优化小说菌的液体培养条件Hygrophoropsissp.和提取物的抗氧化活性

文摘

评价小说真菌的药理活性Hygrophoropsissp,曝气速率的影响在生产菌丝体生物量、胞外(EPS),和intrapolysaccharides (IPS)真菌Hygrophoropsissp.调查。和水提取物的体外培养Hygrophoropsissp.菌丝和抗氧化活性的发酵培养基进行了分析通过使用四种不同测定方法如羟基自由基清除、超氧化物自由基清除,过氧化氢清除,减少权力。的Hygrophoropsissp.栽培在不同曝气率在7 l生物反应器。菌丝体生物量最高(3.98毫克/毫升)和IPS生产(19.63毫克/克)得到v.v.m 4.5曝气速率。结果表明Hygrophoropsissp,总的来说,具有很强的抗氧化作用在所有化验测试活动。脱去蛋白质的提取有较强的抗氧化活性比un-deproteinized提取物通过使用超氧化物自由基清除,过氧化氢清除,减少权力。此外,un-deproteinized提取物有较强的抗氧化活性比脱去蛋白质的提取利用氢氧自由基清除。因此,多糖提取的Hygrophoropsissp.研究抗氧化活动在体外,这可能是一个很好的来源的天然抗氧化剂或进一步调查作为潜在的天然抗氧化剂。

1。介绍

等合成抗氧化剂叔丁基羟基茴香醚,丁羟甲苯用于食品添加剂而不是医疗健康因为他们的毒性1]。蘑菇是越来越有吸引力的天然无毒的抗氧化剂,和生理上的潜在来源(重要组成部分2- - - - - -4]。各种类型的真菌多糖是一个重要组成部分,它们的生物活性特性的主要因素,如造成损害,抑制细胞生长的和辐射的抑制免疫系统的细胞(5- - - - - -8]。

小说真菌叫做“Weimo”Ninghe地区天津省被发现在芦苇。子实体是黄色的,像黄油(图1)。野生蘑菇罕见但好吃,卖4000元每公斤。菌丝从子实体组织分离培养和保存在斜面培养基在我们的实验室。它被确认为Hygrophoropsissp.属于Hygrophoropsidaceae家族的序列。

这很难培养食用菌子实体,但只有正确的环境和特殊的物质。然而,真菌菌丝可以很容易地获得足量的发酵来生产生物活性补充剂,以及水下栽培方法是一个可接受的方法(4]。

与商用蘑菇产品相比,菌丝或发酵肉汤有很多优势,如短文化时期,一致的产品质量,和独立的季节性9- - - - - -11]。Hygrophoropsissp.菌丝通过被淹没在一个批处理系统培养摇瓶发酵器。的在体外提取物的抗氧化活性进行了测试使用不同的分析方法。粗多糖的生物活性建议适用于资源开发。

2。材料和方法

子实体的“Weimo”Ninghe地区,天津省。培养菌丝从组织和保存在食用菌技术研究和发展中心,天津农业大学、中国天津。

2.1。制备的液体培养基中

菌丝培养在95毫升的液体介质工作容积在三角瓶250毫升28°C,由15毫克/毫升的葡萄糖,蔗糖10毫克/毫升、和4毫克/毫升酵母粉。

2.2。液体发酵

4 L液体发酵培养基添加7 L发酵罐,已消毒。然后,媒介在121°C 20分钟消毒一次。应变种子文化添加后,曝气速率被设定为3,4.5,分别和6 L / min。收集菌丝在不同的时间间隔。样品在5000转离心10分钟;上清液和沉淀保存下来,分别为多糖的决心。

2.3。隔离的IPS和每股收益

2.3.1。提取IPS

多糖的提取方法是根据执行程序所描述的Zhang et al。12),做了一些调整。从菌丝干过滤提取的IPS的解决方案是通过热水1:10比例,由增加4倍的乙醇沉淀(90%)之后。沉淀悬浮在水中,离心除去不溶性材料。

2.3.2。提取的每股收益

原文的上层清液集中到1/2体积由旋转蒸发减压55°C。集中EPS的解决方案是治疗4倍的乙醇,然后在5000转离心10分钟得到沉淀。沉淀悬浮在水中,离心除去不溶性材料(13]。

2.4。纯化的多糖

根据文献[除蛋白工艺进行了14)与一些修改如下:粗多糖溶液添加了4倍的试剂的体积(氯仿:正丁醇= 5:1),震动了30分钟,然后休息10分钟。中间的蛋白质层被撤的混合物离心10分钟。此外,上层清液的解决方案是保留。这个过程重复3 - 5次,以确保所有的蛋白质都被删除了。

