文摘

这项工作报告内切葡聚糖酶和beta-glucosidase由嗜热真菌生产Myceliophthora heterothallica在固态(SSC)和淹没(SmC)种植。麦麸和甘蔗蔗渣为SmC用于SSC和纸板。SSC发生后192小时内切葡聚糖酶生产最高:1170。6±0.8 U / g,在SmC后168小时:2642±561 U / g。培养系统生产的内切葡聚糖酶和beta-glucosidases显示有关他们的最佳pH值和温度存在着细微的差别。内切葡聚糖酶的数量也是不同的:六个亚型在SmC SSC和十个。内切葡聚糖酶活性仍高于50%,pH值3.0和9.0之间孵化24小时的培养系统。一些化学物质的影响显示差异SSC和SmC同功酶。锰激活的酶SmC但抑制SSC。为β-glucosidases、最大生产SmC是244±168小时后48 U / g使用纸板作为碳源。SSC最大产量达到10.9±0.3 U / g 240 h后1:1麦麸和甘蔗蔗渣。锰对SSC施加显著激活β-glucosidases,和葡萄糖抑制酶培养系统。FeCl₃发挥最强的内切葡聚糖酶和抑制β-glucosidases。

悼念的凡妮莎德桂皮特谢拉达席尔瓦

1。介绍

纤维素是植物细胞壁中含量最丰富的多糖和由一个线性链组成的不同数量的β-D-glucopyranose残留物,联系在一起糖苷键。纤维二糖是纤维素和的最小重复单元可以被水解成葡萄糖残基(1,2]。不同于其他的不溶性多糖和纤维素的结构自然抗生物降解能力,适合在植物(其结构作用3]。完整的纤维素水解为葡萄糖要求内切葡聚糖酶的协同作用,exoglucanases,β-glucosidases。Endo -β1,4-glucanases (EC 3.2.1.4)裂开无定形纤维素链的地区;exoglucanases或cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91)攻击nonreducing或减少链和结束β1,4-glucosidases (EC 3.2.1.21)水解纤维二糖释放葡萄糖(4]。

真菌纤维素酶生物技术应用于食品、动物饲料、酒、农业、生物质精炼,和纸浆和造纸行业5,6]。酶的生物技术的应用程序的最大挑战是他们的高生产成本。寻找方法,可以降低酶的生产成本和高增长率和微生物能够开发廉价和方便的碳源是当前方法改变这种模式7]。因此,各种纤维素基质如甘蔗蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆、小麦麸皮测试了几位作者对纤维素酶的生产8,9]。

介质的成分可以影响微生物酶表达的形象。多种纤维素酶可以获得更多的经济通过淹没或固态培养微生物。低水活性在固态培养(SSC)显示了一个简单的技术高生产力,但它会影响传热的底物,从而可能影响微生物的生长(10]。嗜热微生物的使用可以替代这个技术限制,因为他们容忍更高的温度。

本研究旨在比较内切葡聚糖酶的生产β高温-glucosidases在固态和浸没培养媒体Myceliophthora heterothallica并描述原油提取来自两个系统。

2。材料和方法

2.1。微生物

的嗜热真菌Myceliophthora heterothallicaF.2.1.4。分离从甘蔗蔗渣堆肥和维护实验室的应用生物化学和微生物学,UNESP。

2.2。剂制备

剂是由真菌生长米。heterothallicaF.2.1.4。在250毫升厄伦美厄烧瓶50毫升介质组成的1.0%的甘蔗蔗渣(地1 - 2毫米);0.14% (NH₄)₂所以₄;0.20% KH₂阿宝₄;0.03% CaCl₂;0.02% MgSO₂h·7₂O;牛肉蛋白胨0.50%;酵母提取物0.20%;0.03%尿素;0.10% (5 mg / L FeSO微量元素的解决方案₄h·7₂O;1.6 mg / L MnSO₄·H₂O;1.4 mg / L ZnSO₄h·7₂O;和2.0 mg / L CoCl₂);0.2%葡萄糖;和2.0%的琼脂,pH值5.0。所有的解决方案和培养基被高压灭菌法灭菌20分钟的121°C。这个媒介是接种暂停取消获得的菌丝体文化发展3天在150毫升的营养液45°C (g / L): 3.5 (NH)₄)₂所以₄;3.0 KH₂阿宝₄;0.5 MgSO₄h·7₂O;0.5 CaCl₂;和0.1%的80 v / v渐变,pH值5.0。

