活动的Phosvitin羟磷灰石酸液伤害浸和抗菌化验

文摘

Phosvitin,最高度磷酸化metal-binding蛋白质在自然界发现的,超过100的钙离子结合,已被确定为一个代理,可以用来生成生物矿化支架。因为发布的报告描述phosvitin亲和力的钙和潜在的抗生素活性,本研究是为了评估phosvitin抗生素对常见的微生物活动和保护从酸羟磷灰石表面破坏的能力。更清楚地定义其抗生素行动,phosvitin的影响微球菌危害,p .奇异君子兰,b的仙人掌,大肠杆菌,美国epidermidis进行了评估。Kirby-Bauer测试和液体培养生长抑制化验,phosvitin抑制m .危害,微生物在人类的嘴巴,而不是其他细菌测试。31.3 phosvitin决心的麦克风μ当在1毫米CaCl g / mL₂但0.5毫克/毫升在缺乏钙补充道。扩大的潜在影响phosvitin口,其作用是评估模型的蛀牙由acid-damaged羟磷灰石光盘。SEM、AFM和法斯分析显示预处理的光盘与phosvitin调制损害形态和地形变化与acid-damaged光盘有关。

1。介绍

蛀牙会影响45.8%的美国人口老龄化从12到19岁1]。预防蛀牙是一个主要的目标,开始对饮食和口腔卫生教育,还包括未来潜在的治疗可能涉及生物活性制剂的使用保护或增加牙釉质(2- - - - - -5]。代理正在测试的搪瓷保护剂包括羟磷灰石纳米粒子(3,4,6)和钙结合肽(5,7]。同时,包括抗生素在牙科治疗患者受益。肽和蛋白质有助于对抗生素活动;除了报道,阴离子肽港口一般抗生素潜力(8),钙结合肽几件物品已经被确认为抗生素属性也可以提供一个钙储层(9,10]。考虑到一个代理,促进钙沉积和抗生素活动可能促进口腔健康,蛋黄粉蛋白质的性质,包括钙结合和阴离子特性,建议phosvitin龋齿的预防提供了一个强有力的候选人。

Phosvitin是最磷酸化蛋白在自然界发现的(11,12),结合127钙离子在pH值6.5 [12]。占60%的鸡卵黄磷蛋白,这种蛋白质具有氧化还原活性(13),促进生物矿化(14,15),以及充当抗生素当细菌被放置在压力下(16,17]。除了发生calcium-induced构象变化(18- - - - - -20.],phosvitin被认为形成calcium-phosvitin聚集在高浓度的钙和疏水性补丁的N⁻和C⁻目的地(18,19]。有几个原因包括一般相似性与牙齿矿化相关的蛋白质,phosvitin似乎提供了一个优秀的候选人用于保护珐琅质。然而,它与羟磷灰石表面没有被描述,和数据对其抗菌效果是有限的。

Phosvitin抗菌活性测试面板的细菌,不仅被选为他们的可用性,还因为他们通常的一部分人类biome-some健康和其他疾病。变形杆菌常常可以发现在胃肠道系统,可引起尿路感染21,22]。蜡样芽胞杆菌产生毒素是一种革兰氏阳性细菌,是常见的土壤和食物,会引起肠道感染,眼睛、肺部和伤口的23,24]。大肠杆菌是最丰富的有氧细菌驻留在人类肠道中,尽管几株是一个共生的人类微生物群的一部分,一些菌株引起感染25,26]。而良性的形式是共生的,很大程度上是无害的植物的人类皮肤27),入侵的形式链球菌epidermidis感染的主要原因是由于放置手术材料(28]。最后,虽然微球菌危害,对人体皮肤和口腔微生物共同(29日,不知道对健康构成任何重大威胁人类,它与病理损害患者30.,31日]。微球菌危害可能也是一个因素在龋齿的形成32]。