Un-deproteinized多糖纯化没有除蛋白过程但进一步过程(15),随后在除蛋白多糖纯化如下:上层清液解决方案增加了4倍体积的乙醇和保持12 h在4°C;降水是纯化多糖在5000 rpm离心法后10分钟。此外,多糖与乙醇洗2 - 3次,然后冻干;最后获得的多糖样品。

2.5。葡萄糖标准曲线的测定

多糖的产量是用苯酚-硫酸法测定在文献[16)做了一些调整。标准葡萄糖溶液制备(葡萄糖是干恒重)浓度为0.04 mg毫升⁻¹。葡萄糖溶液为0(参考),0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,和0.8毫升,分别补充到1.0毫升蒸馏水。然后,添加苯酚(5%)之后他们动摇0.5毫升,硫酸2.5毫升。吸光度测量在490 nm 30分钟后在室温下。标准曲线的绘制与多糖的浓度水平协调和吸光度值为纵坐标。

多糖样品(1毫升)代替葡萄糖的解决方案是根据上述方法决定的。

2.6。IPS的提取和优化

用水提取ip extracting-alcohol沉淀。IPS (1 g)是由旋转蒸发器,提取和上层清液用于测定。L的正交试验₉(3³)设计与固液比、提取时间和提取温度的因素。因素的水平如表所示1。

2.6.1。计算多糖的提取速度

多糖提取率的计算如下。提取的多糖率(%)=X×V/米×100%,X是样品多糖浓度(毫克/毫升),V样品体积(mL),米是质量的菌丝( )。

2.6.2。酒精沉淀多糖

5毫升的水多糖与乙醇添加到最终的乙醇溶液浓度60%,65%,70%,75%,80%,85%,90% (v / v)和静静地坐了24小时。最佳乙醇浓度得到的多糖的内容。

2.7。抗氧化能力测定

2.7.1。清除羟基自由基的能力

样品多糖的清除羟基自由基的能力是决定根据芬顿反应系统的原则与文献[17)做了一些调整。磷酸盐缓冲溶液的反应系统是由(pH值7.4)0.5毫升,藏红花的解决方案(0.5%)0.1毫升,EDTA Na_{2 -}菲^{2 +}解决方案(0.1 mol / L) 0.5毫升,多糖样品3.5毫升,H₂O₂(6%)0.4毫升。吸光度测量在520 nm在40°C水浴后30分钟。空白的是如下:样品多糖溶液取代相同体积的蒸馏水,和对照组,多糖溶液和乙二胺四乙酸钠₂菲^{2 +}解决方案都以同样的方式所取代。羟基自由基的清除速率计算如下:羟基自由基清除率(%)=(1−(Δ一个_520年样品−Δ一个_520年空白)/(Δ一个_520年控制−Δ一个_520年空白)×100%。

2.7.2。清除超氧化物阴离子自由基的能力

的能力清除超氧化物阴离子自由基(O²⁻)是决定根据焦棓酸的原则自动氧化作用[18]。每个样本的多糖溶液不同浓度(0.2毫升)混合Tris-HCl (pH值8.2)缓冲溶液(5.6毫升)。然后,焦棓酸溶液(预热25°C, 30更易/ L, 0.2毫升)添加在25°C水浴后10分钟。混合物的反应是准确的剧烈摇晃后30分钟。最后抗坏血酸(V_C)解决方案(5%,0.1毫升)被添加到终止反应。吸光度测量在420海里后休息10分钟。在对照组,0.2毫升蒸馏水被用来取代样本,在空白组,5.6毫升Tris-HC1解决方案是用来代替焦棓酸溶液。超氧化物阴离子自由基的清除速率计算如下:超氧化物阴离子自由基清除率(%)=((Δ一个_420年控制−Δ一个_420年样品)/Δ一个_420年控制)×100%。

2.7.3。还原能力

Oyaizu [19)方法用于确定样本多糖的还原力小的修改。不同浓度的多糖溶液(1毫升)混合磷酸盐缓冲溶液(pH值6.6,2.5毫升)和1%铁氰化钾溶液(2.5毫升)。混合物被动摇,在800转离心10分钟。上层清液(2.5毫升)蒸馏水和0.1%氯化铁溶液混合(分别为2.5毫升)。吸光度测量在700海里摇晃后对一个空白,休息10分钟。