2.3。水下栽培(SmC)

内切葡聚糖酶和β葡糖苷酶生产SmC在250毫升厄伦美厄烧瓶进行使用纸板作为碳源,之前削减和地面在搅拌机里。混合物中含有1%纸板和20毫升的上述营养液是接种2毫升的描述的微生物培养液。文化被孵化的旋转瓶(100 RPM) 45°C了10天,每24 h,采集标本使用绘画纸纸1号真空过滤,离心6000 g×20分钟。上层清液作为原油酶解决方案。

为了评估使用农业的和工业的残留物,如麦麸和甘蔗蔗渣SmC的衬底,他们洗,地面,烘干的48 h (60°C)。甘蔗蔗渣渗,允许选择粒子从1到2毫米。随后,种植在250毫升厄伦美厄烧瓶进行含1% (w / w 1: 1)小麦麸皮和甘蔗蔗渣、20毫升营养液,2毫升培养液悬挂。中以前热压处理过的描述。文化被孵化的旋转瓶(100 RPM) 45°C 10天,抽样进行如上所述。

2.4。固态培养(SSC)

中使用的基板SSC由使用5克的纸板或麦麸和甘蔗蔗渣(1:1)。基板插入在聚丙烯袋(12×20厘米),在121°C 40分钟消毒。真菌接种是由添加20毫升的菌丝悬挂。约80%的水分含量达到的无菌蒸馏水。发酵是在45°C为14天。每48 h,一个包被和发酵材料与每克20毫升蒸馏水混合,搅拌30分钟,过滤、离心10000×g, 10°C。上层清液作为原油酶解决方案。

2.5。酶测定

内切葡聚糖酶活性测定60°C反应混合物组成的0.9毫升的100毫米L⁻¹醋酸钠缓冲液pH值5.0包含4%的羧甲基纤维素(CMC)(美国Sigma-Aldrich)和0.1毫升的粗酶解决方案。减少组,表示为葡萄糖,释放被化验使用DNS (3 5-dinitrosalicylic酸)方法(11]。一个单位的内切葡聚糖酶的活动被定义为酶的量能释放1μ摩尔每分钟还原糖的测定条件下(12]。

β-D-Glucosidase活动以50 mm的混合物醋酸钠缓冲,pH值5.0,500μL L 2毫米⁻¹对硝基苯-β-D-glucopyranoside (pNP-Glc)为基质,50μ酶解的L孵化60°C 10分钟。的反应是停止添加2毫升的2 M Na₂有限公司₃在410纳米和吸光度是阅读。一个单位的β葡糖苷酶被定义为的酶量版本1μ摩尔的硝基酚/分钟的反应条件。

所有的酶进行了化验一式三份。

2.6。酶谱的酶活性

内切葡聚糖酶解分析了电泳变性10%钠十二烷基硫酸盐(SDS)聚丙烯酰胺凝胶使用Tris-Glycine缓冲pH值8.3。电泳后,酶是用1% triton x - 100 30分钟,随后凝胶覆盖的1% (w / v) CMC (Sigma-Aldrich)作为底物和1% (w / v)琼脂糖和孵化为30分钟50°C。内切葡聚糖酶的检测活动,这种凝胶是沉浸在0.1% (w / v)刚果红溶液15分钟,然后用1 M L⁻¹氯化钠直到可视化的亮点对应酶(13]。

为β葡糖苷酶,这种凝胶是孵化与0.2 L⁻¹醋酸缓冲液pH值5.0十分钟在室温下温柔的风潮。之后,这种凝胶是治疗七叶灵0.1%氯化铁溶液在0.03% 0.2 L⁻¹醋酸缓冲pH值5.0,直到乐队的出现(14]。

