嗜盐细菌Lunsu产生一系列重要的工业酶的耐盐的活动

文摘

SS2嗜盐细菌隔离,SS3,魔法,和SS8特征等重要的工业酶生产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和谷氨酰胺酶。嗜盐细菌隔离魔法石,第1章和SS3表现出盐依赖胞外淀粉酶和蛋白酶活动。嗜盐的隔离魔法石,第1章和SS3表现出最大的淀粉酶和蛋白酶活动在1.5和1.0 M氯化钠,分别与最佳pH值8和温度40°C。SS2显示最大细胞外蛋白酶和脂肪酶的活动在0.75 M氯化钠,在最佳pH值为7,温度37°C。SS3谷氨酰胺酶活性的增加与氯化钠的浓度增加到2.5米。L-glutaminase活动的最佳pH值和温度SS3 8 - 40°C,分别。合并后的水解细菌分离嗜盐的活动可用于生物转化的有机材料有用的产品。

1。介绍

酶水解酶是一类广泛分布在自然界从细菌到高等真核生物。日益增长的需求酶稳定的注意力集中在高盐浓度下存活。嗜盐菌获得特殊利益,因为他们可以在一个广泛的盐浓度。嗜盐微生物的潜在来源extremozymes叫halozymes如蛋白酶、淀粉酶、核酸酶、脂酶、多种纤维素酶、木聚糖酶、过氧化氢酶、酯酶,它能够运行在高浓度的盐,广泛的pH值和温度的其他蛋白质通常会沉淀或变性。可以利用halozymes无论酶转换需要功能的有机溶剂和极端温度和盐的含量。Halozymes相同的酶的功能,比如他们的nonhalophilic同行但表现出明显的差异在他们的结构特点使其功能在恶劣的条件1]。主要包括高比例的酸性氨基酸在蛋白质表面和要求的高盐浓度为最佳的生物功能。嗜盐的酶也稳定在高盐浓度由于略疏水凝聚组和蛋白质的水化表面由于羧基组中谷氨酸和天冬氨酸。这些halozymes商业化在各种行业包括食品、烘焙、饲料、化工、制药、造纸和纸浆,洗涤剂、皮革工业、鱼酱和酱油制剂,含盐废水,油田废物处理(2,3]。等嗜盐菌Salicola marasensissp, IC10Pseudoalteromonasspp。Haloarcula sp。,Haloferax mediterranei,Natrialba magadii,Salimicrobium halophilumLY20,Salinivibrio sp。,Nesterenkoniasp.毒株F,Chromohalobacter sp。TVSP 101,Halomonas meridiana一直在探索halozymes如淀粉酶、脂肪酶、谷氨酰胺酶,蛋白酶(4- - - - - -8]。某些酶的嗜盐菌显示polyextremophilic haloalkaliphilicity等功能,从而展示活动在高盐、高碱条件下(9]。例如,酶分离Pseudoalteromonasspp。CP76展示其最优活动在高盐浓度(7.5%氯化钠)和pH值8.5 [2]。此外,一些古细菌酶是极大的兴趣,如淀粉酶Haloarculasp,函数优化在甲苯4.3盐和稳定,苯,氯仿(10]。

随着盐降低水分活度的影响,嗜盐的酶被认为是重要的生物催化剂在low-water-activity环境中,如在水/有机和非水介质(11]。碱性蛋白酶对二甲苯、乙醇、丙酮、丁醇、苯,氯仿已从耐盐报道链霉菌属clavuligerus应变Mit-1 [12]。

在这项研究中我们描述的筛选和鉴定嗜盐的微生物产生的胞外水解酶与土壤沉积物Lunsu,盐水的喜马偕尔邦,印度。作者的知识,这是第一个研究胞外水解微生物活动的评价从Lunsu孤立。

