体外研究膜联蛋白4的规定和VEGF促人类子宫内膜

文摘

客观的。是否改变血管内皮生长因子(VEGF)和第四膜联蛋白在植入监管通过LH / hCG-R需要进一步的研究。调查的机制hCG第四膜联蛋白的表达和VEGF在人类子宫内膜细胞。方法。子宫内膜细胞分离和识别人体标本。腺上皮细胞的比例进行了分析。膜联蛋白IV和VEGF分析中存在(mRNA),免疫印迹(蛋白质),免疫组织化学(蛋白质)。蛋白质的位置被免疫组织化学鉴定。人类绒毛膜促性腺细胞培养,促性/ PD98059 (MAPK抑制剂),或没有治疗(控制)。结果。腺上皮细胞和间质细胞之间的比例接种,当添加促性分别为25.8±0.2%和27.8±0.04%,分别为( )。LH / hCG-R、膜联蛋白IV和VEGF在子宫内膜细胞的细胞质中被发现。后2、6、12和24小时的hCG治疗,与1 h, VEGF mRNA增加了1.25倍,3.19倍、4.21倍、4.86倍和膜联蛋白4到2.23倍,3.37倍,5.14倍和5.02倍。与对照组相比,第四膜联蛋白mRNA和蛋白增加hCG和hCG / PD98059组(mRNA /蛋白质:1.99倍/ 1.80倍和2.33倍/ 1.93倍, )。与对照组相比,VEGF mRNA和蛋白增加促性组(mRNA /蛋白质:2.30倍/ 1.86倍),但不是人类绒毛膜促性腺/ PD98059组。结论。人类绒毛膜促性腺移植mRNA和蛋白膜联蛋白IV和VEGF的表达。膜联蛋白IV的upregulation hCG PD98059无法抑制,但VEGF的upregulation hCG。

1。介绍

促黄体激素(LH)的行为和人类绒毛膜促性腺激素(hCG)是由相同的受体(LH / hCG-R)在人类性腺细胞(1]。LH和hCG结合LH / hCG-R激活G protein-coupled Ac(腺苷酸环化酶)- - - - - -营(环磷酸腺苷)信号通路1]。LH / hCG-R被发现在人类和其他几个物种(包括猪,免费的,猫,牛和猴子)(1]。的蛋白质和mRNA水平LH / hCG-R达到最大表达式在植入窗口(2- - - - - -4]。

血清LH峰或外源性促的作用下,子宫内膜组织转换从增殖阶段分泌阶段,进入植入窗口。在这个过程中,许多当地的分子如整合素、粘附分子,白血病抑制因子(生活),血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子也表达了(5- - - - - -7]。这些分子调节子宫内膜之间的相互承认和接受能力和植入前胚胎,这对成功的植入是至关重要的。

第四膜联蛋白是一种蛋白质在细胞融合发挥作用,细胞膜吞吐量和细胞骨架的活动(8]。VEGF调节血管生成和血管通透性9]。这两种蛋白在胚胎植入和生存能力上发挥了关键作用10,11]。然而,这些基因的表达水平的变化是否和蛋白质在植入直接或间接监管通过绑定LH和hCG LH / hCG-R需要进一步的研究。

因此,本研究的目的是调查的机制hCG第四膜联蛋白的表达和VEGF在人类子宫内膜细胞在体外培养模型。

2。材料和方法

2.1。组织收集

本研究登记病人将经历宫腔镜子宫内膜刮除术或手术后期由于子宫肌瘤子宫切除术或月经周期的中间扩散阶段。入选标准如下:(1)20-45岁,(2)规律的月经周期,(3)没有服用激素药物的历史在过去3个月。子宫内膜组织所收集到的7名女性子宫镜检查(n= 5)或子宫切除术(n= 2)中山大学第一附属医院2012年3月至2012年12月。伦理委员会批准的这项研究是中山大学第一附属医院(2012 - no.284)。签署书面知情同意形式是所有的病人。

