股票的混合200µg /毫升的最有效的提取制备以及1% (w / v)脱脂牛奶和0.0015% (w / v)溴甲酚绿(BCG)。串行两倍稀释的营养琼脂混合股票于100年获得执行µg / mL营养琼脂混合相同的提取。这些都是倒在两个单独的培养皿和允许集。第三个培养皿中包含BCG-skim牛奶琼脂没有提取做好准备。对蛋白酶活性筛选,5µL的标准化金黄色葡萄球菌细胞被放在所有BCG-skim牛奶琼脂板准备和孵化在一个孵化器。板块观察24小时后的蛋白水解作用的任何区域。蛋白水解区测量、记录和表达值根据以下方程:
2.6。统计分析
分析使用GraphPad棱镜为Windows,版本8.4.3 (GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)。统计分析的结果用单向方差分析来完成。其次是Bonferroni多重比较的测试和价值观 被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。植物提取物
总百分比收益率和串行详尽的拔牙进行根叫o .试被确定为在桌子上吗1。百分比收益率表示为干重的比值的植物提取物的重量植物用于提取过程。比例最高的产量来自乙醇:水提取物(15%),其次是甲醇提取物(10%)。从水中提取获得的比例最低收益率(2%)。颜色的一致性和根树皮提取物干燥后如表所示1。所有根树皮提取物有一个棕色的颜色除了己烷提取淡黄色。乙酸乙酯和正己烷提取物粘性固体在所有其他提取固体。
3.2。抗菌活性的o .试根皮提取物
9提取物抑制增长的百分比o .试根叫对金黄色葡萄球菌据国家反恐怖主义中心(6571)如表所示1。典型的结果的确定增长的抑制百分比图所示1。减少光密度(OD)观察在590 nm提取物的浓度增加。最有效的提取是乙酸乙酯提取物的抑制百分比为99%。这是DCM提取以93%紧随其后。最有效的提取是扩张型心肌病:甲醇提取物的抑制百分比为29%。
(一)
(b)
3.3。确定的最低抑制浓度和最低杀菌浓度
最有效的乙酸乙酯提取物的抗菌效果研究在更广泛的浓度范围为0到200µ克/毫升。最低浓度的提取表现出完全抑制增长金黄色葡萄球菌是100µ克/毫升,如图2(一个)。乙酸乙酯提取物的MIC值大于标准的药物环丙沙星。0.125环丙沙星的麦克风µ克/毫升,如图2 (b)。调查乙酸乙酯提取物的杀菌效果金黄色葡萄球菌据国家反恐怖主义中心(6571)表明,提取抑菌浓度和测试,因此,MBC是大于200µ克/毫升。
(一)
(b)
3.4。筛查胞外蛋白酶的生产
胞外蛋白酶的生产金黄色葡萄球菌检测到的区域的间隙在殖民地BCG-skim牛奶琼脂板如图3。晕圈的大小是成正比的蛋白酶产生的数量。在乙酸乙酯萃取物的存在,晕圈的大小是小而积极的控制(没有提取)。光环的大小变得不那么明显的浓度乙酸乙酯提取从100增加到200µ克/毫升。分析是基于能力的蛋白酶水解蛋白琼脂。然而,蛋白酶活动可能被表达的蛋白水解活性( )值如表所示2。强烈的蛋白水解活性观察到积极的控制 )而温和的( )和弱( )蛋白水解活动观察100年的存在µ克/毫升和200年µg / mL,乙酸乙酯提取物的分别。没有增长,光环或蛋白水解活性观察消极的控制。
4所示。讨论
不同比例的产量提取总提取观察和串行详尽的痛苦。这些差异可能是由于不同极性溶剂的使用(19)和植物化学物质的溶解度在各自的溶剂。不同的植物化学物质的结构决定了他们在不同极性的溶剂的溶解度(20.]。更高比例的复苏可榨出的化合物主要来自观察到极性溶剂如甲醇和乙醇:水(50:50 v / v)总和串行详尽的痛苦。这与非极性溶剂和中等极性的溶剂如己烷、扩张型心肌病、丙酮和乙酸乙酯。获得的更高的收益率从极性溶剂可能是由于更高的溶解度可榨出的生物活性成分,如碳水化合物和蛋白质(20.]。因此,这些观察结果可能表明o .试根叫富含极地植物化学的化合物。