2.7。酶的特性

pH值对酶活性的影响评估如上所述,在pH值的范围从2.0到11.0使用0.1米缓冲:pH值2 - 3:柠檬酸钠;pH值3 - 5.5:醋酸钠;pH值6.0 - -7.5:玫瑰;pH值8.0 - -9.5:甘氨酸;和pH值10.0 - -11.0:帽。温度的影响化验孵化反应混合物的温度范围从35到85°C的最佳pH值。

pH值对酶稳定性的影响,研究了通过孵化粗酶解决方案在不同的缓冲与pH值从2.5到11.0期间24小时25°C,内切葡聚糖酶的测定或紧随其后β葡糖苷酶剩余活动。热稳定性是由孵化的粗酶从40到70°C 60分钟,和剩余活动是化验如上所述。对实验数据进行比较来控制没有预孵化,表示100%。

2.8。不同化合物对内切葡聚糖酶的影响β葡糖苷酶活性

酶活性测定是在金属离子的存在和其他化合物:乙醇,葡萄糖,特里同,金属离子。金属离子(氯盐)均为分析纯,溶解在超纯水(超纯水)。提取对超纯水透析前化验。学生的结果进行了比较以及独立样本使用BioEstat 5.3 (15]。

3所示。结果与讨论

3.1。内切葡聚糖酶生产由SSC和SmC

的培养Myceliophthora heterothallicaSSC和SmC使用不同的木质纤维素的残留基质透露,胞外酶生产高度依赖的化学成分检测培养基(麦麸、甘蔗蔗渣和纸板)。当9的比例:1甘蔗蔗渣/麦麸(SSCSB) (5 g的总碳源),内切葡聚糖酶活性为303.0±1.7 U / g 144小时后,SSC和生产使用纸板(SSCP)达到182.7±1.6 U / g。改变甘蔗的甘蔗渣/麦麸的比例为1:1 (SSCWB),生产增长逾三倍到1170。6±0.8 U / g 192 h后(图1(一))。发现SSCSB同意这些值曲霉属真菌terreus(16]。另一种真菌,尖孢镰刀菌,显示一个类似的生产(17]。高收益SSCP发现的在这个工作也显示突变体青霉菌janthinellumEU2D21 [18]。

对SmC(图1 (b)),纸板或麦麸混合物与甘蔗蔗渣1:1,在浓度1% w / v(碳源总量的0.4 g),是使用。与麦麸中最低的生产了,63.5±4.1 U / g、192 h后,和使用纸板(SmCP)内切葡聚糖酶产量增加到2642±561 U / g,在168 h(图1 (c))。

麦麸是最常见的固体基质栽培,因为它富含蛋白质,碳水化合物和矿物质,促进微生物生长提供宏观和微量元素(19,20.]。甘蔗蔗渣由纤维素(44%)、半纤维素(25 - 27%),木质素(20 - 22%),灰,和矿物质21]。添加麦麸甘蔗蔗渣可以供应增长和SSC酶生产的营养条件。另一方面,纸板是衬底与纤维素的比例最高,63±1.6%,半纤维素14%,不到5%的木质素(22]。这种低木质素含量使得纤维素微生物更容易,可以提高纤维素酶诱导的解放。

酶的分析zymography显示不同的概要文件根据系统内切葡聚糖酶和碳源培养(图中使用3(一个))。比率(1:1)甘蔗的甘蔗渣和麦麸SSC和SmC观察六个同功酶的分子质量跟随大约在116年,66年,30 kDa。中间范围同功酶已经褪色的乐队。这个概要文件被修改时使用纸板作为碳源;前面提到相同的六个同功酶也表达SSC,但是66 kDa乐队呈现出更高的活动和其他四个亚型与中介分子量明显出现在水下种植,这表明更高的可访问性纤维素从SmC可能影响纸板的生产更多的同功酶促进消化。SSC的概要文件使用纸板没有显示定义概要文件也表明中间分子量亚型的表达。

