难题酸和提取物的影响Callistemon citrinus细胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌

摘要

金黄色葡萄球菌是常见的医院病原体之一。抗生素已经被用于治疗金黄色葡萄球菌感染。然而，耐药菌株增加了死亡率金黄色葡萄球菌．细胞外蛋白酶被认为与细胞的转变有关金黄色葡萄球菌从粘性病原体变成侵入性病原体。耐药菌株的发展使寻找新的药物来源成为必要。植物传统上被用作治疗分子的来源。本研究的目的是确定苦参酸及其提取物的作用Callistemon citrinus细胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌．肉汤微脱抗菌抗菌敏感性测定用于确定致白碱酸和提取物的抗菌作用金黄色葡萄球菌．两种提取物显示出最小抑制浓度（MIC）值为50 μ克/毫升。水：乙醇（50：50）和二氯甲烷：甲醇（50：50）萃取液被杀菌对S.金黄色葡萄球菌浓度为100时μ50 g / mlμ分别g / ml。采用蛋白酶测定法研究了苦参酸及其提取物对胞外蛋白酶产生的影响。蛋白水解活性区(Pr)测量为菌落直径与菌落总直径加上水解带的比值。苦参酸能抑制胞外蛋白酶的产生，而苦参酸能抑制胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌．发现抗白酸的PR值为1.二氯甲烷的PR值：甲醇提取物和水：乙醇提取物分别为0.92和0.84。总之，显示抗白酸抑制细胞外蛋白酶生产;因此，需要探索其在抗病毒治疗中的用途来打击金黄色葡萄球菌感染。

1.介绍

重症病例有所增加金黄色葡萄球菌由耐药菌株引起的感染[1］．感染增加的部分原因是细菌分泌的蛋白酶过多[2］．细胞外蛋白酶被细菌用来抵抗抗生素，在与宿主固有免疫系统的相互作用和皮肤脓肿的形成中生存，并作为毒性决定因素稳定性的效应物。研究表明金黄色葡萄球菌缺乏蛋白酶基因的菌株减少了脓肿的形成并损害了器官的侵袭[3.］．细胞外蛋白酶是细菌在多肽丰富的环境、血清、血液和抗菌多肽存在时生长所必需的。细胞外蛋白酶增加了细菌对身体的侵入性，因为它们能切割蛋白质，如弹性蛋白。弹性蛋白的分裂让细菌进入器官，血流让细菌扩散到身体的不同部位。细胞外蛋白酶也有助于抵抗人类白细胞的吞噬作用[4］．茄子等蛋白酶能够切割人酱油，因此赋予细菌对该蛋白质的抗性[1］．

这个机制金黄色葡萄球菌细胞控制毒力因子的产生是通过分泌蛋白酶的作用[4］．细胞外蛋白酶与毒素和其他外酶一起产生以控制其稳定性[5］．由此产生的稳定性有助于协调滴定的毒性因素，以适应生态位的具体情况。因此，细胞外蛋白酶可以被认为是毒力的主要调控因子，因为它们控制着其他毒力因子的协同表达[6］．细胞外蛋白酶产生的抑制可导致其他毒力因子的表达减少。Callistemon citrinus俗称瓶刷，因为它的圆柱形刷子，如花朵，特别是在温带地区，特别是在澳大利亚，南美和热带亚洲的温带地区7而且对津巴布韦来说是外来的。c . citrinus属于这个家庭桃金娘科．不同的部分c . citrinus在民间医学中用于治疗腹泻、痢疾、风湿病和支气管炎。先前的工作继续进行C．citrinus结果分离并鉴定了3个化合物，即苦胆酸、白桦酸和23-羟基-12-en-24-oic。扭门酸是最丰富的分离化合物，收率为粗样品的1.3% [8］．苦参酸是一种三萜化合物，已被证明具有抗菌、抗动脉粥样硬化、抗炎和抗肿瘤活性[9］．酷刑酸也被证明有肝保护作用，防止因醋氨酚过量引起的肝损伤。痛苦酸抑制由醋氨酚过量引起的活性氧的产生[10］．该研究确定了抗白酸和两种提取物的抗菌作用C．citrinus反对年代．金黄色葡萄球菌．本研究的目的是确定酷刑酸的作用，从C．citrinus在之前的一项研究中，从同一植物中提取了两种提取物，对其产生的胞外蛋白酶进行了研究年代．金黄色葡萄球菌．