2。材料和方法

本研究中使用的嗜盐菌株分离土壤沉积物的Lunsu水体,喜马偕尔邦,印度(13]。细菌分离株被确定16 s rDNA使用27 F和1492 R引物测序。

五个嗜盐的菌株Halobacillus trueperi(魔法石,第1章KM260166),Halobacillus trueperiSS3 (KF751761),Shewanella藻类SS2 (KF751760),Halomonas venusta《魔法(KF751762)Marinomonas sp。SS8 (KF751763)被用于筛查和细胞外halozymes的表征。

2.1。嗜盐细菌酶的特性的表征

2.1.1。定性酶化验

SS2嗜盐细菌隔离,SS3,魔法,SS8筛选淀粉酶,蛋白酶和脂肪酶活性磅琼脂培养基含有1 M氯化钠。中补充1%淀粉、1%的脱脂牛奶,渐变- 80和1%各自的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活动。所有的halobacterial隔离被孵化培养在磅1 M氯化钠在37°C 24 h用颤抖的200 rpm。文化的吸光度为600 nm和细胞密度被规范化。每个应变相同数量的细胞被发现和盘子孵化在37°C 48小时。

这些嗜盐的隔离也用于L-glutaminase生产染料的检测程序(14]。所有的细菌培养接种在培养基补充谷酰胺和酚红的pH值指标为1%。文化管在37°C孵化48 h。

可视化淀粉酶活性、淀粉琼脂板有细菌生长泛滥克的碘溶液。周围明确区细菌菌落的出现表明利用淀粉的嗜盐的细菌,从而表明淀粉酶活性的存在。蛋白酶活动的板块进行评估通过监测周围的间隙带细菌生长。菌落周围的区域形成的水解酪蛋白中由于蛋白酶生产脱脂牛奶。细菌脂肪酶生产表现出降水渐变- 80细菌生长的地区和区域降水的殖民地渐变- 80平皿上证实,脂肪酶酶产生的隔离。对于每个试验,带间隙测量从三个独立的实验和平均值与标准偏差(cm)报告。谷氨酰胺酶生产评估媒介的改变颜色从黄色到粉红色。

2.2。定量酶化验

2.2.1。制备胞外粗酶

嗜盐的隔离生产酶分别接种在磅含有1 M氯化钠和肉汤培养48小时37°C。潜伏期后,所有的文化都是离心机在4°C 8000 rpm,持续15分钟。花中游离的文化被用来确定细胞外酶活性。总蛋白在胞外介质是由布拉德福德估计方法(15]。

2.2.2。淀粉酶活性

淀粉酶活性量化了二硝基水杨酸(DNS)方法使用淀粉作为底物(16]。20μ克总蛋白(花中游离细胞外酶源)淀粉溶液添加到0.2毫升的1%。反应混合物在30分钟37°C和孵化酶反应是停在2.0毫升的DNS试剂。此外,反应混合物在水浴煮10分钟,在室温下冷却,吸光度测量在540海里。一个单位的淀粉酶被定义为酶释放的数量1μ在试验条件下每分钟克麦芽糖。

2.2.3。蛋白酶活性

蛋白酶活性测定所描述的Kuberan et al。17]。反应混合物1毫升1%酪蛋白(不溶性)反应缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷Cl,液pH值8.0,和100毫米氯化钠)与20混合μg蛋白的粗胞外酶源和孵化在37°C 30分钟。反应是停止通过添加3毫升的5%三氯乙酸(TCA),其次是在8000转离心5分钟。洛瑞的上层清液用于量化的方法利用酪氨酸作为标准通过测量吸光度在660纳米18]。被定义为一个单位的蛋白酶活动释放的酶量1μ克每毫升酪氨酸的反应混合物在试验条件下每分钟。

2.2.4。谷氨酰胺酶的活动

谷氨酰胺酶酶活性测定的估计从谷氨酰氨释放量19]。20μg蛋白的粗胞外酶源混合0.5毫升0.04谷酰胺,0.5毫升的0.1米磷酸盐缓冲剂(pH值7.0),和0.5毫升蒸馏水。在37°C反应混合物是孵化30分钟,停止了通过添加柠檬酸0.5毫升的1.5米。0.5毫升以上混合物被添加到3.7毫升蒸馏水添加0.2毫升奈斯勒试剂紧随其后。吸光度是记录在450 nm和氨解放从硫酸铵的标准曲线计算。一个单位的谷氨酰胺酶被定义为释放的酶量试验条件下氨微克分子之一。

