生化成分的Phaleria macrocarpa(叶)Methanolic SH-SY5Y细胞提取物抑制活性氧的生产模式

文摘

背景。在哺乳动物细胞活性氧生成深刻影响若干关键的细胞功能和缺乏有效的细胞解毒机制移除这些激进分子可能导致一些人类疾病。几项研究表明,活性氧被归咎于毁灭性的特工在神经系统尤其是推进的背景下年龄导致神经退化。目前的治疗这种疾病并不是有效的,导致一些副作用。因此,寻找替代药物在高需求。因此,本研究的目的是评估的活性氧的抑制作用Phaleria macrocarpa(叶)提取80%。方法。叶子与80%甲醇提取。细胞毒性进行了研究使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)和ROS抑制活动进行评估使用二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)测定在SH-SY5Y细胞模型。结果。结果显示ROS抑制活性的粗提物具有显著差异 粗提取液处理的组之间,粗提取液治疗组和暴露在H₂O₂,该组织暴露于H₂O₂只有以及保持完整的媒体集团。生物活性化合物显示牡荆素的存在和isovitexin后高效液相色谱方法。结论。高抗氧化活动和低毒性效应的原油透露其高效益作为天然药物/补充。

1。背景

推进领域的科学研究尤其是哺乳动物基因组为研究打开了新的途径营养和基因组之间的相互作用(1]。最近,它已经发现其中常见的机制,增强细胞的耐久性、健康老龄化表明防止氧化应激(2]。然而,神经细胞损伤最常见的原因是过度增加活性氧(ROS)以及减少在正常水平的内源性抗氧化酶(3]。因此,自然外源性抗氧化剂的使用从植物已被建议作为一个独特的方法来防止ROS前神经细胞损伤(4]。

Phaleria macrocarpa也称为mahkota dewa或上帝的皇冠是一个印尼土著植物,但在巴布亚Isl的热带地区。工厂已经使用传统管理等异常肿瘤,糖尿病、炎症疾病,和腹泻相关疾病如心血管疾病、氧化应激疾病,病毒感染,细菌感染、真菌感染5,6]。这种植物的不同部分的植物化学的研究揭示了存在高浓度的几种生物活性成分。这些包括mahkoside,月桂酸、棕榈酸、des-acetyl flavicordin-A, flavicordin-A, flavicordin-D flavicordin-葡萄糖苷、硬脂酸乙酯和木酚素蔗糖(5]。Mahkoside (4, 4′dihydroxy-2-methoxybenzophenone-6-O -β-D-glucopyranoside)最初从这种植物叶子连同芒果苷分离(C-glucosylxantone) kaempferol-3-o -β-D-glucoside、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸乙酯和蔗糖(7]。然而,抗氧化电位的测定研究还揭示了皂苷,生物碱、多酚、酚类、类黄酮,和木质素单宁含量高的叶和茎皮(8,9]。大量icariside C3、芒果苷和phalerin没食子酸已经被识别和孤立从水果中提取的植物10,11]。种子提取物,各种成分如柚皮苷,槲皮素,佛波醇酯、des-acetyl flavicordin-A,和29-norcucurbitacin已确定并孤立(5,12]。尽管所有这些药用价值,p . macrocarpa据报道,是有毒的。口腔溃疡、embryo-fetotoxicity和轻微造成的近曲小管坏死浅绿色的叶子中提取的植物有记载13]。轻度肝肥大和增加血清谷氨酸丙酮酸氨基转移酶在guails也被报道(9,14,15]。

人类神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞是人体细胞和被广泛使用在体外模型在神经科学研究16]。7天治疗后的细胞可以分化和视黄酸能够被表达在文化分化之前(17]。然而,一些科学家们最近报告的使用其他化学物质如herbimycin(草),醋酸12-O-tetradeconoyl-phorbol-13 (TPA) dibutyryl环腺苷酸(db AMP),或神经营养因子提高分化的神经细胞在另一个维持其生存能力(18]。因此,本研究的目的是评估的ROS的抑制作用Phaleria macrocarpa(叶)SH-SY5Y 80%甲醇提取细胞模型。

2。材料和方法

2.1。植物的收集和识别

Phaleria macrocarpa收集从花园Pertanian大学(TPU)马来西亚Putra大学,雪兰莪州,马来西亚。植物叶子的身份验证是一个植物学家研究所的生物科学(IBS),芬欧蓝和凭证号码分配。