第2.7.4。清除能力1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl自由基(DPPH)

DPPH自由基清除活性测定的方法花王和陈20.),做了一些调整。多糖溶液和不同浓度(3毫升)与DPPH混合溶液(0.004%乙醇,1.0毫升)。混合大力动摇了,在黑暗中休息30分钟,然后吸光度是对空白以517海里。V_C是用于积极控制。DPPH自由基的清除速率计算如下:DPPH自由基清除率(%)=((Δ一个_517年空白——Δ一个_517年样品)/Δ一个_517年空白)×100%。

2.8。统计分析

统计分析涉及的使用SPSS v.17统计分析系统。0程序。方差分析是由方差分析程序。每一项的数据代表平均值和标准偏差(SD)的三个复制。两者之间的显著差异是由图基的测试手段。值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线如图2。R广场是0.9989,显示良好的吸光度和葡萄糖溶液浓度之间的线性关系。

3.2。曝气速率的影响胞内胞外多糖多糖(IPS)和(EPS)收益

曝气速率的影响在IPS和EPS生产如图3。“诱导多能性”生产的产量高于每股收益。IPS的收益率是最高的40岁(19毫克/克)h和曝气率4.5升/分钟,而每股收益生产达成率最高(0.056毫克/毫升)40 h和曝气速度6 L / min。

3.3。IPS生产优化提取条件

范围R应用于估计每个参数的影响的大小(21]。根据正交分析表的结果2影响的大小,提取的IPSWeimo可以按菌丝一个(固液比)>B提取时间>C(提取温度)。有显著差异的三个因素对提取的IPSWeimo菌丝(表3),形成鲜明对比R值(表2),它可以发现这个参数固液比是最重要的参数的提取ipWeimo菌丝,萃取温度是最重要的参数。

具体参数的最优值可以确定基于K的结果_我在表2。在目前的研究中,每个参数的最佳值如下:一个= 1:30,B= 2,C= 85。IPS的最佳提取方法(A1B2C1)下基于正交优化方法,IPS的萃取率是11.36%。IPS的萃取率和产量高于组一个1B1C1,验证设计方法的可靠性和IPS提取的优化策略,提出了在目前的研究。

3.4。乙醇浓度对多糖的降水的影响

上层清液中多糖的产量逐渐下降,在沉淀多糖的产量逐渐增加随着乙醇浓度的增加(图4)。乙醇的浓度在80 - 85%的范围,在上层清液多糖的产量减少,相反,和沉淀多糖的产量明显增加。多糖的产量在上层清液和沉淀往往是稳定在85 - 90%。然而,在沉淀多糖的产量持续增加,当乙醇浓度达到95%。在保证的前提下最大降水多糖和节约试剂,80 - 85%的乙醇被选为实验。在这个范围内,在沉淀多糖的产量0.52 - -0.58毫克/毫升,在上层清液多糖的产量0.65 - -0.52毫克/毫升。

3.5。抗氧化活性测定

3.5.1。清除羟基自由基的能力

(1)在IPS清除羟基自由基的能力。羟基自由基的清除能力un-deproteinized IPS是比脱去蛋白质的IPS(图5)。当un-deproteinized IPS的含量在0.05 - -0.1毫克/毫升,羟基自由基的清除速率显著增加从3.21%降至9.56%。羟基自由基的清除速率时明显不同的内容un-deproteinized IPS,脱去蛋白质的IPS在0.1 - -0.4毫克/毫升。关于un-deproteinized IPS,扫气率在上述浓度范围从9.56%到11.67%,而脱去蛋白质的IPS的扫气率从7.39%到10.12%。羟基自由基的清除速率增加小的范围0.1 - -0.4毫克/毫升un-deproteinized IPS,和最大清除羟基自由基率达到11.67%的内容un-deproteinized IPS 0.4 mg / mL。与VC的解决方案相比,这两个un-deproteinized IPS和脱去蛋白质的IPS低于VC在清除羟基自由基的解决方案。VC的解决方案是在0.4毫克/毫升时,羟基自由基的清除速度达到47%,远远超过两种多糖的清除速度解决方案在0.4毫克/毫升(表4)。关于脱去蛋白质的IPS,羟基自由基的清除速率逐渐增加在粗多糖的浓缩。羟基自由基的清除速率为10.12%时,脱去蛋白质的IPS含量为0.4毫克/毫升。