这里介绍的研究表明phosvitin港口对抗生素的活动微球菌危害,但不是对其他细菌测试Kirby-Bauer盘扩散化验。同时,存在的phosvitin磷酸钙沉淀试验显示包含phosvitin沉淀形成的数量增加。此外,SEM、AFM和法斯分析羟磷灰石光盘损坏的措施表明,治疗phosvitin调节段羟磷灰石。

2。材料和方法

羟磷灰石光盘从克拉克森色谱购买产品。Phosvitin是一种礼物来自爱荷华州立大学盾安博士和准备根据李的生产方法33- - - - - -35]。从热费希尔科学获得的额外材料除非另有注明。

2.1。茜素红羟磷灰石晶体测定

茜素红羟磷灰石晶体分析是基于微量滴定板羟磷灰石抑制试验小et al。(2015) (36];然而,进行了修改,允许磷酸钙沉淀的评估和补偿的存在高酸性的环境。Phosvitin和phosvitin-derived肽消化解决方案是在重复50 mM消息灵通的缓冲溶液pH值7.4固定浓度的10µm .到一个新的1.5毫升埃普多夫管,500µL(每个解决方案添加然后混合10µL氯化钙1.0米和0.6米的磷酸氢二铵形成羟基磷灰石在溶液中沉淀。混合物在室温下孵化了4小时允许降水。样本被离心机在10000 rpm一分钟形成颗粒,因此多余的上层清液小心地删除。颗粒被沾染了500µL 5%茜素红溶液在75%乙醇。两次,泥浆被漩涡30秒,在10000转离心;颗粒是再用75%的乙醇清洗清洗解决方案删除任何剩余的自由茜素红染色。溶解羟磷灰石,最后resuspended颗粒是放置在乙酸与100年的30%µL矿物油以防止蒸发和加热热混合机在85°C 15分钟在300 rpm。然后,200年µ每个样本被转移到96 - L微量滴定板和吸光度在405 nm决心。羟磷灰石形成的变化百分比计算给定phosvitin决心通过的比率phosvitin实验的测量与控制样本中不含phosvitin。标准曲线是由混合适当数量的钙和磷酸盐的解决方案在一个1:1比例在50 mM消息灵通的缓冲溶液。

2.2。羟磷灰石盘酸液伤害浸化验

蛀牙的acid-immersion模型由Lim et al。(2009)37)是用来测量与光盘phosvitin当孵化的影响。羟磷灰石光盘放置在5毫升的反渗透(RO)水15毫升猎鹰管与盐酸pH值调整到3.26,然后处理phosvitin解决方案从0.125到1.0毫克/毫升和允许酝酿了一个月。然后,光盘被从酸性一夜之间解决方案和干真空离心。所有实验进行了一式三份。SEM分析评估盘表面形态变化,而AFM测量圆盘表面地形的变化。的钙释放光盘是由法斯的浸没式解决方案在实验的结论。

2.3。扫描电子显微镜

干羟磷灰石盘固定在扫描电镜和碳带。阀瓣支架被放置在一个Cressington溅射涂布机108汽车和涂上一层黄金粒子在全电压为一分钟。SEM图像获取与TESCAN织女星2扫描电子显微镜在20.0工作距离使用二次电子探测器的加速电压20 kV。成像中执行的每个样本一式三份;相关的具体细节记录图像呈现在图的传说。

2.4。原子力显微镜

酸洗光盘安装在AFM金属支架与碳带然后放置到力量的主要舞台区英诺华原子力显微镜。每个阀瓣与AFM激光和悬臂;收购设置报告和相应的图。

2.5。火焰原子吸收光谱

很大程度上我们的协议之后,由美国环境保护署(38和发表文献中报道39,40]。蛋白结合的钙释放到溶液中,样品被稀释1:20进ddH₂O和放置在一个50毫升圆柱形回流管,1:1的0.4毫升硝酸和0.2毫升1:1盐酸是补充道。浸渍溶液被加热在100 - 105°C使用热块;样品体积减少到10毫升,回流在95°C 30分钟。冷却样本稀释与ddH 20毫升₂然后通过一个0.2µm过滤去除颗粒。