2.2。主细胞培养和分组

每个子宫内膜样例与无菌水洗三次磷酸盐(PBS),切成1 - 2毫米(3]部分,为40 - min其中0.25%胶原酶消化I型(Gibco,英杰公司Inc .)、卡尔斯巴德、钙、美国)和0.005%的DNA酶(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。悬架是透过150µ米尼龙网收获子宫内膜细胞。细胞被resuspended到离心管,离心5分钟在500×g。收集细胞颗粒,细胞保持在杜尔贝科的修改中DMEM / F12 (Gibco)补充10%胎牛血清(美国表达载体Inc .,卡尔斯巴德,CA)和1% penicillin-streptomycin(生命科技有限公司大岛,纽约,美国),在5%的股份有限公司₂气氛在37°C。台盼蓝的方法被用来测试细胞的可行性。至少5天前的细胞培养实验。这些细胞被镀在5×10⁵细胞/板和培养24小时。细胞被分组为对照组,促性集团和hCG / PD98059组。hCG组治疗20 U /毫升hCG (Livzon集团Livzon制药厂、北京、中国)24 h。的线/ PD98059组接受20 U /毫升hCG和50µ摩尔/毫升PD98059(选择性MAPK抑制剂)24 h (VEGF实验)或12 h(第四膜联蛋白实验)。对照组没有hCG或PD98059孵化。

2.3。免疫细胞化学(ICC)检测

培养子宫内膜细胞接种于无菌盖玻片在1×10⁵/毫升和培养的氛围中5%的股份有限公司₂在37°C 5天,与PBS洗3次,浸泡在甲醇−20°C 10分钟,并阻止5%正常山羊血清(上天)37°C为30分钟。这些细胞被孵化一夜之间在4°C主要抗体:角蛋白(ab51054;1:100;Abcam,剑桥,英国),腺上皮细胞波形蛋白(ab254015;1:100;Abcam)基质细胞,anti-LHR (sc - 25828;1:50;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),膜联蛋白四世(3175 - 1;1:500;美国RabMabs,伯林盖姆,CA), VEGF (sc - 705; 1 : 50; Santa Cruz). PBS, instead of the primary antibody, was used for negative control. The secondary antibody was HRP-linked anti-mouse IgG (7076S; 1 : 1500; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) for 30 min at room temperature. The staining was revealed with DAB for 3–5 min. The cells were counterstained with hematoxylin for 30 s. The cells were dehydrated and mounted with a mounting medium (Wuhan Boshide Biotechnology Co., Wuhan, China). Examination and photography were performed using an inverted microscope (Carl Zeiss GmbH, Oberkochen, Germany).

2.4。腺上皮细胞和基质细胞识别

接种时细胞进行评估并与hCG治疗后。免疫组织化学是用来确定基质细胞和腺体上皮细胞在10个字段的视图在显微镜下。基质细胞和腺体上皮细胞数,和他们的比例计算。

2.5。Quantitative-Polymerase连锁反应(存在)

总RNA提取使用试剂盒(表达载体)。总RNA (2µg) reverse-transcribed根据制造商的指示。基因表达的相对量化进行了一式三份,每个基因使用7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。寡核苷酸引物由上海英俊生物技术有限公司,音译设计有限公司(上海,中国)。膜联蛋白IV正向引物(GAG CAC猫CGG CAG GGA CT),膜联蛋白IV反向引物(柠檬酸TAC AGC ACC GTG GGC GT), VEGF向前底漆(ACC太极拳ACC ATG CCA AGT GGT C), VEGF反向引物(TGT CCA CCA GGG TCT CGA TTG GA),β肌动蛋白正向引物(CGG ATG苑ACG柠檬酸CAC TT),和β肌动蛋白反向引物(GTT GCT ATC CAG GCT GTG GT)是用于PCR使用SYBR绿色我工具包(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士),根据制造商的指示。

2.6。西方墨点法

总蛋白提取使用里帕缓冲区。细胞提取物离心机,浮在表面的蛋白质是量化使用BCA蛋白质分析工具包(P0010;海门Beyotime生物技术研究所,中国),根据制造商的指示。蛋白质(40µg)是解决使用10% sds - page,转移到硝化纤维膜,阻止了5%的脱脂牛奶tris-buffered盐水(TBS) (Bio-Rad、大力神、钙、美国),第四,分别探索膜联蛋白抗体(膜联蛋白四世(3175 - 1;1:5000;RabMabs)和VEGF抗体(sc - 705;1:200;圣克鲁斯)一夜之间在4°C。膜清洗在TBS和孵化1 h anti-mouse免疫球蛋白HRP-linked抗体(# 7076年代;1:1500;细胞信号技术)。细胞膜受到autoradiographic电影。使用凝胶光密度分析带强度进行职业分析4。

2.7。统计分析

数据被表示为平均值±标准偏差。执行统计分析使用GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。存在和免疫印迹分析的数据方差分析或Wilcoxon测试。值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。腺上皮细胞和基质细胞的免疫细胞化学