(2)在EPS清除羟基自由基的能力。关于EPS,之间没有显著差异un-deproteinized EPS和脱去蛋白质的每股收益。然而,清除un-deproteinized EPS率略高于脱去蛋白质的EPS(图6)。羟基自由基的清除能力加强与EPS含量的增加(图6)。很明显,清除速率趋于稳定时的浓度EPS来自8到10毫克/毫升。此外,最大清除速率(un-deproteinized EPS)是47.1%,而脱去蛋白质的45.9%。un-deproteinized EPS和脱去蛋白质的EPS,相比之下,在清除羟基自由基低于风险解决方案。VC的解决方案是在0.8毫克/毫升时,扫气率已达到50.1%,而当un-deproteinized EPS在10毫克/毫升,扫气率为47.1%。

3.5.2。超氧化物阴离子自由基的清除能力

(1)在IPS超氧化物阴离子自由基的清除能力。超氧阴离子自由基的清除能力un-deproteinized IPS自由基明显弱于除蛋白(图7)。当IPS的浓度为0.4 mg / mL,超氧化物阴离子自由基的清除速率(un-deproteinized IPS)是29.98%,而脱去蛋白质的IPS的清除速率是51。34%。作为一个整体,VC的清除速度高于un-deproteinized IPS的解决方案。VC解决方案的扫气率为40.5%(表5)当VC浓度在0.4毫克/毫升。而脱去蛋白质的IPS的扫气率在同一浓度29.98%。关于脱去蛋白质的IPS,扫气率(51.34%)略高于VC。

(2)清除超氧化物阴离子自由基对每股收益的能力。相反,un-deproteinized EPS显示清除超氧化物阴离子自由基的能力比脱去蛋白质的EPS(图8)。清除速率显著增加每股收益的浓度在0 - 2毫克/毫升,慢慢的范围在一个浓度范围从2到10毫克/毫升。2毫克/毫升的浓度,扫气率为6.2% (un-deproteinized), 2.2%(除蛋白)而清除率达到11.1% (un-deproteinized EPS)和6.3%(脱去蛋白质的EPS) 10毫克/毫升的浓度,分别。此外,EPS对超氧化物阴离子自由基的清除能力明显低于积极控制(表5)。

3.5.3。还原能力测定

(1)还原能力测定的IPS。还原能力的价值“诱导多能性”出现在两个礼仪与浓度增加(图9)。多糖的浓度在一定范围内,脱去蛋白质的IPS的还原能力强于un-deproteinized IPS。浓度为0.2 mg / mL,脱去蛋白质的IPS的还原能力是0.044而un-deproteinized IPS是0.032。相反,脱去蛋白质的IPS的还原能力0.088浓度为0.4毫克/毫升,而un-deproteinized IPS有点高(0.09)。然而,在浓度为0.05 mg / mL,抗氧化能力太小,被检测到,因为较低的收益率。质量,减少风险的力量显然高于un-deproteinized IPS和脱去蛋白质的IPS(表6)。

(2)确定EPS的还原能力。每股收益增加的浓度,减少脱去蛋白质和un-deproteinized EPS的力量逐渐增强(图10)。在一个浓度范围从0 mg / mL 5毫克/毫升,几乎没有区别两种每股收益之间的还原能力。8毫克/毫升的浓度,减少除蛋白(0.096)的力量和un-deproteinized(0.07)每股收益显著不同。在一个浓度范围从6毫克/毫升10毫克/毫升,un-deproteinized EPS的还原能力弱于脱去蛋白质的蛋白质。10毫克/毫升,减少脱去蛋白质和un-deproteinized每股收益分别为0.104和0.108,分别。与风投正控制相比,减少权力un-deproteinized和脱去蛋白质的EPS(表威哥6)。

3.5.4。DPPH自由基清除活性

(1)在IPS清除DPPH自由基的能力。脱去蛋白质的IPS在清除DPPH自由基的能力强于un-deproteinized EPS(图11)。关于un-deproteinized IPS,扫气率从81.87%上升到87.12%,明显从0.05毫克/毫升0.4毫克/毫升。至于脱去蛋白质的IPS,扫气率达到93.35%浓度为0.1毫克/毫升。然而,低浓度的VC证明最高(表清除能力7)。

(2)在EPS清除DPPH自由基的能力。显然,没有显著区别un-deproteinized EPS和脱去蛋白质的EPS(图12)。的清除速率un-deproteinized达到92.6%而脱去蛋白质的94.1%在10毫克/毫升的浓度。总的来说,结果表明,多糖对DPPH自由基的清除能力不如VC的积极控制(表7)。