2.2.5。脂肪酶活性

脂肪酶测定混合物由0.75毫米对位nitrophenyl棕榈酸酯(pNPP)和20μ在0.1 g粗胞外酶磷酸钾缓冲的pH值7.0 3毫升反应体积。反应混合物在37°C孵化为30分钟,停止了通过添加1毫升冷丙酮混合物:乙醇(1:1)。p-nitrophenol释放的吸光度测量在410纳米20.]。未知浓度的p-nitrophenol决心p-nitrophenol图标准的发布。一个单位的脂肪酶被定义为酶的释放量在试验条件下每分钟p-nitrophenol微克分子之一。酶空白准备所有的化验没有添加相应的酶。

2.3。确定最优氯化钠浓度、pH值、温度对酶的活动

上述标准试验条件下,最优氯化钠浓度、pH值、温度对每个的酶(淀粉酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶和脂肪酶)活性测定。研究氯化钠对酶活性的影响,酶化验进行不同氯化钠浓度(0、0.5、1、1.5、2、2.5 M氯化钠)。最佳温度对酶活性是由孵化反应混合物在不同温度范围内20°C。研究了pH值对不同的酶活性的影响在不同pH值的反应缓冲第5 - 11 ()。反应缓冲区使用包括citrate-phosphate缓冲区(pH值5和6),磷酸缓冲(pH值7),Tris-HCl缓冲区(pH值8和9),和glycine-NaOH缓冲区(pH值10和11)。

所有的酶化验都至少重复三次,结果报道在这里代表三个独立实验的平均和标准偏差。

3所示。结果

3.1。嗜盐细菌隔离魔法石,第1章和SS3盐相关的嗜盐的淀粉酶活性

检查嗜盐细菌分离株的能力生产淀粉酶、淀粉琼脂板与革兰氏细菌生长被淹没了碘如上所述。与克洪水后的碘,一个清晰的观察区周围嗜盐的分离株的生长魔法石,第1章和SS3,这表明淀粉酶活性的存在。带间隙的平均直径厘米为魔法石,第1章和分别为厘米为SS3(图1(一))。相比之下,没有SS2观察区间隙,魔法,SS8隔离。E。杆菌应变DH5α既表现出增长也没有任何淀粉酶活性。

3.2。盐(氯化钠)的影响、pH值和温度对淀粉酶的活性嗜盐细菌的分离

定量淀粉酶试验是由DNS方法使用淀粉作为衬底和花中游离酶源。酶测定淀粉酶产生嗜盐细菌隔离了,魔法石,第1章和SS3。研究盐对淀粉酶活性的影响,定量进行淀粉酶测定反应缓冲区包含增加氯化钠浓度(0,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,和2.5米)。嗜盐细菌隔离魔法石,第1章和SS3显示胞外淀粉酶活性在0.5 - 2 M氯化钠,以最大的酶的活性U /毫克1.5和分别U /毫克1 M氯化钠(图1 (b))。有趣的是,没有观察到淀粉酶活性在缺乏生理盐水(魔法石,第1章和SS3 0 M)表明淀粉酶活性(表的嗜盐的性质1)。

魔法石,第1章和SS3化验的细胞外淀粉分解的活动在不同的温度从25到70°C和pH值6 - 12的存在最优氯化钠浓度(魔法石,第1章1.5米和1米SS3)。嗜盐的分离株(魔法石,第1章和SS3)显示,pH值范围的6 - 12和淀粉酶活性温度范围的25-60°C(数字1 (c)和1 (d))。最佳pH值和温度对淀粉酶活性的魔法石,第1章和SS3被发现是8 - 40°C,分别(表1)。令人惊讶的是,60 - 63%淀粉酶活性保留在pH值12到50 - 52%淀粉酶活性观察到60°C(数字1 (c)和1 (d))。