之前分析,氮acid-digested样品与100年(20毫升)治疗µL镧溶液抑制响应等oxyanions自由磷酸盐、铝酸盐类,硅酸盐存在后消化。钙离子浓度测定钙股票组标准系列稀释的1到3 ppm。所有测量进行了一式三份。

火焰原子吸收光谱法是使用热元素执行Solaar s系列原子吸收光谱仪操作在乙炔气(10 psi)与空气混合(30 psi)。额外的仪器设置提供了有关图的传说。

2.6。Kirby-Bauer测试

phosvitin走向的抗菌活性m .危害,p .奇异君子兰,s . marcescens铜绿假单胞菌,b的仙人掌,大肠杆菌,美国epidermidis使用Kirby-Bauer盘扩散化验检查(41]。解决25毫克/毫升phosvitin 25毫克/毫升phosvitin ZnCl在1毫米₂,25毫克/毫升phosvitin CaCl在1毫米⁻₂准备直接从冻干粉。细菌生长在Luria-Bertani(磅)汤在37°C 24小时在250 rpm瓶;然后一个草坪上的细菌的解决方案是散布在盘子里。板治疗与热压处理过的滤纸,创建的光盘放置之前立即浸入适当phosvitin解决方案。草坪种植在37°C 48小时得到抑制的区域。光盘1毫米CaCl对待₂和1毫米ZnCl₂被用作控制解决方案。

2.7。最低抑制浓度决定

phosvitin的最低抑制浓度(MIC)m .危害和b的仙人掌确定根据安德鲁斯(2001)的方法(42]。这些麦克风决定用phosvitin CaCl溶解在1毫米₂确保最大加载钙的蛋白质。一个双重的连续稀释准备使用氯化钙浓度绑定phosvitin从1毫克/毫升至3.9μ克/毫升与1毫米CaCl磅肉汤₂作为一个控制磅肉汤。细菌生长在磅肉汤在37°C 24小时和10μL的细菌的解决方案是用来接种稀释。治疗在37°C培养48小时在250 rpm瓶。

phosvitin损害经济增长的能力的殖民地m .危害在溶液中没有添加钙也决定,酪蛋白的影响,和牛血清白蛋白(BSA)。实现定量,浊度测定的吸光度600海里根据科赫(1970)的方法(43)使用分子设备SpectraMax微型板块读者。

3所示。结果

3.1。羟磷灰石形成的测量

测定羟磷灰石的形成,小et al。(2015)的方法(36使用了)。然而,为了适应酸性溶液的酸损伤试验,该方法修改。除了清洗策略的变化,监测的吸收波长从560纳米到405纳米,以适应转变茜素红在酸性环境中吸收的状况。因为吸收概要的转变,茜素红的摩尔吸光系数报道560海里不能用来量化羟磷灰石形成的程度。相反,羟磷灰石形成的百分比在phosvitin与比例控制缺乏phosvitin形成。显示在图1磷酸钙的孵化phosvitin的存在增加的羟磷灰石的形成。样品孵化和phosvitin phosvitin-derived肽演示羟磷灰石形成的相对百分比的增加。虽然全身phosvitin显示钙颗粒形成增加了387%,嗜热菌蛋白酶消化phosvitin钙颗粒形成上升到234%:然而,pepsin-digested phosvitin只有颗粒形成上升到158%。这些初步的研究表明,原油比长篇phosvitin phosvitin不太有效的消化。

一般来说,茜素红试验提供了一个测量程度的磷酸钙颗粒形成。然而,这种分析的弱点;微妙的pH值变化引起染料的光谱特性的差异,和磷酸钙沉淀形成并不代表釉质中的羟磷灰石。开发一个更可靠的评估,一个使用羟磷灰石光盘使用酸性伤害模型;读数包括结构性方法包括SEM、AFM和法斯。