3.2。β葡糖苷酶生产由SSC和SmC

酶生产的峰值SSC后获得192小时的培养。当9:1的比例甘蔗蔗渣(SSCSB)(总共5克碳源),β葡糖苷酶活性为10.9±0.3 U / g 240 h后,用1代替甘蔗蔗渣的比例:1 (SSCWB),生产增加到67.3±0.8 U / g 288 h后(图2(一个))。当使用纸板在SSC,生产下降到3.62±0.01 U / g。真菌Fomitopsis产生53.68 U / g sp。RCK2010只使用麦麸,和Thermoascus aurantiacus生产48 U / g相同的底物(8,23]。另一方面,使用SmC(图2 (b)),只有两种类型的基质比较(碳源总量的1%,0.4克):纸板和麦麸甘蔗蔗渣(1:1)(SmCWB)。在这些实验条件下,最低的生产129±11 U / g获得了192小时后,但使用纸板(SmCP)生产几乎翻了一番,至244±48 U / g, 168小时的培养(图2 (c))。

的酶谱beta-glucosidases(图3 (b))显示不同的表达水平根据培养系统和所使用的碳源。在所有培养系统只有两个同功酶大约146和66 kDa。明显的使用比率(1:1)同工酶低分子量增加了表达式。

3.3。比较的结果由培养系统

虽然淹没栽培(SmC)更高的生产力得到的值用U / g固态栽培相比,必须考虑两个方面:首先,在这个过程中获得的液体的体积。在SmC,酶稀释100倍,而在SSC稀释20倍。因为这个项目的目的是生产酶用于原油形式,解决方案的初始浓度很重要,因为它可以避免集中一步酶,降低过程成本和显示频繁的下降产生的酶由于非特异性吸附膜和集中器,例如,一个SSC的优势。

另一方面,以前我们组(未发表)的数据显示之间没有线性的增加底物浓度(C源)和酶生产从1到2.5%,这一事实也被Kumar et al。24)处理黑曲霉,事实上验证降低纤维素酶和果胶酶生产超过一定浓度的碳源。

此外,培养系统也会影响酶生产SSC以来没有水在固体基质的颗粒已被报告为一个重要因素,影响细胞外酶的分泌(25]。SSC的内切葡聚糖酶生产最好的收益成本比,因为它允许使用农业的和工业的残留物,类似于环境条件发现的真菌,具有较高的生产率,并要求生产小面积(10]。

3.4。粗酶的特性

3.4.1。内切葡聚糖酶

最高的生化特性进行了SSC和SmC,即分别SSCWB和SmCP。pH值的内切葡聚糖酶活性的影响进行了研究使用CMC(4%)作为底物,和两个系统产生的内切葡聚糖酶显示最大活动(图5.5 pH值4(一))。

报道的最佳pH值被发现的粗提取液pH值的范围从3.5到6.0,独立的种植系统[26,27]。原油内切葡聚糖酶解获得Pycnoporus sanguineus在SmC显示最佳pH值在3.5 - -4.0 (27]。同样的,(28,29日)获得的最大活动pH值4.0的内切葡聚糖酶木霉属atroviride676年和青霉菌sp。cr - 316,分别培养在SmC,当别人发现更高的范围,pH值从4.5到6.0,内切葡聚糖酶的真菌枝顶孢属sp. SSC[生产的26),和那些来自米。thermophilaM.7.7展出的最佳pH值5.0 [30.]。产生的内切葡聚糖酶一个。尼日尔在pH值4.0 [SSC表现出更高的活动31日,32]。

pH值对稳定性的影响(图4 (b))分析了pH值范围从2.5到11孵化24小时后在室温(25°C)。内切葡聚糖酶由SSC和SmC的活动高pH值3.5 - -4.0以上,pH值9.0。剩余活动急剧下降在酸或碱性pH值。

