两个同功酶的晶体结构的柠檬酸合成酶硫化叶菌tokodaii应变7

文摘

Thermoacidophilic archaeon硫化叶菌tokodaii菌株7有两个柠檬酸合成酶基因(ST1805-CS和ST0587-CS)基因组中有45%的序列的身份。因为他们表现出相似的催化活性的最佳温度和热失活档案,我们这些同功酶结构进行比较说明适应机制的高温高温CSs。ST1805-CS的晶体结构和ST0587-CS测定为2.0和2.7决议,分别。结构比较显示,他们都是两个相同的亚基组成的二聚的酶,这些二聚的结构非常类似于柠檬酸合成酶从古细菌和真细菌。然而,ST0587-CS 55离子对在整个二聚体结构,而只有在ST1805-CS 36。虽然离子对的数量和分布不同于对方,intersubunit离子对每一个同工酶是相同的两个域之间尤其是interterminal地区。因为离子对的位置和数量的趋势与其他CSs从嗜热微生物因素负责热适应ST-CS同功酶的特点是在interterminal地区离子对。

1。介绍

蛋白质从嗜热微生物具有独特的结构性能,高的热稳定性。结构的研究表明,各种因素负责热适应机制,例如,大量的离子对和离子对网络,加强intersubunit接触,减少的灵活性N - c端多肽,和减少的数量和总量内部蛀牙(1- - - - - -5]。

EC 2.3.3.1柠檬酸合成酶(CS),参与三羧酸循环的一种酶,催化缩合的草酰乙酸和acetyl-coenzyme-A (CoA)柠檬酸和辅酶a。CS已经从各种孤立的生物体,包括真细菌和古细菌类。CSs从真核生物、古生菌和革兰氏阳性细菌二聚的结构在生理条件下,而革兰氏阴性细菌的分离与一些例外[homohexamers6,7]。雷明顿和他的同事们曾决定CSs从猪和鸡线粒体的结构8,9]。二聚的CSs从微生物生活在一个宽的温度范围内,也就是说,它们有着超嗜热菌,也被调查(10- - - - - -14]。主要的酶组成α螺旋线。与猪CS组成20螺旋线(T螺旋),古CS缺乏,H, T螺旋线和总共有16个螺旋线为形式,在每个单元都有多肽长度大约380残留物,50残留短于真核生物CSs。每个多肽包含两个域,大域,负责二聚物的形成,和小领域,显示了一个刚体旋转相对于大型域绑定后基质活性部位这两个域之间的间隙。比较研究微生物CS结构集中,专注于执行相关的趋势似乎增加热稳定性(5,10- - - - - -14]。然而,多种因素似乎交织在这个热稳定性问题,因为这些微生物生活不仅在不同的温度也在各种环境中pH值和盐等力量。

Thermoacidophilic archaeon硫化叶菌tokodaii应变7,生长在75°C和pH值下有两个基因编码两种截然不同的假设的CS的同功酶15]。其中一个编码的开放阅读框(ORF) ST1805称为ST1805-CS,和其他编码ORF ST0587,称为ST0587-CS。这两个同功酶含有柠檬酸合成酶的共识序列。他们的氨基酸序列显示45%的身份虽然是来自相同的生物体,这意味着这两个同分异构体ST-CS已经进化分支线的系统发育树。

我们确认这两个同功酶在高温CS和确定它们的晶体结构在决议2.0和2.7,分别。ST-CSs的晶体结构允许我们做出的详细比较酶结构与热稳定性和thermoactivity和理解公因数ST-CSs的适应机制,高温和CSs从其他来源。