3.2。扫描电子显微镜

购买羟磷灰石光盘在酸浸试验,受损和phosvitin预处理的影响评估。未经处理的表面acid-damaged光盘是粗糙和包含坑和裂纹(图2(e))。Phosvitin-treated光盘出现小裂缝;这是真正的浓度phosvitin治疗检查从0.125到1.0毫克/毫升(数字2(一)-2(d))。增加电子密度在小点phosvitin-treated光盘表面,表明一层富蛋白质的形成,phosvitin,表面的羟基磷灰石。(图的未经处理的圆盘进行了分析比较2(f))。整个实验是在重复重复。

3.3。原子力显微镜

的表面形貌acid-damaged羟磷灰石光盘使用AFM(图进行评估3)。未经处理的(图3(一个))和acid-damaged羟磷灰石光盘(图3 (b))具有粗糙表面,对应酸损伤降低了光盘的钙含量。Acid-damaged光盘被孵化的phosvitin解决方案,然而,表现出一个流畅的AFM概要文件可能表明酸损伤更少。的确,有地区提高表面可能表明厚phosvitin沉积(图3 (c))。理解一个球状蛋白质是否可以防止表面粗糙度的发展,存在的酸性伤害浸试验进行1毫克/毫升牛血清白蛋白(图4(c))。BSA-treated光盘提供了一个不均匀的表面形貌,AFM概要文件的光盘没有完全概括的程度坑和裂纹形成与protein-naive羟磷灰石光盘。

3.4。火焰原子吸收光谱

羟磷灰石浸实验后保留的解决方案受到了火焰原子吸收光谱法(FAAS)以量化的程度在溶液中钙离子的释放。

图4说明治疗增加浓度的羟磷灰石盘phosvitin影响钙的数量从光盘沉浸在一个月后释放pH值3.26。图的插图4提出了用于计算的标准曲线实验样品中钙含量从零到三个ppm信号法;线性回归直线的方程,拥有一个R²0.9972。Phosvitin-naive光盘沉浸在pH值3.26平均一天发布0.557 ppm解决方案钙离子(n= 6)在溶液中,而数据报告后一个月的时间平均4.6±0.2 ppm钙离子释放到解决方案。然而,增加phosvitin 1毫克/毫升的浓度导致减少钙释放phosvitin-naive光盘相比。钙离子释放的浓度为0.7±0.1 ppm, 0.5±0.1 ppm, 0.54±0.07 ppm,和0.3±0.2 ppm光盘phosvitin处理时在0.13毫克/毫升的浓度,0.25毫克/毫升,0.5毫克/毫升,分别和1毫克/毫升。不管phosvitin的浓度测试,孵化光盘的蛋白质导致重要的钙离子的保留酸破坏试验。

综上所述,SEM, AFM,法斯结果证明phosvitin减轻损害羟磷灰石光盘在酸浸试验。扫描电镜数据提供了一种定性描述如何治疗的光盘phosvitin导致表面形态变化,反映裂缝的减少而受损光盘phosvitin的天真。AFM数据显示整体降低表面粗糙度。第三个和最后一个的一组数据考虑法数据量化的程度phosvitin阻碍钙离子的溶解羟磷灰石光盘浓度测试。

3.5。Kirby-Bauer测试

Kirby-Bauer测试显示抑制增长的治疗光盘在某些细菌物种。b的仙人掌略被25毫克/毫升phosvitin 1 ZnCl₂在1毫米和25毫克/毫升phosvitin CaCl₂(图5(一个))。m .危害抑制了所有光盘处理phosvitin从1到25毫克/毫升,用1毫米CaCl吗₂((图5 (b)ZnCl)或1毫米₂;没有其他细菌被抑制椎间盘治疗在任何浓度。

3.6。最低抑制浓度实验

进一步探索Kirby-Bauer的数据测试,抗菌的抑制b的仙人掌和m .危害确定视觉使用麦克风系列稀释的策略。CaCl phosvitin和1毫米₂被包括在分析中。在这些实验中,b的仙人掌没有明显的抑制在任何浓度小于1毫克/毫升治疗,而麦克风吗m .危害确定为略大于31.3毫克/毫升。