2.材料和方法

2．1.试剂和化学物质

本次调查中使用的所有化学物质均为分析级，并从Sigma-Aldrich公司(Steinheit，德国)获得。其中包括二甲基亚砜(DMSO)、环丙沙星、脱脂奶粉、3-(4.5-二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基溴化四唑(MTT)、罗瑞亚肉汤碱和罗瑞亚琼脂。

２.２.微生物菌株和培养基

金黄色葡萄球菌ATCC 9144是在博茨瓦纳大学生物科学系（Gaborone，Botswana）的微生物科。将细菌保持在-35℃下甘油股。对于每个测定，细菌在37℃下在水琼脂上生长24小时，然后在肠肉汤中接种。将接种浓度调节至10的浓度⁶C.f.u / ml使用McFarland标准。

２.３.植物材料的收集和制备

C．citrinus树叶，代金券编号uz2e7，是从哈拉雷(津巴布韦大学:16.8)收集的^o年代,31.1167^oe）。叶样品由分类师进行验证，国家植物征和植物园，津巴布韦的国家植物标本和植物园和植物园的Christopher Chapano先生。在运行自来水下洗涤叶子以除去土壤和粉尘颗粒，并在50℃下在烘箱中干燥。通过砂浆和杵将叶片研磨成细粉末，进行植物提取物的制备。将大约50g粉末置于塑料烧杯中，500ml为50：50（v / v）DCM：加入粉末中的甲醇。通过将500mL 50：50（V / V）水中的50g粉末放置50g粉末来制备第二个样品。冷浸渍方法用于从粉末叶中提取植物化学物质。将得到的混合物通过No.1 Whatman滤纸过滤并使用旋转蒸发器Rii（Buchi，Labortechnikag，瑞士）在真空下浓缩。将萃取物干燥至来自风扇的冷空气流的恒定质量，从风扇中烟罩柜。将所有提取物储存在-4℃的无菌离心管中直至使用。

２.４.抗菌活性筛选

最低抑菌浓度(mic)采用(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化MTT法测定。该测定法是一种比色法，用于测定将MTT还原为福马赞的酶的活性，使代谢活性细胞呈现紫色[11］．将植物提取物溶于最终浓度为2.5%的DMSO中，在Luria培养基中稀释至所需浓度12.5、25、50和100 μg/ml，置于96孔微量滴定板中。文化的金黄色葡萄球菌(100μL)，终浓度为1 × 10⁶每孔加cf.u /ml。阳性对照为环丙沙星，阴性对照为2.5% DMSO中的Luria broth。在实验室伴侣培养箱(Jeio Tech. Co.， Seoul, Korea)中，在封闭的湿化气氛下，37°孵育24小时。使用Genios Pro微孔板阅读器(Tecan Group Ltd Mannedorf, Switzerland)，在孵育24小时前后，利用590 nm光密度的变化对细胞的生长进行定量。作为增长指标，25μ每孔加2mg /ml MTT，孵育2 h。在有细菌生长的地方观察到紫色，在没有细菌生长的地方观察到黄色。MIC被确定为没有生长的最低浓度。用MIC平板测定最低杀菌浓度(MBC)。为了测定MBC，使用MIC微量滴定板样品。从浓度小于或等于MIC的微量滴度孔中收集一圈接种物。将标本复制置于罗氏琼脂上，37℃过夜孵育24 h，观察细菌生长情况。最低浓度的无生长的提取物被认为是MBC。