2。材料和方法

2.1。纯化的重组蛋白

大肠杆菌(Rosetta-gami DE3)转化质粒pST1805和pST0587生长在LBL 37°C (Luria-Bertani-Lennox)中包含100μ20 g / mL羧苄青霉素和μ克/毫升氯霉素。细胞被离心收获4600 g×10分钟,用50 mM生理盐水洗净,resuspend在三羟甲基氨基甲烷缓冲液(20毫米Tris-HCl (pH值8.5),1毫米EDTA, 1毫米2-mercaptoethanol PMSF和1毫米)。收获细胞破坏了使用超声波声波降解法均质器(150 W)。细胞碎片和大颗粒被删除在20000×g离心20分钟。浮在表面的分数在90°C孵化10分钟内在蛋白质的变性大肠杆菌及其变性蛋白质被离心20000 g×30分钟在4°C。当时上层清液应用于25毫升亲和柱与三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Red-TOYOPEARL)平衡。蛋白质与0.1 - -0.8 M的线性梯度筛选了三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的氯化钠。分数包含ST-CS汇集,透析三羟甲基氨基甲烷缓冲液,然后进行阴离子交换色谱使用串联的三个HiTrapQ惠普列平衡与三羟甲基氨基甲烷缓冲液。蛋白质与线性梯度筛选了0 - 1.0 M氯化钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。分数含ST-CS汇集和集中Centriprep-30 (Amicon)。

2.2。结晶

晶体ST1805-CS和ST0587-CS获得的悬滴扩散方法在20°C。结晶的ST1805-CS下降(2μL)的蛋白质溶液(5毫克/毫升)和1μL水库的解决方案包含2 M硫酸铵,0.1 M消息灵通的pH值7.0和2% (w / v) PEG400和产物混合物的解决方案是对0.5毫升的储层的解决方案。Pillar-shaped晶体生长成一个大小为0.2×0.1×0.3毫米在一周内。

晶体的ST0587-CS在类似的条件下获得。从2的混合物μL的蛋白质溶液(1毫克/毫升)和1μL储层解决方案由3 M甲酸钠和0.1消息灵通的pH值7.0,双锥体的ST0587-CS晶体生长的大小在一周内0.2×0.2×0.2毫米。

2.3。衍射数据收集

晶体的水库中浸泡10分钟解决方案包含冷冻保护剂(30% (v / v)甘油)。随后晶体flash-cooled液氮。在数据收集过程中,晶体是保持在100 K下冷的气流从cryostream氮。收集衍射图像使用CCD检测器(MarResearch) beamline BL44B2的SPring-8 (Harima、日本)。衍射数据处理Mosflm [16],SCALA [17),和截断18)纳入CCP4程序套件(19]。

2.4。结构分析

与CNS1.0 ST1805-CS的晶体结构是解决20.分子)的替代方法使用一个模型的开放形式SS-CS (PDB ID: 1 o7x)作为初始模型。旋转和翻译搜索后,刚体进行细化的分辨率范围审查费。妥善解决与Rfactor 0.45给出了空间群P2₁。晶体细化被反复执行应用模拟退火,共轭梯度最小化,和b因子细分的分辨率范围14.8 - -2.0。手动模式与XtalView建筑物被执行(21]。

结构ST0587-CS决心以同样的方式使用的开放形式栖热菌属酸奶CS (PDB ID: 1 iom)作为搜索模型。旋转和翻译搜索后,刚体进行细化的分辨率范围审查费。妥善解决与Rfactor与空间群P4 0.49了₁2₁2。晶体细化被反复执行应用模拟退火,共轭梯度最小化,和b因子细分的分辨率范围43.0 - -2.7。最终模型的质量评估使用程序PROCHECK [22]。数据收集和总结了改进的数据表1。

坐标和结构参数与蛋白质数据银行已经发表在加入代码1 vgm ST1805-CS和虚地磁极ST0587-CS。

数据生成与Clustal W (23],ESPript [24],Pymol [25),和LigPlot + (26]。

2.5。柠檬酸合成酶化验

柠檬酸合成酶活性化验如前所述[27]。分析混合物(300μL)包含0.2毫米草酰乙酸,乙酰辅酶a 0.15毫米,0.2毫米,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)在缓冲区组成的20毫米磷酸钠,pH值7.0,2毫米EDTA。规定的试验温度。