温度的影响(图内切葡聚糖酶的活动5(一个))分析了pH值5.5提取获得的培养系统。概要文件是不均匀的,这表明温度最适条件的亚型有不同的价值观。酶的SSC,最大活动达到60°C,下降40%至80°C。另一方面,SmC获得的酶的最适温度为65°C,发现相同的值为内切葡聚糖酶的SSC获得一个。尼日尔(32]。内切葡聚糖酶的一个。尼日尔通过SSC的最适温度60°C (31日),获得的SSC米。thermophila在70°C (M.7.7表现出最大的活动30.]。

另一方面,分析酶通过SmC,这些的P。sanguineus显示的最适温度60°C (27)和值60到70°C的内切葡聚糖酶T。atroviride676年(28)和类似的价值观被报道的酶的真菌青霉菌sp。cr - 31629日]。

内切葡聚糖酶的热稳定性(图5 (b)),孵化后剩余活动测量提取在不同的温度下,40至70°C, 1小时。SmC显示产生的内切葡聚糖酶活性高于80% 40到60°C。另一方面,SSC超过100%的剩余活动产生的内切葡聚糖酶在50°C和衰变后60°C。内切葡聚糖酶由SSC和SmC损失了大约80%的活动在1小时70°C。比由SSC这些内切葡聚糖酶更稳定米。thermophilaM.7.7 [30.]。

几个化合物内切葡聚糖酶活动的影响进行了分析使用SSCWB产生的粗提取液和SmCP(表1)。影响显示一些差异产生的酶在两种情况下,会出现相反的效果或不同程度的激活/抑制。最引人注目的差异MnCl发生₂,导致一个强大的SSC获得的内切葡聚糖酶的抑制,同时增加酶的活动从SmC,这表明“新”同功酶表达在这个培养系统和所述阳离子显著激活。由于EDTA抑制培养系统生产的内切葡聚糖酶,这是预期,二价阳离子会增加酶活性。铁抑制可能是由于铁的影响^{3 +}纤维素(减少结束的33]。

3.4.2。β-Glucosidases

的β葡糖苷酶活动由种植系统显示最大活动(图5.0 pH值6(一))。报道真菌的最佳pH值β-glucosidases落入广泛,2 - 2.5 [34),4.5 (23,27),4.8 (35),和6.0 (36),但大多数这些酶显示高pH值的活动范围4 - 5 (37]。pH值对稳定性的影响(图6 (b))分析了pH值范围从2.5到11孵化24小时后在室温(25°C)。的β-glucosidases由SSC和SmC的活动高pH值3.5,10.0。剩余活动急剧下降在酸或碱性pH值。

温度的影响β葡糖苷酶活动如图7(一)在pH值为5.0,分析获得的提取物在培养系统。SmC的资料表明,温度最适条件的亚型有不同的价值观。SSC, SmC的最大值是65°C和70°C。Falkoski et al。27)找到了一个最佳温度55°C和Iembo et al。34这是65°C。

热稳定性(图7 (b))是由测量剩余活动孵化后在1小时40 - 70°C。原油提取都是稳定60°C。

一些化合物的影响β葡糖苷酶活性进行了分析使用SSCWB产生的粗提取液和SmCP(表1)。影响显示一些差异产生的酶在两种情况下,会出现相反的效果或不同程度的激活/抑制。最引人注目的差异MnCl发生₂,导致一个强大的激活β葡糖苷酶通过SSC,而从SmC增加这些酶的活动。

4所示。结论

的嗜热真菌米。heterothallicaF.2.1.4。被证明是一个伟大的制作人的内切葡聚糖酶,用甘蔗蔗渣和麦麸固态培养或在水下使用纸板种植。纸板在SmC的残留物容易访问和能够诱导合成的内切葡聚糖酶的亚型,而原油提取特征时,耐热性的和生物技术应用的促使我们进行进一步的研究。获得的beta-glucosidases SmC显示更高的稳定性。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢FAPESP,必须占州政府CNPq(巴西)对金融支持和玛西娅Maria de Souza博士莫雷蒂对她有用的讨论结果。