交互的伞菌酸腺嘌呤核苷酸移位酶诱导线粒体氧化应激

文摘

线粒体通透性转换的特征是transmembranal毛孔的打开开关膜透性的特定于非特异性。这个结构允许自由离子的流量,代谢物,在线粒体内膜和水。的渗透率过渡孔是由氧化应激以及钙超载。在这项工作中,我们探讨了如果氧化应激是一个结果,而不是一个效应的毛孔打开,通过评估的交互与腺嘌呤核苷酸移位酶,伞菌酸的结构组件孔隙渗透率过渡。我们发现伞菌酸诱导过渡毛孔开放,增加了代oxygen-derived活性物种,增加不饱和脂肪酸的氧化膜,并促进内膜细胞色素c的超然。伞菌酸的影响被抗氧化剂抑制它莫西芬的协会与降低绑定硫醇试剂eosin-3马来酰亚胺腺嘌呤核苷酸移位酶。我们得出结论,伞菌酸促进开放的毛孔,增加活性氧产量,对关键的硫醇的氧化修饰腺嘌呤核苷酸移位酶。

1。介绍

必不可少的线粒体功能是为细胞提供能量需求的代谢过程。为了实现这一点,需要选择性渗透膜,以保证建立一个质子梯度穿过内膜。非选择性渗透过程,广泛被称为线粒体通透性转换(mPT),破坏的质子梯度氧化磷酸化(1]。非特异性的孔隙直径3海里,并允许自由离子的流量,代谢物,甚至DNA片段(2]。这种非特异性的分子性质孔隙一直是有争议的问题在过去的30年,仍在争论。早期的实验指出,腺嘌呤核苷酸移位酶(蚂蚁)3,4)或磷酸载体(5,6)为主要结构确认线粒体渗透性转换孔注射(mPTP药物)。最近,之间的间期cF的子单元₁atp合酶二聚体被指出为非特异性毛孔,并在这个新模型中,蚂蚁扮演监管角色(7]。毛孔打开,大量的诱导物,包括carboxyatractyloside [8),^{2 +}(9),thiol-blocking试剂、重金属(10- - - - - -13),氧化应激。众所周知,氧化应激是一个主要因素,注射促进mPTP药物打开在一个孤立的线粒体9,14),在完整细胞(15和在再灌注损伤16]。然而,目前还不清楚如果活性氧(ROS)生成的结果毛孔打开,或者从内部产生的ROS占其孔径。因此,这项工作的目的是探讨的可能性的非特异性孔隙可能诱导氧化应激。我们用伞菌酸(Ag) Ac)诱发孔隙的孔径,正如我们之前报道与蚂蚁的互动(17]。实验结果表明,Ag)交流造成毛孔开放,导致下降的跨膜电场梯度(ΔΨ)。的崩溃ΔΨ放大H₂O₂生产,增加了氧化脂质环境的内膜,并抑制超氧化物歧化酶的活性。ROS增加可能导致从内膜细胞色素c的超然。根据这些结果,这是挑衅的假设的非特异性毛孔促进氧化应激,因此事件似乎被氧化剂分子三苯氧胺(TAM)。

2。材料和方法

化学试剂或更高年级从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)除非另有说明。Anticytochrome c兔单克隆抗体(Ab76237)从Abcam(美国Cambridge, MA)和anti-VDAC鼠标单克隆从圣克鲁斯生物技术(sc390996)(美国CA)。增强化学发光检测系统从密理博公司(美国贝德福德,MA)和辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体来自Abcam(美国Cambridge, MA)。

的伦理委员会批准的调查研究所心内科伊格纳西奥·查韦斯(公司- 13806),和实验协议遵循的指导方针诺玛Oficial墨西哥对实验动物的使用和护理(笔名- 062动物园- 1999)和处置生物残留(笔名- 087 - semarnat ssa1 - 2002)。

2.1。线粒体蛋白质

从大鼠肾皮质线粒体被均质化的组织准备在0.25 M蔗糖1毫米EDTA, 10毫米三与三调整pH值7.3,标准后离心分离过程。蛋白质含量测定方法后Lowry et al。18]。

2.2。Ca^{2 +}保留能力,线粒体肿胀,跨膜梯度测量

实验是由孵化2毫克的线粒体蛋白质3毫升的基础培养基含有125毫米氯化钾,10毫米琥珀酸,磷酸3毫米,消息灵通的10毫米,5μg鱼藤酮,2μg寡霉素。中调整pH值7.3。Ca的运动^{2 +}是化验spectrophotometrically在675 - 685海里使用Arsenazo三世metallochromic指标。线粒体肿胀之后在540海里。跨膜电场梯度(ΔΨ)决心使用染料碱性藏红。