3.3。嗜盐细菌隔离,SS2, SS3蛋白酶活性

最适盐的已知细菌分泌蛋白酶的外部环境可以有独特的生物技术的应用程序。嗜盐的隔离是因此筛选蛋白酶生产基于周围的间隙区增长脱脂牛奶琼脂板(磅琼脂培养基补充1 M氯化钠和1%脱脂牛奶)在37°C如上所述。区间隙出现由于酪蛋白在脱脂牛奶的消化细胞外蛋白酶的作用。嗜盐细菌隔离,SS2, SS3被发现蛋白酶阳性,而隔离魔法,SS8,E。杆菌应变DH5α被发现是蛋白酶-(图2(一个))。区域的直径的间隙,SS2,和SS3,,厘米,分别。因此,嗜盐细菌隔离,SS2, SS3被用来衡量他们的蛋白酶活性。

3.4。影响氯化钠、pH值和温度对蛋白酶活性嗜盐细菌的分离

评估光环宽容蛋白酶酶的性质,定量蛋白酶试验(描述)执行反应缓冲区包含增加氯化钠浓度(0,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,和2.5米)。的蛋白酶活动隔离魔法石,第1章和SS3反应的盐浓度的增加而增加,最大活动1.5和1 M氯化钠,分别(图2 (b);表1)。最大的魔法石,第1章和SS3蛋白酶活动和分别为U /毫克(图2(一个))。没有观察到的活动几乎没有氯化钠和50%活动保留在2 M氯化钠。这些结果表明,蛋白酶活性的魔法石,第1章和SS3分离嗜盐的性质。这是观察到细菌隔离SS2显示最大的蛋白酶的活性U / mg的0.75 M氯化钠。

pH值和温度对caseinolytic活动的影响存在最佳酶决定的氯化钠浓度。确定最佳pH值蛋白酶活性、蛋白酶试验在反应进行不同pH值的缓冲区(5 - 12)。蛋白酶的活性嗜盐的分离,SS2, SS3 pH值6至11。观察最大的蛋白酶活性在pH值为8.0魔法石,第1章和SS3隔离,而SS2 pH值为7.0(图2 (c);表1)。这些结果表明,嗜盐的隔离SS2的胞外蛋白酶是中性的。

确定温度对蛋白酶活性的影响,蛋白酶试验进行如上所述,在不同的温度下孵化(25 30 37、40、50、60、70°C)。的最大魔法石,第1章和蛋白酶活性SS3隔离观察40°C,而SS2隔离表现出最大的蛋白酶活性在37°C,有30%活动保留60°C。这些结果暗示着广泛的温度对于蛋白酶活动(图2 (d))。

3.5。嗜盐细菌隔离SS2展品Halotolerant脂肪酶的活动

检测脂肪酶酶的生产,halobacterial隔离(魔法石,第1章,SS2, SS3、魔法和SS8)被发现在LB培养基补充1 M氯化钠和1%渐变- 80所描述的。只有halobacterial SS2隔离区域降水的产生表明脂肪酶活性(图的存在3(一个))。另一方面,E。杆菌应变DH5失败的生长与生理盐水中补充。

3.6。影响氯化钠、pH值和温度对脂肪酶的活性嗜盐细菌的分离

评估脂肪酶的光环宽容的本质活动SS2的隔离,定量测定酶在反应进行缓冲区包含增加浓度的氯化钠(0 - 2.5)所述。酶活性测定采用pNPP作为衬底。嗜盐细菌隔离SS2显示最大的脂肪酶的活性U / mg的0.75 M氯化钠,脂肪酶活性下降和增加氯化钠浓度超过0.75 M氯化钠(图3 (b))。

pH值和温度对脂肪酶活性的影响确定最佳的氯化钠浓度的存在。最大SS2的脂肪酶活性隔离观察7.0 pH值和温度37°C(数字3 (b)和3 (c);表1)。在12 pH值,大幅降低脂肪酶活性和只有23 - 27%的脂肪酶活性保留(图3 (c))。SS2的最大脂肪酶活性隔离观察在37°C, 65 - 72%活动保留60°C(图3 (d))。这些结果表明,脂肪酶酶活性在广泛的温度。