催化活性对温度的依赖性分析研究了柠檬酸合成酶活性的三分钟温度范围30 - 100°C。在这种情况下,底物和染料时不被破坏的试验甚至超过100°C(数据未显示)。

热失活的研究是由孵化混合溶液在95°C为给定的时期。整除被移除在冰的间隔和迅速冷却。剩余的酶活性测定在70°C下上述试验条件。

3所示。结果

3.1。序列分析

图1显示了序列比对中五从低温微生物和四个超嗜热菌的CSs。四个嗜热菌的CSs显示> 30%氨基酸序列的身份,而它们之间的序列的身份,从低温微生物CS节细菌属Ds2-3R(DS-CS)低得多(18%)。这表明这同源性水平是至关重要的表达CS的酶活性物种。两个同功酶ST-CS与彼此分享45%的身份。ST1805-CS CS来自同一属密切相关硫化叶菌solfataricus(SS-CS)和他们分享68%的氨基酸序列的身份。另一方面,ST0587-CS展览51%序列的身份与CS hyperthermophilic archaeon海床furiosus(PF-CS)。所有这四个CSs高温或hyperthermophilic酶,表明有限数量的氨基酸残基为耐热性的CSs或不同的策略,采用热稳定性之间的两个同功酶。

表2显示这些CSs的氨基酸组成。之间没有相关性源生物的生长温度和热不稳定的残留的内容天冬酰胺,谷氨酰胺,脱酰氨基作用导致的不可逆失活。然而,两个带电残基谷氨酸的含量和赖氨酸显示增加趋势开发耐热性以及半胱氨酸和蛋氨酸含量下降趋势(28,29日]。带电残基会形成离子对提高结构刚度,因此应考虑与耐热性相关。

3.2。酶活性的温度依赖性

图2显示了ST-CSs催化活性的温度依赖性。催化活性的温度最适条件ST-CSs进行测定酶化验1分钟的时间在不同的温度下30到100°C。热处理是足够短的持续时间是稳定的,没有不可逆失活。ST1805-CS和ST0587-CS表现出类似的活动资料,有类似的最佳温度。

3.3。热稳定性

图3显示块热失活ST-CSs的95°C。两个同功酶的活性几乎是在这个温度不变时的经历。然而ST0587-CS的稳定性略低于ST1805-CS;ST-CSs都减少的活动只有< 2%为预培养5分钟。

3.4。ST1805-CS分辨率2.0的结构

单斜晶体属于P2 ST1805-CS结晶₁2.0,x射线衍射分辨率。在这个晶体,不对称单元包含两个单体有几乎相同的整体结构(图4(一))。最后一个模型是由376个氨基酸残基单元(两个残留在n端无序),341个水分子,甘油分子和硫酸盐离子。二聚的结构,每个单元分为大域有11个α螺旋(c g、我和螺旋线,残留3 - 216和325 - 378年)和一个小领域有5个α螺旋(N-R螺旋,残留217 - 324)(图4 (d))。四个螺旋(F, G、M和L螺旋线)在大域面对相应的螺旋线在另一个亚基,形成一个核心螺旋束(F′, G-G′, mm′,和L-L′螺旋线;残留的主要表示从其他单元(图)4 (c))。二聚的结构是由一个扩展的c端进一步加强循环,这涉及到一个β链相互作用β链(残留13 - 17)的n端其他亚基。第二个的β链(残留物,20 - 23日28-31和34-35)n端形成一个反平行的β表,限制假设活性部位。

两个肽二聚的结构叠加与均方根(.)0.41的偏差。明显区别是优先看到的小领域,也就是说,它是更大的比大域(0.65)(0.23)。这种差异可以解释为考虑到包装的蛋白质。B亚基的小领域挤压到开放空间在单位细胞,而小域单元的接触我螺旋和胃肠道循环大域的相邻二聚体分子保持晶体结构。不对称的环境下,小域动态自由造成显著差异小的领域。