1毫米氯化钙是一个强烈的钙离子浓度。是否包含1毫米钙离子的影响m .危害引起了关注,作者也担心CaCl包含1毫米₂任何潜在的药学等可能对人体健康有害。因此,phosvitin-dependent抑制的增长m .危害也是评估缺乏钙补充道。而抑制细菌生长在没有添加钙,麦克风是增加到0.5毫克/毫升(图6)。无论是酪蛋白,磷酸化蛋白参与无定形磷酸钙nanocomplexes [44),和牛血清白蛋白抑制m .危害任何明显的程度(未发表的结果)。总的来说,这些数据表明phosvitin抑制m .危害当提供的钙的存在,但只是适度在缺乏钙补充道。使用牛血清白蛋白和酪蛋白复制这些影响。

3.7。应用程序的上下文中的研究文献

之前有一个报告phosvitin证明杀菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在模型中感染斑马鱼胚胎的45),这表明phosvitin对细菌放置在压力下表现出抗菌作用。本研究首次揭示phosvitin对抗菌行动m .危害,常见的革兰氏阳性Gram-variable人类微生物区系的微生物(46),扩大phosvitin作为抗菌剂的角色表演m .危害。而m .危害不被认为是龋齿的主要病原体(47),这是与他们(48,49]。一个投机取巧的病原体,它被认为是无害的,除了孤立与脓毒性关节炎的人间病例报告(50)、化脓性关节炎(51)、脑膜炎(52),和肺炎(53]。

我们的数据表明,全身phosvitin作为抗生素的代理m .危害当与1毫米CaCl交付₂33毫克/毫升的麦克风,一个相当强大的价值。然而,这种力量缺乏钙的丢失;此外,phosvitin没有抑制其他微生物测试一个非常可观的程度。钙的相关性在phosvitin已经在文献中报道;phosvitin三维构象的空气与接口依赖于钙(18]。事实上,虽然phosvitin占领更紧凑的构象在低钙水平,高钙浓度,Belhomme et al。(2007)18)建议phosvitin采用延长刷构象促进钙/ phosvitin蛋白质聚集的形成。人们很容易推测刷构象可能参与抗菌活性m .危害。

Phosvitin增加钙形成磷酸钙沉淀试验和减轻酸羟磷灰石光盘损坏。这是一致的数据Belhomme et al。18),建议形成广泛的钙/磷总量。加上抗生素数据提出报告,看起来phosvitin提供了一个理想的候选人加入配方,坚固牙齿。这一事实phosvitin可以参与胶束(54)表明,它可能有助于配方在牙科和抗生素应用方便、效果,从的角度与羟磷灰石表面相互作用和药物输送。

也有一些兴趣组件肽phosvitin能否结合钙和/或保留生物活性。当我们检查是否嗜热菌蛋白酶和胃蛋白酶消化phosvitin展示活动在我们的分析中,unpurified消化不刺激形成的钙颗粒长篇phosvitin(图一样的程度1);他们也没有表现出有意义的抗生素活动(未发表的结果)。这可能被进一步集中解决肽消化,甚至部分净化组件分数重要的是,未来的研究可能导致生物活性肽的识别。

4所示。结论

SEM, AFM,和法斯分析报告表明,治疗的羟磷灰石光盘phosvitin保护光盘对酸损伤。此外,phosvitin已被证明具有抗菌活性m .危害,但不反对其他细菌测试。由于这些原因,phosvitin可能极大的兴趣在维护口腔健康的保护牙齿对酸损伤的羟磷灰石和潜在生龋齿的活动m .危害微生物共同的嘴。

数据可用性

使用的数据来支持这个研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

确认

作者谢谢艾米丽科普的援助与利用SEM和AFM仪器。他们感谢比尔·詹姆斯帮助规划和实施法实验。盾安博士请phosvitin提供。我们应感谢詹姆斯Burritt博士的帮助与实验设计抗菌化验。Marlann帕特森博士是感谢访问部门化学和物理的仪器设备以及协助准备手稿。

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