2．5．苦参酸及其提取物的作用c . citrinus关于细胞外蛋白酶生产

基于Vijayaraghavan和Vincent报告的方法进行测定[12与修改)。将肉提取物1 g/L、蛋白胨5.0 g/L、氯化钠8.0 g/L、琼脂15 g/L、脱脂乳15 g/L溶解，制得体积为400 ml的脱脂乳琼脂。加入质量为0.006 g溴甲酚绿染料。溶液在Accu灭菌器(VWR科学产品公司，美国)的高压灭菌器中通过高压灭菌进行灭菌。最终浓度是100μ.g / ml折磨酸，100 μ.g / ml水：乙醇提取物和50 μ.g/ml DCM:加入甲醇提取物分离含有30 ml培养基的离心管。以环丙沙星为阳性对照，浓度为25μ.克/毫升。底片控制板，500μ.在液体琼脂中加入l的DMSO。将琼脂分别倒入六个有标记的培养皿中，并让其凝固。金黄色葡萄球菌用Luria broth稀释细胞至1 × 10浓度⁸c.f.u /毫升。体积为5μ.将L的细胞分布在琼脂平板上。将板在37℃温育48小时。为了确定蛋白酶活性，测量细菌菌落周围的菌落直径和间隙区域。测量蛋白酶活性（PR）作为如下式中计算的菌落直径与菌落加水区的总直径的比率：

3.结果与讨论

3.1。从中提取准备c . citrinus

从黄叶中制备了两种提取物C．citrinus．水:乙醇提取物的得率为9.4%，而DCM:甲醇提取物的得率为1.6%。水:乙醇的溶剂混合物具有提取多种植物化学物质的潜力[13］．可以使用该溶剂混合物提取的植物化学物质包括黄酮类化合物，皂苷，苯酚氢醌，甾醇和生物碱。除此之外，水被称为通用溶剂，因为它溶解了各种不同的分子。这是因为水有能力与其他分子形成氢键。水分子对氧气和氢原子具有极性布置。一侧，氢具有正电荷，另一侧，氧具有负电荷。这允许水分子被吸引到许多其他不同类型的分子[14］．

３．２．提取物和苦荬菜酸对其生长的影响金黄色葡萄球菌

提取物的作用c . citrinus和哭泣的酸金黄色葡萄球菌采用微量肉汤稀释法测定。两种提取物均能明显抑制白藜芦醇的生长金黄色葡萄球菌如图所示1．

DCM的抑制率分别为甲醇提取物和水：乙醇提取物分别为97.1％和97.9％。确定了两种提取物的掩星。既有提取物c . citrinus是有效的生长抑制剂金黄色葡萄球菌MIC值为50μ.克/毫升。浓度为100 μ.G /ml扭扭酸抑制了细胞的生长年代．金黄色葡萄球菌72.7％。这些发现与先前研究的研究结果一致，表明折磨酸对革兰氏阳性细菌施加抑菌作用[15］．环丙沙星，阳性对照，抑制了生长金黄色葡萄球菌．环丙沙星的MIC为0.125μ.克/毫升。通过电镀测定两种提取物的MBC金黄色葡萄球菌暴露在25μ.50 g / ml,μ.克/毫升和100μ.g/ml。两种提取物均表现出抑菌活性金黄色葡萄球菌。DCM:甲醇提取物的MBC为50μ.G /ml，水:乙醇提取物为100μ.克/毫升。植物化学物质或次生代谢物c . citrinus包括萜类和生物碱[16]可能与所观察到的抗菌活性有关。植物化学物质通过不同的机制发挥其抗菌活性。例如，单宁酸通过缺铁或与酶等重要蛋白质的非特异性相互作用发挥作用[17］．最有效的抗菌植物化学物质存在于c . citrinus树叶有报道是由于存在生物碱和酚[18］．基于提取物的抑菌活性c . citrinus在本研究中观察到的致白碱酸，提取物和致白碱酸都是有效的生长抑制剂。然而，提取物在抑制生长方面更有效金黄色葡萄球菌与苦酸相比。与分离得到的化合物相比，提取物具有较高的抑菌活性。这可能是因为，在由众多化合物组成的提取物中，其抗菌活性可能涉及协同作用[19］．