2.2。植物提取

Phaleria macrocarpa(叶)清洗、分离和切成小块的援助砧修剪工具(英国)。植物叶子上干了两周在室温下(26±1°C)在生物技术2公司芬欧汇川集团实验室然后碎semipowder(40 -网)的形式。总共有200 g的叶样品浸泡3天在1000毫升80%的甲醇平底烧瓶(西格玛奥德里奇,美国)。混合物动摇了每日三天,保持在26°C到获得高粗提取液;这个过程重复了三次。当时获得的提取与绘画纸滤纸过滤(1.5西格玛奥德里奇,美国)和半固体形式集中在旋转蒸发器(IKA 42°C^®美国房车10)。结果半固体粗提物获得重,转移到样品瓶,并存储在4°C,直到需要。

百分比收益率计算,滤液的重量除以总磨粉的重量百分比。

2.3。植物样品稀释和剂量准备

股票的解决方案是由溶解100毫克粗提物为1毫升100% DMSO(100毫克/毫升)。使用DMSO溶液是溶解的粗提取液,由于提取是绝对不会溶于水溶剂。准备substocks微升的解决方案(µg / mL)是由感兴趣的浓度稀释股票解决方案使用双重的连续八点用蒸馏水稀释浓度(7.81 -1000µ在96 g / mL)微型板块(西格玛奥德里奇,美国)。DMSO(车辆)维持在0.1%浓度的提取。

2.4。细胞生存能力分析

粗提取液的细胞毒性测试执行SH-SY5Ycells使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)试剂(Sigma-Aldrich),美国。最初,这些细胞被播种在96 -孔板的密度1×10⁵细胞/在150µL最低基本完整的媒体(MEM)和保持湿润,5%的公司₂在37°C,孵化器24小时。种子细胞一直观察,直到孵化后24小时。然后细胞暴露于不同浓度的准备粗提取液(7.81 -1000µg / mL)溶解在不完整的MEM和reincubated另72小时湿润,5%的公司₂孵化器在37°C下频繁的观察。控制好本实验中使用包括空格只包含媒体以及媒体与0.1% DMSO溶液。MTT原液的制备是由溶解5毫克MTT试剂in1毫升的磷酸缓冲盐(PBS)。稀释股票的解决方案与PBS的比率1:10给出了一个工作的解决方案µ(10 l . MTT工作的解决方案µL)转移到种子细胞暴露在微型板块和保持4小时湿润,5%的公司₂,37°C的孵化器。二甲亚砜(DMSO)使用,取代了使用媒体包含粗提取液和细胞,这是进一步在层流罩reincubated 30分钟。吸光度是在570 nm使用标仪(美国光谱max +)溶解后紫甲瓒晶体。同样的步骤重复了细胞毒性效应评估的H₂O₂SH-SY5Y细胞获得安全剂量浓度用于ROS保护粗提物的测定。

2.5。测定植物提取物的保护性的氧化压力测试SH-SY5Y细胞

播种SH-SY5Y细胞分化后治疗10µM视黄酸进行了6天在实验室和reincubated 24小时5%股份有限公司₂,37°C的孵化器。细胞被不同浓度处理的粗提取液(7.81 -1000)µ无血清培养系统g / mL溶解在另一个24小时。150毫米H₂O₂被转移到微型板块包含种子细胞和reincubated 24小时。使用媒体包含H₂O₂粗提物和死亡细胞被丢弃;细胞用磷酸盐水洗净(PBS)在黑暗。7 - 2′′二氯荧光素二乙酸(DCF-DA) (30µ米)在PBS被添加到每个reincubated 30分钟。测量intracellsular活性氧(ROS)生产使用标(实验室商人有限,英国)在485 nm和535 nm)发射的荧光激发。浓度测定细胞内ROS的间接测量的百分比增加荧光每口井2′7′二氯荧光素二乙酸(DCF),由氧化2′7′二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)内ROS分泌细胞。每口井的比例增加,荧光是使用以下公式计算: 在英国《金融时报》₀最初的阅读和英国《金融时报》吗_30.是阅读30分钟后的孵化。

2.6。识别的生物活性化合物

植物生物活性化合物牡荆素和isovitexin被用作标准在这个实验中。这两个标准是准备在70年4.4的浓度µ6.1克/毫升和97µ克/毫升。识别牡荆素isovitexin,粗提物制备在1毫克/毫升的浓度。植物化学的成分被发现使用高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱分析和质分光光度法(LC / MS)。