4所示。讨论

水下栽培是一种很有前途的和还未开发替代的提取生物活性分子在短时间22,23),和大规模生产需要仔细监控和控制条件下的经济和科学的原因24]。根据多糖的产量,对液体发酵优化曝气速率为4.5 L / min。结果表明,最优曝气对多糖产量率有帮助Hygrophoropsissp,导致足够的氧气供应,这是经常发现在其他真菌发酵(25- - - - - -27]。

抗氧化作用的结果表明,还原能力的能力,清除超氧化物阴离子,清除DPPH自由基的脱去蛋白质的IPS强于un-deproteinized IPS。然而,IPS在清除DPPH自由基的能力低于风险控制。清除羟基自由基的能力是弱于un-deproteinized。这些抗氧化功能都被认为主要是与提取的多糖成分,导致重要的药用功效,从而支持使用这些化合物作为活性成分的功能性产品。

尽管肽提取物抗氧化和抗癌活动,包含杂质如蛋白质的提取可能极大地限制他们的应用在医药、食品领域,如严重的过敏反应(28- - - - - -30.]。但蛋白质不能被完全移除由于密集的绑定一些蛋白多糖和糖蛋白、蛋白聚糖的存在31日]。这里,脱去蛋白质提取物显示出更强的抗氧化活性比un-deproteinized三化验测试,证明效率提取方法使生物活性小损失或蛋白质为抗氧化活动作任何努力。

在抗氧化活性的组件Hygrophoropsissp.是未知的。作为演示,多糖可能的候选人之一,拥有抗氧化活动;至少,这样的活动是丰富与多糖的浓缩水提取物来自培养Hygrophoropsissp.菌丝。然而,多糖具有抗氧化活性的确切身份尚不清楚。此外,抗氧化活动可能是由于其他丰富和多糖的成分。目前,我们正在努力净化进一步丰富的多糖和评估的身份活跃的化合物。从培养以来通过移除大部分多糖Hygrophoropsissp.菌丝的失去了抗氧化活性(数据未显示),它可以表明,多糖是关键组件表现出抗氧化作用至少部分的活动。这个结果是一样的冬虫夏草(1]。从培养丰富的多糖Hygrophoropsissp.菌丝,抗氧化活动获得的等级是不同的,这表明一些形式的测试化验多糖可能会有不同的效果。

与脱去蛋白质的每股收益相比,un-deproteinized EPS的能力清除羟基自由基和超氧化物阴离子是增加,而un-deproteinized EPS少有效的还原能力和清除DPPH自由基。此外,EPS清除DPPH自由基的能力(弱于VC控制)是最强的。结果表明,蛋白质在液体发酵提取物有一定影响多糖的抗氧化性能。这个结果是一样的polysaccharide-protein复杂(相移键控),已获得的菌丝体革盖菌属多色的蛋白质的比例高一些,更有效的抗氧化活性,清除超氧化物和羟基自由基32]。

IPS的抗氧化活动高于每股收益相同数量的所有的化验测试。分子水平上的差异和单糖成分之间的ip和每股收益可能抗氧化剂之间的差异的原因(33]。许多作品的文献报道适度减少铁的能力之间的相关性^{3 +}和总蛋白质含量,这可能是由于存在还原的半胱氨酸的氨基酸蛋氨酸和酪氨酸蛋白的提取34,35]。在目前的研究中,无论是脱去蛋白质的每股收益还是脱去蛋白质的IPS显示比un-deproteinized多糖更有效的亚铁离子螯合剂。因此,氨基酸的提取Hygrophoropsissp.可能是更多的有趣的研究。

总之,水提取物的体外培养Hygrophoropsissp.菌丝可以选择自然功能产品的添加剂。这是第一个研究评估脱去蛋白质的抗氧化能力和un-deproteinized提取物蘑菇菌丝体。然而,这些的相关性在体外结果必须支持的未来在活的有机体内研究和蛋白质提取的一部分过敏原是否应该被证明。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

梁黄和李春夏之际这项研究同样的贡献。LH和CL进行研究工作,起草了手稿。NS导致了实验设计和数据分析。YW参与编辑的手稿。和为什么我们协助进行实验试验。磅监督所有实验试验和综述了手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是财务支持的科学研究计划天津市教育委员会(20140607),天津蔬菜研究系统的创新小组(ITTVRS2017015),天津市特别项目人才发展优秀青年学者(TJTZJH-QNBJRC-2-12)和天津种业科技重大专项项目(16 zxzync00210)。

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