建议有两个域之间的铰链区,周围的小领域能够进行刚体旋转。这种铰链的地区之一位于螺旋M和N之间的循环,两个甘氨酸残基(Gly220和Gly221)连续发生。这对甘氨酸残基循环结构的所有CSs(图中是守恒的1)。

铰链区在亚基的ST1805-CS,甘油分子与两个甘氨酸残基(Gly220, 221 g)和与His219硫酸盐离子(图5(一个))。后者渣是一种公认的substrate-binding参与绑定的柠檬酸和草酰乙酸残留微生物CSs (30.]。His184、His259 Arg268、Arg339 Arg359′,重要的底物结合残留物,接触的内表面裂。因为这些氨基酸也保存在各种各样的CS序列,很有可能一样,ST1805-CS催化机理提出了其他的CSs。

在B亚基的结构,一些水分子活性位点被发现,伴随氢键三个精氨酸残基的侧链(Arg268、Arg339 Arg359′)和一个组氨酸残基(His184)。

3.5。ST0587-CS分辨率2.7的结构

属于P4 ST0587-CS结晶成斜方晶体₁2₁2.7 2,x射线衍射分辨率。在这个晶体形式,不对称单元包含一个单体。这也柠檬酸合成酶形成二聚的结构,正值结晶的二倍的二倍轴轴(图4 (b))。最后一个模型是由373个氨基酸残基,40个水分子。作为ST1807-CS观察,每个单元被划分为一个大域11α螺旋(c g、我和螺旋线,残留1 - 212和321 - 373年)和一个小领域有5个α螺旋(N-R螺旋,残留213 - 320)(图4 (d))。的主要架构ST1807-CS中二聚的结构是一样的;即核心螺旋束是由四对螺旋线(f′, G-G′, mm′,和L-L′螺旋线)和c端循环延伸到其他单元。三股合成氨基地区并入(和32-33残留21页,26 - 29日),形成一个反平行的β表,而一个intersubunitβ表中发现ST1805-CS ST0587-CS缺席。

ST0587-CS的结构,六个假定的substrate-binding残留物(His180、His215 His254, Arg263, Arg335,和Arg354′)也结构守恒(图5 (b))。虽然这些残留的安排是几乎相同的亚基的ST1805-CS,没有配体但水分子活性位点的确定由于分辨率的限制。这些变化在活性位点导致位置的灵活性小域相对于大域。

4所示。讨论

目前的结果表明,得到的两个基因硫化叶菌tokodaii编码柠檬酸合酶同功酶,展览活动。众所周知,许多生物拥有多个基因编码柠檬酸合成酶(31日- - - - - -33]。的酶真核生物、革兰氏阳性细菌和古生菌显示homodimeric结构,而一个革兰氏阴性细菌大肠杆菌有其他同工酶hexameric形式(34,35]。大肠杆菌hexameric酶柠檬酸合成酶以及二聚的一个来自其他生物体,而其他二聚的酶大肠杆菌是2-methylcitrate合酶,其基质propionyl-CoA和草酰乙酸,尽管它也有轻微的活动与乙酰辅酶a (36,37]。另一个例子,热原体属acidophilum有两个c基因,Ta0169 Ta0819,分享,而高达68%的序列的身份;因此他们可能会显示类似的构象和功能彼此相似的(38]。因此我们需要表达和纯化重组蛋白的催化活性进行调查的第一步。

ST-CSs展览主要柠檬酸合成酶活性,在ST1805-CS略高于ST0587-CS高温,和催化活性对温度的依赖关系(数据是相似的2和3)。这个结果是合理的,因为我们能找到一个趋势两个同功酶的氨基酸组成的序列对增加带电残基。因为带电残基可能形成离子对发展热适应机制,接下来我们调查ST-CSs的两个同功酶的结构,让它们之间搜索候选人详细比较因素负责适应高温。