子宫内膜上皮细胞细胞角蛋白染色阳性,而基质细胞波形蛋白染色阳性(图1)。细胞计数和计算他们的比例后,结果表明,腺上皮细胞和间质细胞之间的比例接种,当添加促性分别为25.8±0.15%和27.8±0.04%,分别为( )。

3.2。免疫组织化学LH / hCG-R

免疫组织化学LH / hCG-R表明LH / hCG-R积极在子宫内膜细胞的细胞质(图2(一个))。LH / hCG-R -控制(图2 (b))。

3.3。膜联蛋白IV和VEGF本地化

第四为第四膜联蛋白细胞定位表明,免疫组织化学膜联蛋白是积极的子宫内膜细胞的细胞质(图3(一个))。VEGF在子宫内膜细胞细胞质(积极的人物3 (c))。控制细胞呈阴性(数字3 (b)和3 (d))。

3.4。膜联蛋白IV和VEGF的表达与hCG治疗后

细胞hCG组服用最后一个20国际单位/毫升hCG的浓度。提取总RNA和蛋白质在1、2、6、12、24、48小时。与1 h治疗相比,mRNA的表达VEGF在2 h增加了1.25倍,3.19倍6 h,在12 h, 4.21倍4.86倍在24 h,并在48小时(图4.82倍4(a)和表1)。与1 h治疗相比,膜联蛋白的mRNA表达四世在2 h增加了2.23倍,3.37倍6 h, 5.14倍12 h,并在24小时(图5.02倍4(b)和表2)。与1 h治疗相比,VEGF蛋白表达增加时间和达到24 h(图4(c)和表3)。与1 h治疗相比,第四膜联蛋白的蛋白表达增加了在时间和达到24 h(图4(d)和表4)。

3.5。膜联蛋白IV和VEGF表达的控制、hCG和hCG / PD98059组

与对照组相比,第四膜联蛋白mRNA表达的hCG水平组在治疗后明显高于20国际单位/毫升hCG 12 h (+ 98%, )。当处理20国际单位/毫升hCG 12 h,第四膜联蛋白mRNA表达水平增加了1.99倍( );当接受20国际单位/毫升hCG和MAPK抑制剂PD98059(50个人/毫升)12 h,第四膜联蛋白mRNA表达水平增加了2.33倍( )(图5(a)和表5)。没有差异的线和线/ PD98059组。当处理20国际单位/毫升hCG 12 h, VEGF mRNA表达水平增加了2.30倍( );当接受20国际单位/毫升hCG和MAPK抑制剂PD98059(50个人/毫升)12 h, VEGF mRNA表达水平增加了1.13倍( )(图5(b)和表6)。

类似的结果观察膜联蛋白4蛋白表达,促性组的1.80倍和1.93倍的线/ PD98059集团(包括 )(图5(c)和表7)。没有差异的线和线/ PD98059组。类似的结果也观察VEGF蛋白表达,促性组的1.86倍和1.07倍的线/ PD98059集团(包括 )(图5(d)和表8)。没有差异的线和线/ PD98059组。

4所示。讨论

有可能,VEGF和第四膜联蛋白是调节通过LH / hCG-R在胚胎植入,但数据是必要的。因此,本研究旨在探讨机制hCG第四膜联蛋白的表达和VEGF在人类子宫内膜细胞。目前的研究表明,人类绒毛膜促性腺移植mRNA和蛋白膜联蛋白IV和VEGF的表达。膜联蛋白IV的upregulation人类绒毛膜促性腺不涉及MAPK通路,但VEGF的upregulation hCG MAPK。这些结果强调膜联蛋白的调节IV和VEGF在植入窗口。

Lei et al。12]报道LH / hCG-R mRNA的表达人输卵管上皮细胞。自那时以来,许多研究先后报道,也有LH / hCG-R表达式配子,早期胚胎/囊胚,输卵管、子宫、子宫颈、胎盘、胎膜、脐带,子宫内膜癌RL95-2细胞(13- - - - - -15]。目前的研究证实,LH / hCG-R蛋白质表达了对人类子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞体外免疫组织化学。

子宫内膜的形态和功能是由激素高度依赖他们的监管。转换的增殖期子宫内膜着床窗口是由雌激素,孕激素,可能由其他未知因素。LH峰是最关键因素促进卵母细胞成熟、胚胎发育、同步子宫内膜接受(16,17]。LH / hCG-R在子宫内膜的表达提示LH / hCG-R可能作为一种信号,提示胚胎植入和发展。另一方面,LH / hCG-R可能参与了胚胎和母体子宫内膜之间的对话在植入过程中,同步的两个实体值得进一步研究。