3.3。蛋白酶抑制性粘性酸和提取物的抑制活性c . citrinus

采用蛋白酶法测定苦参酸及其提取物的作用c . citrinus细胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌．从Elleboudy等人组合的PR值的参考范围。[20.]用来解释蛋白水解活性。计算了苦参酸的Pr值C．citrinus，对照样品如表所示1．

结果在表1结果表明，在含有苦酸的培养皿上没有观察到蛋白水解活性。这表明细胞外蛋白酶的产生受到了抑制。扭霉酸能抑制细胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌;因此，在营养琼脂中没有蛋白酶可以通过底物被消化。因此，苦参酸完全抑制了胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌．难题是三萜类化合物，已经证明这些组分通过减少分泌蛋白质的产生而抑制细菌的生长α-毒素、葡萄球菌肠毒素A和葡萄球菌肠毒素B [21］．抗白酸蛋白酶抑制的精确机制尚不清楚。计算机建模提出，三萜的分子尺寸适合于疏松单体的疏水界面位点，其抑制蛋白酶二聚化[22］．除了疏水相互作用外，在三萜支架中蛋白酶和羟基/羧基之间也存在氢键[23］．本研究的主要目的是筛选苦参酸及其提取物的抑制作用C．citrinus在蛋白酶生产方面，其他抑制机制的进一步研究需要在未来的研究中使用生物分析和计算机建模。在含有提取物的平板上观察到弱和温和的蛋白水解活性c . citrinus，而在阴性对照板上观察到较强的蛋白水解活性。提取物减少了细胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌．然而，与只有细胞的阴性对照板上的蛋白水解区相比，这些菌落周围的蛋白水解区相对较小。阴性对照板无提取物，有较强的蛋白水解活性。这表明,金黄色葡萄球菌产生胞外蛋白酶，消化营养琼脂中的底物，在细菌菌落周围形成蛋白水解区。对于水:乙醇提取物，从50开始，随着提取物浓度的增加，蛋白水解活性降低μ.克/毫升到100μ.克/毫升。植物提取物对蛋白酶的抑制被认为是由于抑制细菌蛋白酶参与了几个生理过程，以及抑制剂与细胞壁或质膜蛋白质之间的相互作用，从而导致细胞通透性的变化，并促使细菌死亡[24］．用含环丙沙星的琼脂平板作为阳性对照年代．金黄色葡萄球菌．在细菌中，毒力是通过细胞间的交流过程被称为群体感应(QS)来控制和协调的。几种革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌使用Qs协调毒力因子的产生表达，包括生产细胞外蛋白酶。研究表明，一些植物化学物质可以充当批量传感抑制剂[25］．本研究的结果表明，提取的植物化学物质c . citrinus可能作为抑制剂来减少细胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌．在100μ.G /ml时，扭酸的抑制率为72.7%年代．金黄色葡萄球菌但却成功地完全抑制了细菌产生的蛋白酶。已有研究表明，许多对细菌整体生长影响不大的抗菌化合物对S的表达影响较大．金黄色葡萄球菌毒力因素(26］．除了靶向细菌生长外，有效的治疗策略还应采用抗致病性或抗病毒治疗[27它的靶点是致病和毒力的细胞过程，如细胞外蛋白酶的产生。

4.结论

摘录c . citrinus和痛苦酸抑制生长金黄色葡萄球菌．提取物具有杀菌作用，苦参酸具有抑菌作用。提取物还能减少胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌，虽然折磨酸完全抑制了细胞外蛋白酶的产生金黄色葡萄球菌．致白肌抑制细胞外蛋白酶产生，可以作为防毒治疗来打击金黄色葡萄球菌感染。