2.3。超氧化物歧化酶(SOD)的活性

酶的活性在线粒体超氧化物歧化酶进行了分析nondenaturating丙烯酰胺凝胶电泳所描述的Perez-Torres et al。19]。简单地说,它使用100微克nondenaturing线粒体蛋白质的凝胶电泳和硝基蓝四唑(电视台)。电泳是在100 v 5 h。最后,这种凝胶在2.45毫米电视台孵化30分钟,液体被丢弃,这种凝胶中孵化28毫米tem的解决方案包含36毫米磷酸钾(pH值7.8)和0028毫米核黄素在黑暗中10分钟。蓝色的电视台污点是由暴露于紫外线光10分钟。标准曲线得到连续稀释(2.5、5、10、15、30、60 ng)从牛红细胞SOD。

2.4。脂质过氧化和H₂O₂内容

线粒体膜的脂质过氧化作用进行了使用tetraethoxypropane与硫代巴比土酸活性物质作为标准(如前所述)(13]。H₂O₂内容是评估的过程Dikalov et al。20.),通过孵化2毫克的线粒体蛋白质3毫升的基础培养基和10μ摩尔L⁻¹10 acetyl-3 2-dihydrophenoxazine + 0.2 U /毫升辣根过氧化物酶在一个黑暗的房间在37°C 60分钟。产品,resorufin,确定了基于荧光在530 - 590海里的增加。

2.5。线粒体DNA和细胞色素C含量

线粒体DNA得到报道之前(2];它的破坏是解决在0.8%琼脂糖凝胶在紫外光照射下与溴化乙锭可视化。

2.6。线粒体细胞色素C的内容

分析了细胞色素C的内容加载50μg蛋白的线粒体上15% sds - page凝胶和转移为immunodetection PVDF膜。主要单克隆抗体对细胞色素C和次要HRP-conjugated抗体被用来评估膜的蛋白质含量。压敏电阻器阴离子通道的内容(VDAC)被用来加载控制。

2.7。腺嘌呤核苷酸移位酶检测

腺嘌呤核苷酸移位酶被贴上之前报道Majima et al。21];1毫克的线粒体蛋白质是悬浮在1毫升的一个基本的媒介和preincubated 3μ伞菌酸和20μ米他莫昔芬5分钟;随后,20 nmol / mg曙红马来酰亚胺(EMA)添加和孵化在4°C在黑暗中5分钟。反应是停止通过添加30 mM德勤(二硫苏糖醇)。然后,300年µ克的线粒体蛋白质进行sds - page在10% nonreducing条件下聚丙烯酰胺。荧光检测紫外线灯。

3所示。结果

图1(一))显示了三苯氧胺的抑制作用线粒体钙的排出^{2 +}Ag)诱导的Ac。钙积累到线粒体琥珀酸氧化,达到一个稳定状态,直到增加3μM Ag Ac发起快速释放的阳离子(我)。这是完全废除了环孢菌素(CSA) (II),表明孔隙渗透率的中介过渡。(3),结果表明,20μ的抗氧化三苯氧胺(TAM)也抑制矩阵Ca^{2 +}引起的射流Ag Ac。

建立跨膜的电梯度是一个重要的先决条件来维持氧化磷酸化。在图1 (b)结果表明,Ca^{2 +}运用时间去极化时纠正的吸收和释放率达到平衡。增加3μM Ag)交流对膜电位的下降快;然而,这个特性渗透过渡中补充了TAM时就被淘汰了。它也表明解偶联剂羰基氰化物法(CCCP)消散的跨膜电梯度和Ca^{2 +}需要促进ΔΨ崩溃引起的Ag Ac(右面板)。

线粒体肿胀也描述渗透率过渡毛孔打开。实验结果显示在图1 (c))表明,Ag)交流感应快速和广泛肿胀,抑制后添加TAM。

接下来,我们探索的可能性Ag Ac诱发氧化应激通过测量产生过氧化氢。Ag)交流增加了生产的H₂O₂(图2(一个)),这样的崛起似乎抑制后的TAM。

线粒体损伤造成增加H₂O₂水平通常会通过改善活动的第一行的线粒体的抗氧化系统,即。酶、超氧化物歧化酶(SOD)。观察图2 (b)),Ag Ac抑制50%,SOD活性等抑制部分逆转Tam-treated线粒体。