胚胎在子宫腔和子宫内膜分泌蛋白质和地方因素达到相互识别和融合,完成植入过程。LH和hCG结合LH / hCG-R和激活G蛋白。G蛋白进一步激活三个下游信号通路:(1)Ac-cAMP信号通路;(2)磷脂酶c (PLc)三磷酸肌醇(IP3) /甘油二酯(DAG) pkc途径;和(3)MAPK通路18,19]。

MAPK通路中扮演一个重要的角色在细胞生长,增殖,分化。MAPK通路主要介导的过程转导细胞外信号,它可以调节基因表达水平和激活酶在细胞质基质。MAPK通路参与类固醇激素的调节生产在人类卵巢颗粒细胞和胎盘细胞(20.,21]。LH和hCG可以激活ERK1 / ERK2(两个主要MAPKs)黄体颗粒细胞的途径22,23]。MAPK PD98095抑制剂U0126可以抑制ERK1 / ERK2通路,从而影响明星的表达。在这项研究中,在添加hCG和PD9809之后,第四膜联蛋白的蛋白质和基因表达水平没有显著变化与hCG组相比,表明第四膜联蛋白在子宫内膜细胞hCG的规定并不是通过MAPK通路。另一方面,治疗后与hCG和PD9809蛋白质和基因表达水平的VEGF表达下调与hCG组相比,表明MAPK途径的参与。

膜联蛋白IV属于Ca^{2 +}端依赖phospholipid-binding蛋白质家族。后被激活^{2 +}第四,膜联蛋白与膜磷脂结合,参与抗凝、抑制磷脂酶A₂活动,膜和细胞骨架的相互作用,形成离子通道,Ca^{2 +}端依赖信号,内吞作用和胞外分泌[24]。膜联蛋白四世也参与细胞生长、分化、形态转换过程,和抗炎作用24,25]。第四膜联蛋白在子宫内膜的作用仍不确定。墨金等。26)指出,在月经周期中,第四膜联蛋白mRNA水平分泌期明显高于增殖阶段。Ponnampalam和罗杰斯(27第四]报道膜联蛋白周期性改变在整个月经周期。第四他们的研究结果表明,膜联蛋白mRNA和蛋白表达水平开始增加分泌早期阶段和高峰midsecretory阶段。第四膜联蛋白的表达水平相关的分泌阶段孕酮水平(28]。在这项研究中,蛋白质和基因表达水平的第四膜联蛋白显著调节促组。这是不同于和李的研究[14RL95-2]。两项研究之间的差异可能是由于不同浓度的hCG干预,治疗时间,标本分离出的细胞系,细胞之间的区别。

VEGF及其受体调节血管通透性(29日]。同时,血管通透性的改变参与子宫内膜的成熟和植入窗口(30.,31日]。Hosper et al。32)表明,VEGF礼物在月经周期规律的周期性变化对子宫。灯等。33,34]介绍了hCG进入子宫腔装置,使用微量透析可把时程延长表明促性可以移植VEGF水平。Berndt et al。35)确认的规定人类绒毛膜促性腺VEGF通过LH / hCG-R,以便激活子宫内膜上皮细胞和内皮细胞的血管生成活动。这表明人类绒毛膜促性腺的监管角色通过LH / hCG-R子宫内膜血管。丝绸手帕等。36)表明,VEGF降低与年龄和可能参与不孕。Paiva et al。37)使用hCG VEGF表达增加。在目前的研究中,蛋白质和mRNA表达的VEGF水平明显调节促组与对照组相比。这是由上面的文献支持。

总之,子宫内膜形态学和功能转换监管不仅是类固醇激素、细胞因子和粘附分子还通过直接hCG或LH。人类绒毛膜促性腺移植mRNA和蛋白表达的膜联蛋白IV和VEGF水平。人类绒毛膜促性腺的影响膜联蛋白四世不涉及MAPK途径而是VEGF涉及MAPK通路。这两个蛋白的变化参与子宫内膜接受。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

伦理委员会批准的这项研究是中山大学第一附属医院(2012 - no.284)。

同意

签署书面知情同意形式是所有的病人。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

郑胜耀x进行所有的实验和生产描述初稿的手稿。j·l·直接导致了研究设计和实验内容,并准备提交和手稿的最后修订的草案。l . y . g .协助与实验方法。x y . c, s .问:c .导致了材料收集。

确认

作者感谢江JunXiu刘博士和YeHong援助与子宫内膜组织的集合。本研究支持由中国自然科学基金会(2008 - 30872762)和广东省自然科学基金(2009 b030801022)。

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