数据可用性

本研究中产生和分析的数据集可在合理要求下由通讯作者提供。

的利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

致谢

本研究由国际科学计划（ISP）通过IPICS-ZIM01项目（化学科学），乌普萨拉大学，瑞典国际计划，瑞典），新兴和被忽视疾病（Cend）和加州大学，伯克利。

补充材料

采用柱层析法从苦参叶提取物中提取苦参酸c . citrinus在我们实验室之前的研究中[8］．色谱柱色谱法得到的馏分的化学结构、分子式和质谱数据（补充材料）

参考资料

1. G. J. Moran，A. Krishnadasan，R.J.Gorwitz等，“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌急诊部门患者的感染，“新英格兰医学杂志第355期7，第666-674页，2006。查看在：出版商的网站|谷歌学者
2. C. P. Montgomery, S. Boyle‐Vavra, P. V. Adem等，“社区相关甲氧西林耐药性的毒性比较金黄色葡萄球菌肺炎模型大鼠的USA300和USA400型金黄色葡萄球菌肺炎大鼠模型中的USA300和USA400型传染病杂志，卷。198，否。4，pp。561-570，2008。查看在：出版商的网站|谷歌学者
3. L. Shaw, E. Golonka, J. Potempa, and S. J. Foster，“细胞外蛋白酶的作用和调控金黄色葡萄球菌，“微生物学号，第150卷。1，页217-228,2004。查看在：出版商的网站|谷歌学者
4. S. L. Kolar, J. Antonio Ibarra, J. M. Mootz et al.，“细胞外蛋白酶是关键的介质葡萄球菌aureusvirulence通过对毒性决定因素稳定性的全局调节，”MicrobiologyOpen，第2卷，第2期1，第18-34页，2012。查看在：出版商的网站|谷歌学者
5. J.A. Lindsay和S. J. Foster，“互动调节途径控制毒力决定因子的产生和稳定，以应对环境条件金黄色葡萄球菌，“分子遗传学与一般遗传学，卷。262，没有。2，pp。323-331,1991。查看在：谷歌学者
6. M. J. McGavin, C. Zahradka, K. Rice, and J. E. Scott， "修正金黄色葡萄球菌用V8蛋白酶的纤连蛋白结合表型，“感染和免疫，第65卷，第5期7、第26 - 26页，1997。查看在：出版商的网站|谷歌学者
7. Z. M. Mohamed，M. Z.M盐，H.M.Salib，N.A.Alshanhoreyc和A. Abdel-Mygeed，“来自令人抗肠杆菌的提取物和精油的评估：抗菌和抗氧化活性，总酚类和黄酮含量，”亚太热带医学杂志，第6卷，第2期10, pp. 785-791, 2013。查看在：谷歌学者
8. R. S. Mukuwe，《柑橘愈伤子植物化学物质的分离纯化及生物学评价》，津巴布韦大学，哈拉雷，津巴布韦，2016年，药房学士（荣誉）论文。
9. Y. Zhang，F.Bao，J.u等，“抗菌木质人和三萜罗斯特兰亚州延期，“足底》，第73卷，第2期15, pp. 1596-1599, 2007。查看在：出版商的网站|谷歌学者
10. C.-T。常,s。黄,s。Lin et al.，“从枇杷体外悬浮细胞中提取的苦参酸的抗炎活性和从枇杷悬浮细胞中提取的苦参酸的体内炎性活性埃里替莫省粳稻在体外和体内，”食品化学，第127卷，第127期3, pp. 1131-1137, 2011。查看在：出版商的网站|谷歌学者
11. T. Arun和M. Rabeeth， "含扑热息痛片对培养的人淋巴细胞的遗传毒性作用"国际生物医学研究杂志， vol. 1, no. 12，页21-30,2010。查看在：谷歌学者
12. P.Vijayaraghavan和S.G.P.Vincent，“使用Bromoclegreen Dye检测琼脂平板上蛋白酶活性的简单方法，”中国生物化学技术杂志CHINESE，第4卷，第4期。3, pp. 628-630, 2013。查看在：谷歌学者
13. S. F. Sulaiman, A. A. B. Sajak, K. L. Ooi, S. E. M. Supriatno，“溶剂对提取生蔬菜多酚和抗氧化剂的影响”，食品成分与分析杂志，卷。24，不。4-5，pp。506-515，2011。查看在：出版商的网站|谷歌学者