造成氧化应激增加,增强过氧化氢含量和SOD活性下降,促进脂质损伤,线粒体DNA和蛋白质。膜多不饱和脂肪酸的氧化是评估测量水平的硫代巴比土酸活性物质(TBARS),这是产生脂质过氧化反应的副产品。观察,Tam减少引起的氧化膜脂肪酸Ag Ac(图2 (c))。氧化应激也引发损伤的线粒体DNA (mtDNA)。图3表明Ag Ac诱发破裂的遗传物质。说明,mtDNA退化被抗氧化剂TAM阻止。

众所周知,线粒体渗透性转换可能导致细胞凋亡从线粒体释放细胞色素c [22,23]。在这种情况下,我们发现Ag)从内部交流促进了这种蛋白质的分离膜。从图可以看出4,在Ag Ac-treated线粒体细胞色素c含量减少了40%,这减量被TAM部分废除。

来确定Ag-Ac引起的氧化应激影响蚂蚁,我们与荧光探针标记线粒体eosin-5-maleimide (EMA)。根据Majima et al。21),这种化合物结合Cys159腺嘌呤核苷酸移位酶,有30 kDA的分子量。这是显示在图5,Ag)交流减少线粒体蛋白质的荧光标签EMA,特别是蛋白质的权重30 kDa(4 - 6行)相比,控制线粒体(1 - 3行)。它莫西芬的恢复了荧光标记(7 - 9行),说明要么它莫西芬阻止绑定Cys159轨迹附近的Ag)交流或通过减少活性氧的生产,它在阻止关键硫醇的氧化修饰腺嘌呤核苷酸移位酶。

4所示。讨论

膜孔隙渗透率是一个重要的生物现象发挥重要作用在正常生物过程(24),它的失调是一个至关重要的步骤在各种不同疾病的发病机制,包括缺血再灌注损伤(25),肝损伤(26),许多慢性和急性疾病的中枢神经系统27第六,胶原蛋白肌肉疾病(28]。

报告指出ANT作为特异性的孔隙的结构组件(3,4]。最近,它已被提出c注射亚基的F1-ATP合酶是主要的mPTP药物成分,蚂蚁扮演监管角色在其开放闭合状态7]。毛孔打开触发在不同的实验设置,即。,通过添加硫醇阻塞试剂(10)和重金属(11- - - - - -13,29日)或通过抑制线粒体呼吸链(30.,31日),以及physiopathological条件如缺血/再灌注损伤(16]。注射氧化应激和mPTP药物打开“标志”的发达在再灌注损伤9,32,33]。抗氧化剂防止注射的孔径mPTP药物,接受,突然一代的ROS在特异性的孔隙的孔径。这样的观点相反,最近的报告称,非特异性的孔隙是氧化应激的原因34]。在这项工作中,我们添加了这种可能性的证据通过Ag Ac诱导特异性的孔隙的孔径和Tam,具有抗氧化特性的生化分子(35]。ROS生成后发生的Ag Ac, SOD活性下降,膜不饱和脂肪酸的氧化,从线粒体细胞色素c的释放。所有这些事件都是由氧化剂TAM抑制。

有报告显示,细胞色素c的释放之前或之后PT毛孔打开取决于刺激(36]。在第一个场景中,细胞色素c的释放后会增加活性氧生成复杂三世抑制(9)促进PT毛孔开放,反过来可能导致更多的细胞色素c的释放和活性氧水平的进一步提高self-amplifying循环(37]。另一个可能的机制,氧化应激可能产生特异性的毛孔是开放后的跨膜电场梯度之间的密切关系和ROS的生成38]。这个假设我们的实验指出,伞菌酸诱导一滴ΔΨ,以及一代的H₂O₂。

注射有关蚂蚁的作用mPTP药物,我们之前报道,Ag)交流可能与腺嘌呤核苷酸移位酶(17]而且Tam carboxyatractyloside[诱导的抑制渗透过渡39]。从这个意义上说,一个额外的结果值得特别关注的是Tam阻止Ag Ac-induced减少EMA绑定到蚂蚁可能占抗氧化的保护作用。众所周知,Cys159 EMA的目标站点是腺嘌呤核苷酸移位酶(21]。

5。结论

我们建议Ag)交流可能与蚂蚁通过阳离子环境循环由Lys145, Arg151, Lys162 Lys165, Arg170。这种交互可能增强通过Ag)的烷基链的交互交流与内在膜的疏水环境。假设这种交互引发毛孔打开由以前的出版物(持续17),以及图的结果1在这工作。因此,Tam减少氧化应激,通过预防Ag Ac Cys159轨迹附近的绑定或作为一种抗氧化剂,防止关键硫醇的氧化修饰腺嘌呤核苷酸移位酶。

数据可用性

数据用于支持本研究的结果给出了手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢塞西莉亚Zazueta博士对她这个手稿的评论。

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