2.6.1。高效液相色谱法

高效液相色谱系统(水域,美国)组成的600泵,一个自我注射器,2998光电二极管阵列检测器200到500纳米,成立并用于确定生物活性化合物(牡荆素和isovitexin)原油中提取。分离进行了使用250×3.3毫米4.6毫米ODS柱(Inertsil、日本)恒温器在40°C。与甲醇梯度法用于分离和去离子水。0分钟,流动相被设定在10%甲醇在去离子水和增加到90%甲醇在去离子水45分钟的时间。去离子水是90%的甲醇进一步维持15分钟。山峰被集成的波长337 nm。

2.7。统计分析

抗氧化细胞毒性和过氧化氢清除活动结果描述为均值±SD (n= 3)。统计分析进行了使用单向方差分析(方差分析)其次是图基的多重比较检验用图棱镜(5.0)统计软件来确定观察的统计差异。所有统计评估结果使用学生的渗透进行研究t以及,值< 0.05被认为是结束显著差异(n= 3)。

3所示。结果

3.1。原油产量比例提取的结果

后提取的植物提取物80%甲醇和接地与旋转蒸发器蒸发半固体形式在42°C,获得的收益比例是16.845% w / w。

3.2。毒性试验

3.2.1之上。毒性试验的Phaleria macrocarpa(叶)提取SH-SY5Y细胞

粗提物的毒性试验的结果SH-SY5Y细胞显示高细胞浓度超过125死亡µ克/毫升。在250µg / mL, 48.53%的细胞生存,生存在500年的34.61%µ生存在1000 g / mL,和17.61%µ克/毫升。有显著差异 对照组和集团之间的接触到1000到15.6µ克/毫升。没有统计区别对照组和暴露于7.8µ克/毫升。比例的细胞生存能力(平均数±标准差)(n= 3)和致死量(LC₅₀155±0.10)µ克/毫升计算(图1)。

3.2.2。过氧化氢在SH-SY5Y细胞毒性效应

H的毒性试验的结果₂O₂SH-SY5Y细胞显示高细胞死亡在浓度超过150毫米。在300毫米,47.11%的细胞存活只有19.97%存活600毫米。有显著差异 对照组和集团之间暴露于37.5到600 mM。对照组没有统计学差异和组织暴露于18.8毫米。比例的细胞生存能力(意思是±SE) (n= 3)和安全剂量的150毫米计算(图2)。

3.2.3。氧化应激试验的Phaleria macrocarpa(叶)提取

ROS的粗提取液的抑制作用对SH-SY5Y细胞显示非常低的ROS在暴露在H组抑制₂O₂(150毫米)。在这项研究中,ROS抑制测量吸光度下降在485 nm和535 nm)使用标排放。增加抑制ROS的记录在-250年62.5µ克/毫升。在浓度低于62.5µg / mL, ROS压抑严重减少的吸光度的增加。浓度超过250µg / mL,活性氧产量低,吸光度也降低了由于低细胞的异常。有显著差异 对照组和集团之间接触的粗提取液(7.9 -1000µg / mL)其次是暴露在H₂O₂(150毫米)。百分比显示细胞的生存能力(平均数±标准差)(n=(图3)3)。

3.2.4。高效液相色谱法

生物活性化合物的Phaleria macrocarpa(叶)确定采用高效液相色谱法和牡荆素isovitexin作为标准(数据4和5)。两个峰值区域中确定该粗提物与牡荆素(保留时间21.834)和isovitexin(保留时间23.002)(图6)。

4所示。讨论

甲醇、乙醇和丙酮乙酸乙酯是常用的在植物生物活性化合物的提取19,20.]。文献显示,高收益的酚类化合物在丙酮溶剂相比,甲醇溶剂在实验提取的水果蔬菜(21]。高收益的酚类化合物甲醇叶提取物相比,丙酮和热水氯仿提取物也被记录(22]。这可能是由于高浓度的极性或非极性化合物的变化导致溶剂的亲和力增加一个另一个酚类化合物存在于植物部分。乙醇和乙醇/水解决方案也报道作为一种酚类化合物的提取的最佳溶剂在山葵根提取的研究(23]。因此,考虑到高潜力的极性溶剂提取大量的酚类化合物,它是利用传统的中医医生准备的汤或输液,和80%甲醇作为提取解决。百分比收益率获得的结果与80%甲醇提取叶200克样品后16.845% w / w。这个结果是同意这一发现报道(13)显示高收益的11.99%提取后w / wPhaleria macrocarpa叶有80%甲醇。