对比的整体结构ST-CSs表明r.m.s.对应373 C之间的偏差α原子的每个单体都是1.27。随着小域增加灵活性与大域相比,我们比较两个域分开。大型和小型的rmsd域显示只有细微差别的1.25和1.13,分别。它表明,整个二聚体构象之间高度保守的开放形式的ST-CSs。大型和小型域的相对位置也彼此相似。

两ST-CSs显示类似的自催化活动依赖于温度,我们搜查了共同的结构特点的静电相互作用。意外,两个同功酶的结构表现出的数量和分布的离子对ST-CSs之间有很大的不同(图6)。的数量组成残留电荷相反的离子对坐落在4.0是36 - 55每二聚体ST1805-CS ST0587-CS,分别。整个二聚体离子对更分散的表面比ST1805-CS ST0587-CS。

特别是,我们发现相同数量的离子对位于c端两ST-CSs单体之间的地区。精氨酸残基Arg378/373 (ST1805-CS / ST0587-CS)在最c端端是salt-bridged谷氨酸Glu47′/ 45 D′′的螺旋,第三个c端Glu376 / Asp371′与Arg60′/ 58′E′螺旋的相邻单元(图7)。另外三个离子对形成的不同的两个同功酶之间的残留。在ST1805-CS,三对arginine-glutamate Arg370-Glu56′, Glu368-Arg30′,和Arg356-Glu10′形成的新的β从每个单元链使在两末端位于前两对之间,后者。另一方面,这三个相互作用的ST0587-CS lysine-glutamate被修改为一组,也就是说,Lys360-Glu14′, Lys356-Asp9′,和Lys351-Glu8′。这些常见的离子对相互作用在c端循环增加到可能稳定活性位点的形成。这个离子对本地化的数量和热稳定性和活动似乎相互关联(图7)。这种趋势符合之前删除突变PF-CS的经验的结果,两年期和13-residue删除的c端端PF-CS表明,c端端变得越短,温度最佳催化活性越低下来即使13-residue缺失突变体显示比two-residue更耐热性的缺失突变体(39]。SS-CS,终端区域显示了c端五残留障碍和失踪,但几乎所有残留负责静电相互作用在这个地区所示ST1805-CS SS-CS守恒。

接下来,我们发现密集电相互作用在分子表面(图8)。在ST1805-CS,离子对网络组成的三个残基;Asp109 GI循环和Asp202 LM循环与Lys215 salt-bridged在M′N′′邻近单元(图的循环8(一个))。在ST0587-CS,离子对网络是由四个组织残留,Asp93 Arg96 G螺旋,在MN Lys211循环,和Asp198在L′′′邻近单元循环,持续到疏水中心的螺旋包(图8 (b))。尽管趋势中残留物的数量由离子对网络比嗜中温CS和低于hyperthermophilic CS两ST-CSs[在这个地区40- - - - - -43),位置在ST1805-CS循环区域是不同的。此外,ST0587-CS有几个离子对表面包括intersubunit区域(图8 (c))。因为它是很难估计的贡献在分子表面离子对网络在生理ST-CSs低ph值条件下,这些离子对应该排除在本研究适应高温的机制。

5。结论

在这项研究中,我们调查了两个同功酶的CS硫化叶菌tokodaii使用晶体和生化技术应变7。这些同功酶显示类似的高催化活性和高温稳定性,然后共同的结构特点适应高温被搜索的机制。结构比较它们之间显示离子对的数量之间存在较大的差异,但相同数量的离子对位于ST-CSs终端地区被发现。我们建议,这些终端交互必不可少的适应机制从嗜热微生物的高温CS。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有关于这篇文章的出版相互竞争的利益。

确认

作者感谢梁线员工SPring-8 (Harima、日本)在数据收集技术援助。他们也感谢会长Kunio Ihara教授的宝贵意见。

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