3.7。所有的嗜盐细菌的分离,除了魔法石,第1章展览谷氨酰胺酶的活动

谷氨酰胺酶是一种重要的工业酶,因此,嗜盐细菌的分离筛选谷氨酰胺酶生产如上所述。所有的嗜盐细菌的分离,除了魔法石,第1章显示改变介质的颜色从黄色到粉红色(图4(一))。这些结果表明,这些分离株阳性谷氨酰胺酶的活动。

3.8。盐效应、pH值和温度对谷氨酰胺酶活性嗜盐细菌的分离

谷氨酰胺酶活性的嗜盐的分离氯化钠浓度的增加而增加1 M氯化钠(图4(一))。最大SS2特定谷氨酰胺酶活性的细菌隔离,SS3,魔法,SS8 1, 2.5, 1.5,和0.75 M氯化钠,,,分别U /毫克。有趣的是,谷氨酰胺酶的活性SS3氯化钠浓度的增加而增加2.5 M氯化钠(图4 (b))。谷氨酰胺酶活动的最佳pH值的细菌隔离SS3 pH值和魔法8(图4 (c))。最大SS2的谷氨酰胺酶活性和观察SS8 pH值7(图4 (d))。谷氨酰胺酶活动的最适温度SS3和魔法40°C, SS2 37°C时,SS8(表1)。超过25%谷氨酰胺酶的活性嗜盐细菌隔离保留在pH值和温度70°C(图114 (d))。

4所示。讨论

4.1。Halozymes Lunsu是由嗜盐细菌的分离

嗜盐菌的丰富来源酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和木聚糖酶。总的来说,这些酶被称为halozymes,酶表现出耐盐或盐相关的催化活性。在目前的研究中,五个嗜盐细菌隔离被发现产生一个或多个halozymes如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和谷氨酰胺酶。在伊朗,咸水湖泊Rohban等人报道了嗜盐菌株能够产生不同的胞外水解酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、DNase菊粉酶,果胶酶,纤维素酶,和支链淀粉酶)(21]。Virgibacillussp.应变JS5孤立从土壤阿拉伯西海岸的卡纳塔克邦,印度表现出可能产生胞外酶如淀粉酶、蛋白酶、菊粉酶,白明胶酶(22]。

淀粉酶是几个行业的重要组成部分。嗜盐的淀粉酶提供额外的潜在耐盐。在这项研究中,魔法石,第1章和SS3嗜盐的淀粉酶展出活动,需要至少0.5的存在氯化钠酶活性。在定量分析,发现淀粉酶的活性嗜盐的隔离魔法石,第1章和SS3最高的1.5和1 M氯化钠,分别。这是一个有吸引力的财产盐水含淀粉废水处理残留在高盐的存在。此外,没有观察到淀粉酶活性低于0.5 M氯化钠。最佳温度和pH值对淀粉酶活性的魔法石,第1章和SS3 40°C和pH值8,分别。Coronado等人报道的最适温度α淀粉酶产生的Halomonas meridiana是37°C (23]。Halobacillussp.应变MA-2发现展览最大的淀粉酶活性在1 M氯化钠和酶活性的最佳pH值和温度是7.5和50°C,分别。与淀粉分解的活动LY9分离到一株中度嗜盐的土壤样本收集从运城,中国。酶显示最优活动60°C, pH值8.0,2 M氯化钠(24]。