粗提物对SH-SY5Y细胞的影响遵循一个浓度梯度,有增加毒性效应与粗提取液浓度的增加。有显著差异 和f= 68.334和对照组之间的团体受到15.6 -1000µ克/毫升粗提取液。这是由于减少细胞的异常与粗提取液浓度的增加。这一发现是类似于一个记录的24增加],它揭示了有丝分裂细胞诱导浓度较低的强度龙葵提取。减少在同一细胞有丝分裂活动观察后提取浓度增加。的一些主要因素,导致细胞死亡可能归因于有毒植物化学的成分。透露,如果存在高浓度cytokinin-like物质粗提物可诱导细胞毒性效应细胞随后细胞死亡(25,26]。先前的研究还表明,存在生物活性化合物等β谷甾醇、豆甾醇和taraxeryl醋酸环丙烷扶桑如果用于细胞导致减少细胞的异常27]。细胞生存能力上有显著差异 ,f= 133.975和对照组之间的团体受到37.5 -600毫米的H₂O₂。这是由于增加的细胞溶解的影响₂O₂浓度对SH-SY5Y细胞。很明显从这个实验表明,组织暴露于150毫米以上表现出低的异常由于毒性增加的代理,导致细胞死亡见MTT试验。这个发现在这个研究显示那些没有找到对应的报告显示250毫米的公园等人的安全剂量H₂O₂诱导活性氧的SH-SY5Y细胞(28]。结果的变化可能是由于浓度的化学研究期间使用。在这项研究中30%的H₂O₂虽然没有使用特定浓度的H₂O₂表示在公园等的实验研究。

活性氧的结果抑制粗提物对H₂O₂全身的ROS生成显示了高的显著差异 ,f= 271.923组中被暴露于H₂O₂,组织处理粗提取液,和该组织粗提物处理挑战与H紧随其后₂O₂。没有足够的活性氧保护作用的文献Phaleria macrocarpa由H₂O₂SH-SY5Y细胞模型。据报道,多吃蔬菜水果有保护作用对所有疾病引起的活性氧由于抗氧化生物活性化合物的存在29日]。存在生物活性化合物的提取具有抗氧化效果可能负责荧光吸光度下降。细胞内抗氧化剂代理行为中和H₂O₂通过将它转换为水减少氧自由基氧化DCFH形成荧光团(30.]。

生物活性化合物的(牡荆素和isovitexin) identifedin原油中提取使用高效液相色谱法对isovitexin牡荆素保留时间为21.834和23.002。药物的影响Phaleria macrocarcarp(叶)可能是由于牡荆素或isovitexin先前已报告。很少有许多相关研究在体外抗炎活性(31日,抗氧化活性6],抗癌活性[32[],vasorelaxant活动7),和抗菌活性33]。这种粗提取液的治疗潜力增加可能是由于许多化合物除了牡荆素和isovitexin活动。这些包括以下生物组件:皂苷、生物碱、多酚、酚类、类黄酮、木脂素类单宁(6,8]。尽管牡荆素,isovitexin可能出席分钟在这粗提取液浓度,大量的次生代谢物可能负责其高抗氧化药物的效果。

5。结论和建议

得出牡荆素,isovitexin粗提物的存在导致了ROS在SH-SY5Y细胞保护作用。这个合理的潜力的植物提取物作为化疗药物。毒性筛查的粗提取液对哺乳动物比如老鼠和老鼠重申他们的毒性资料推荐。抗氧化生物活性化合物的筛选以及隔离牡荆素和isovitexin强烈建议。

数据可用性

数据权限从Syahida艾哈迈德博士和马来西亚Putra大学。

伦理批准

伦理批准机构伦理委员会提供的是马来西亚Putra大学和提交的补充文件。

信息披露

这项研究是一个研究生博士论文的一部分,可以与上司的许可和大学管理。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突的研究,本文的作者,或出版物。

作者的贡献

哈桑麦纳易卜拉欣博士进行了研究和写论文和手稿。Wan Norhamidah Wan易卜拉欣博士是cosupervisor,参与设计的建议,并监控项目和数据分析。Ferdaus宾蒂博士Mohamat Yusuf cosupervisor,参与设计的建议,并监控项目。西蒂博士Aqlima Ahmad cosupervisor,参与设计的建议,并监控项目。Syahida艾哈迈德博士是一个重大cosupervisor,参与设计的建议,监控项目的结论,资助研究。

确认

作者要感谢学院生物技术生物分子科学,马来西亚Putra大学(芬欧蓝),提供实验室研究设施。这个项目是由教育部高等教育(邻蒙古),马来西亚,根据基础研究资助计划(FRGS-trans) (Ref。TD-FRGS / 2/2013 /芬欧蓝/ 02/1/2)。

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