所有的提取证明反金黄色葡萄球菌活动。提取物的抗菌活动观察到的差异可能是由于不同提取物抗菌化合物的浓度。浓度越高的抗菌化合物提取,提取物的抗菌活性越大。最有效的提取是乙酸乙酯提取麦克风100µ克/毫升。这意味着,在一个100的浓度µg / ml的乙酸乙酯提取,完全抑制的增长金黄色葡萄球菌。此观测结果表明,乙酸乙酯提取物有较高抗菌化合物的浓度比其他提取。乙酸乙酯是中等极性的溶剂,能够提取极性和非极性化合物。植物化学的分析o .试显示,植物包含化合物等精油,anacardic酸、银杏酸、单宁和类黄酮(21]。这些化合物被证明使用乙酸乙酯作为提取溶剂和提取有抗菌性21]。因此,这些化合物也可能出现在我们的样例和负责的抗菌活性。
精油由萜烯、萜类化合物和芳香族化合物(22]。这些化合物的某些部分疏水和一些可能是亲水的,这取决于它们的结构。精油中发现o .试包括tirucallane三萜烯和一个-elemolic酸酯(21]。精油已被证明有抑制活性对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性球菌。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层允许疏水物质,如精油通过并到达内部环境(23]。精油的作用机制对革兰氏阳性细菌的建议是通过破坏细胞壁和细胞质膜,细胞质凝结,改变脂质双分子层的渗透率和函数(24]。
Anacardic酸抑制的增长金黄色葡萄球菌通过几种机制。首先,anacardic酸破坏的细胞膜金黄色葡萄球菌通过充当表面活性剂(25]。其次,两亲的anacardic酸能够抑制细菌的呼吸。这是通过与电子传递链的交互系统和atp酶。第三,anacardic酸已报告有一个铁等金属离子螯合效应2 +和铜2 +(26]。这减少了离子对细菌的可用性。第四,anacardic酸有抑制活性ß内酰胺酶负责ß内酰胺抗生素耐药性(27]。最后,anacardic酸已报告在细菌细胞抑制脂肪的合成。的机制是通过抑制glycerol-3-phosphate脱氢酶酶(28]。银杏酸也影响的增长金黄色葡萄球菌。银杏酸的抗菌机制的研究显示,他们可能影响许多酶的活动负责的生存的细菌如蛋白质磷酸酶,脂氧合酶,组蛋白乙酰转移酶(29日,30.]。此外,在另一项研究中,据透露,银杏酸能抑制DNA复制、RNA转录和蛋白质合成在革兰氏阳性细菌体内31日]。单宁已报告抑菌或杀菌金黄色葡萄球菌。单宁的收敛性质可能与酶诱导络合或基板(32]。许多细菌酶的抑制与单宁混合。此外,单宁影响细菌的细胞膜。黄酮类化合物也被报道对拥有有趣的抗菌机制金黄色葡萄球菌。这些也可能占的效果乙酸乙酯提取的成长金黄色葡萄球菌观察到。类黄酮影响的增长金黄色葡萄球菌通过抑制DNA, RNA和蛋白质合成。建议的机制的行动是通过夹层与核酸类黄酮(33]。的抑制作用金黄色葡萄球菌增长黄酮类化合物是通过膜破坏,因为他们已报告导致钾泄漏金黄色葡萄球菌细胞从而减少他们的生存能力34]。类黄酮还破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的无序化膜脂质,通过改变细胞膜的流动性在亲水和疏水区域(35]。
乙酸乙酯提取被用来屏幕的胞外蛋白酶的生产金黄色葡萄球菌。区域的间隙直接产生的胞外蛋白酶的数量成正比金黄色葡萄球菌。更大的间隙区观察到积极的控制是因为没有补充提取到媒体。因此,没有抑制细胞外蛋白酶的生产金黄色葡萄球菌。区间隙明显降低乙酸乙酯萃取物的存在。间隙的区域的大小直接与乙酸乙酯提取物的浓度成正比。间隙的区域观察到100µg / mL的乙酸乙酯提取相比,规模更大,在200年µ乙酸乙酯提取物的g / mL。这表明乙酸乙酯提取的有效性在抑制细胞外蛋白酶的生产金黄色葡萄球菌随着它的浓度增加。