嗜盐的/ halotolerant蛋白酶酶是有利的在工业过程浓缩盐溶液将抑制nonhalophilic蛋白酶活动使用。数组之间的五个Lunsu嗜盐细菌分离株,嗜盐细菌隔离,SS2,和SS3表现出细胞外蛋白水解活性。最大的蛋白酶活性的魔法石,第1章和SS3观察生理盐水在1 - 1.5米,而SS2显示最大蛋白酶活动pH值在0.75 M氯化钠存在7。耐盐的存在蛋白酶活动已经报道了Halobacterium halobium,Natrialba magadii,Natronococcus occultus(25- - - - - -27]。在另一项研究中,caseinolytic活动的Halobacillus karajensis应变MA-2被发现最优温度50°C, pH值9.0和0.5 M氯化钠(28]。在另一项研究中,最佳蛋白酶的活性细菌haloalkaliphilic S5沿海盐碱生境的古吉拉特邦隔绝,印度,观察到1.8 M氯化钠和pH值9 - 9.5 [29日]。因此,比较从我们的研究结果与现有的文献表明,蛋白酶嗜盐细菌隔离产生的魔法石,第1章和SS3展览最佳halotolerance,思想活跃1.5 M氯化钠。

由于他们的能力在有机溶剂的存在,嗜盐的脂酶是有利的脂肪酶介导催化发生在水和有机层的接口。因为脂酶是有利的几个应用程序,Lunsu的嗜盐细菌分离株脂肪酶生产进行了探讨。SS2隔离被发现具有细胞外脂肪酶活性。

最佳盐浓度、pH值、温度对脂肪酶活性的细菌隔离SS2 0.75 M氯化钠,pH值7.0,分别和温度37°C。中度嗜盐菌属芽孢杆菌和葡萄球菌隔绝Maharlu盐湖在伊朗被报道阳性脂肪酶活性(30.]。极端halotolerant脂肪酶也报告了Haloarcula marismortui(31日,32]。嗜盐的菌株Chromohalobactersp。LY7-8高脂解的活动是孤立的从运城盐湖,中国33]。酶显示最优活动60°C, pH值9.0和2.1 M氯化钠。同样,从halotolerant嗜盐的脂肪酶葡萄球菌warneriPB233显示最佳pH值为7.0,温度40°C的活动。这是稳定的温度和pH值7.0和9.0之间的30 - 40°C。纯化脂肪酶显示最大活动2.5 M氯化钠的存在,表明其嗜盐的性质(34]。因此,可以利用SS2嗜盐细菌的分离halotolerant细胞外脂肪酶的生产。

谷氨酰胺酶,在一般情况下,展览活动的存在高浓度的盐。嗜盐菌是宝贵的谷氨酰胺酶的来源,由于halozymes的生产。在目前的研究中,嗜盐细菌SS2隔离,SS3,魔法,SS8展出分泌细胞外谷氨酰胺酶与不同属性的能力。SS2的谷氨酰胺酶活性嗜盐细菌隔离,SS3,魔法,SS8被发现耐盐、酶功能在2.5 M氯化钠的存在。此外,haloenzyme谷氨酰胺酶还显示活动的存在广泛的pH值(6尺11寸)和温度(25 - 50°C)。

谷氨酰胺酶从Stenotrophomonas maltophilianyw - 81被发现是稳定的pH值在2.6 M氯化钠8 [35]。大约50%的酶活性是保留在70°C, 10分钟。L-Glutaminase获得米曲霉显示最佳温度范围的活动37-45°C和失去了活动55°C (36]。海洋微球菌危害K3据报道,谷氨酰胺酶活性在pH值8.0,温度50°C, 1.5 - 2 M氯化钠(37]。虽然研究了谷氨酰胺酶在真菌和其他嗜中温细菌,很少报道存在嗜盐菌的谷氨酰胺酶。在这种背景下,Lunsu作为小说的嗜盐细菌分离株的谷氨酰胺酶的嗜盐的来源域。

5。结论

产生的成本有效的细胞外酶嗜盐的隔离Lunsu有巨大的经济潜力的工业、农业、化工、制药和生物技术的应用程序。合并后的一些嗜盐的水解活性细菌隔离可以用于生物转化的有机材料在高盐度或污染环境有用的产品。由于他们的能力仍然功能在高温等极端条件下,各种各样的pH值,和高盐浓度,halozymes孤立在这个研究提供重要的生物技术的潜力。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

作者感谢Shoolini大学,塘鹅,为本研究提供的资金和基础设施支持。

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