14. K. V.V.S.Krishna，G. Surendra，M.Anjana和K.S.K.nagini，“植物化学筛查和抗菌活性Callistemon citrinus叶子提取物，“国际制药和技术研究杂志，第4卷，第4期。2, pp. 700-704, 2012。查看在：谷歌学者
15. E. M. Jovel, X. L. Zhou, D. S. Ming, T. R. Wahbe, and G. H. N. Towers, “Bioactivity-guided isolation of the active compounds from Rosa nutkana and quantitative analysis of ascorbic acid by HPLCThis article is one of a selection of papers published in this special issue (part 1 of 2) on the Safety and Efficacy of Natural Health Products,”加拿大生理学和药理学杂志第85卷第1期9，页865-871,2007。查看在：出版商的网站|谷歌学者
16. I. Cock，“抗菌活性Callistemon citrinus和Callistemon salignus甲醇提取物，“药物认知通讯，第2卷，第2期3，第50-57页，2012。查看在：出版商的网站|谷歌学者
17. A. Scalbert，《单宁的抗菌特性》植物化学，第30卷，第2期12、第3875-3883页，1991。查看在：出版商的网站|谷歌学者
18. S. M. Seyydnejad，M.Niknejad，I. Darabpoor和H. Motiamei，“水醇提取物的抗菌活性Callistemon citrinus和含羞带，“美国应用科学杂志，第7卷，第5期1，页13-16,2010。查看在：出版商的网站|谷歌学者
19. J. N. Eloff，“应该使用哪种萃取剂从植物中筛选和分离抗菌成分?”民族药物学杂志，第60卷，第2期1，第1 - 8页，1998。查看在：出版商的网站|谷歌学者
20. N. S. Elleboudy，W.F.Elkhatib，M. Aboulwafa和N.A.Hassouna，“来自一些人的磷脂酶C的生产和表征Bacillus thuringiensis.从埃及土壤中恢复的分离物，“健康产业生物技术国际期刊，第5卷，第5期。1, pp. 10-24, 2016。查看在：谷歌学者
21. K.Bernardo，N.Pakulat，S.Fleer等，“Linezolid减少的水下浓度金黄色葡萄球菌毒力因子表达，“抗菌药物和化疗，第48卷，第48期2，页546-555,2004。查看在：出版商的网站|谷歌学者
22. L. Quéré， T. Wenger和H. J. Schramm，“三萜作为HIV-1蛋白酶二聚抑制剂”，生物化学与生物物理研究通讯，卷。227，没有。2，pp。484-488，1996。查看在：出版商的网站|谷歌学者
23. B. Jing, M. Liu, L. Yang et al.，“nature - occurring five -环三萜类作为去泛素化蛋白酶USP7的新型抑制剂的特性与抗癌活性体外，“Pharmacologica学报第39卷第3期3，第492-498页，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学者
24. J.-Y.Kouli，S.-c。公园，I. Hwang等，“来自植物的蛋白酶抑制剂，具有抗菌活性，”国际分子科学杂志，第10卷，第5期。6, pp. 2860-2872, 2009。查看在：出版商的网站|谷歌学者
25. A. Borges，S.S.S.Cristina Abreu，M.J.Aavedra，A. Salgado和M.Simões，“选择植物化学物质对挥霍细胞毒素的影响，”生物淤积，第30卷，第2期2，pp。183-195,2014。查看在：出版商的网站|谷歌学者
26. C. Koszczol, K. Bernardo, M. Krönke，和O. Krut，“亚抑制奎奴普丁/达尔福普丁可减弱毒性金黄色葡萄球菌，“抗菌化疗杂志，卷。58，不。3，pp。564-574，2006。查看在：出版商的网站|谷歌学者
27. B. LaSarre和M. J. Federle，“利用群体感应来混淆细菌病原体”，微生物学与分子生物学评论第77期1, pp. 73-111, 2013。查看在：出版商的网站|谷歌学者

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