乙酸乙酯提取的有效性,抑制细胞外蛋白酶的生产也可以解释的蛋白水解活性值。这个参数是用来量化的程度产生的胞外蛋白酶水解蛋白质在琼脂媒体。越大值,较弱的蛋白水解活性细胞外蛋白酶。蛋白水解活性变弱的乙酸乙酯提取物的浓度增加,从0µ克/毫升(积极控制)到200年µ克/毫升。这表明,在更高浓度的乙酸乙酯提取物、产生的胞外蛋白酶的量金黄色葡萄球菌很低。更少的蛋白酶水解蛋白质的存在琼脂媒体。结果,这表明乙酸乙酯提取的有效性在抑制细胞外蛋白酶的生产。
BCG-skim牛奶琼脂板允许定性测定蛋白酶活性。BCG试剂结合unhydrolysed蛋白在脱脂牛奶琼脂板上。试剂pH-dependent,显示了一个蓝绿色的颜色在unhydrolysed蛋白(18]。在细胞外蛋白酶金黄色葡萄球菌,媒体中的蛋白质水解氨基酸。这降低了pH值和解放BCG试剂导致不同的清晰的观察到的区域。
抑制生产金黄色葡萄球菌胞外蛋白酶的乙酸乙酯提取物o .试根叫可以归因于几个机制。o .试据报道含有tirucallane三萜烯(21]。这些也可能出现在乙酸乙酯提取。三萜和常用药用生产的差别与对这些分泌蛋白(36]。而这种现象的确切作用机制仍然是未知的,提出了几个建议。例如,众所周知,三萜烯有可能抑制蛋白酶二聚作用[37]。这是由于三萜烯的分子大小,让他们融入蛋白酶单体的疏水接口放松。在这个过程中,生产功能性蛋白酶可能抑制。此外,蛋白酶和羟基之间的氢键可能/羧基组三萜支架(38]。
细菌毒力因子的生产是由群体感应系统。群体感应(QS)是指微生物通过发送和接收化学信号调节他们的行为(autoinducers)。金黄色葡萄球菌使用QS调节毒性因素包括胞外蛋白酶的生产。一些植物化学物质已被证明有QS系统的抑制作用金黄色葡萄球菌。抑制剂,目标毒性因子生产的QS系统影响毒力因子的转录和翻译(39]。因此,这表明,乙酸乙酯提取物o .试根叫可能含有植物化学物质抑制或淬火QS系统,因此,防止细胞外蛋白酶生产。
5。结论
根树皮提取物o .试抑制的增长金黄色葡萄球菌。最有效的抑制剂的发展金黄色葡萄球菌是乙酸乙酯提取和抑菌。乙酸乙酯提取物抑制细胞外蛋白酶的生产金黄色葡萄球菌。根皮提取物o .试因此,包含有前途的植物化学的化合物可以对抗引起的感染金黄色葡萄球菌。这可能减少的严重程度金黄色葡萄球菌感染和耐药性的发展金黄色葡萄球菌。
缩写
| DCM: | 二氯甲烷 |
| 麦克风: | 最低抑制浓度 |
| MBC: | 最低杀菌浓度 |
| 麻省理工: | (3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| 据国家反恐怖主义中心: | 国家的集合类型的文化 |
| 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌: | 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 |
| MSSA: | Methicillin-susceptible金黄色葡萄球菌 |
| 波士顿咨询公司: | 溴甲酚绿 |
| OD: | 光密度 |
| q: | 群体感应 |
| 情事属实者: | 重症监护单位。 |
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者承认克里斯托弗Chapano先生的帮助,一个分类学者与国家植物标本和植物园,哈拉雷,津巴布韦,在工厂的验证样本的名字。瑞典国际发展机构的支持(SIDA)通过国际科学项目(ISP)(国际项目在化学科学(乌普萨拉大学,乌普萨拉,瑞典,ISP国际:ZIM01)与国际基础科学(IFS F / 3413 - 03 - F,斯德哥尔摩,瑞典)承认。/ 3413 - 03 - F支持下研究标题“筛选天然植物产品从选定的植物来自津巴布韦植物学期刊发展作为抗感染药化合物的来源。“ISP国际:ZIM01支持”标题下的研究生物分子相互作用分析。“全球卫生和科学联盟的支持(加州大学伯克利分校)承认。