文摘
质膜氧化还原系统电子传递链(pmr)是一种无所不在地呈现在所有类型的细胞。它转移电子从细胞内基质细胞外调节受体的氧化还原状态。姜黄素,隔绝姜黄,调节细胞生理的影响由于其膜交互能力和抗氧化剂的潜力。本研究调查的影响姜黄素对pmr活动Wistar鼠的红细胞孤立在体外和在活的有机体内和验证通过在网上对接模拟研究使用Molegro虚拟码头工人(MVD)。姜黄素也评估对谷胱甘肽水平的影响(谷胱甘肽)和氧化剂的潜力等离子体测量等离子体的等效铁氧化电位(PFEOP)。结果表明,姜黄素显著()在剂量依赖性的方式表达下调pmr活动。分子对接结果表明,姜黄素与细胞色素活性部位腔的氨基酸还原酶,pmr的一个关键组成部分。姜黄素还能增加红细胞和血浆谷胱甘肽水平,同时减少氧化剂的潜在(PFEOP)等离子体。改变pmr活动和氧化还原状态与一些健康并发症包括老龄化和糖尿病的病理生理学;因此,上述发现可能解释的一部分,姜黄素健康有益的作用。
1。介绍
质膜氧化还原系统电子传递链(pmr)是一种广泛存在于所有细胞类型的转移电子从细胞内基质细胞外受体保持氧化还原内稳态对于一个成功的细胞生理学(1]。pmr一直在建议中发挥重要作用,减少氧化应激;这个属性被假设控制衰老的速度,寿命,和许多病理条件与氧化应激增加有关2,3]。提出了pmr的功能包括维护蛋白质的氧化还原状态,刺激细胞生长,减少脂质氢过氧化物,回收的α生育酚,降低铁离子transferring-independent铁吸收的途径之前,和维护浓度的抗坏血酸(2- - - - - -6]。此外,pmr还调节生理功能细胞代谢、细胞增长,离子通道的活性,细胞死亡与氧化还原电位的变化(7,8]。pmr活动也起着重要的作用影响细胞外抗坏血酸的回收,从而防止其损耗(9]。pmr捐赠电子细胞外抗坏血酸盐分子自由基(误判率)来自细胞内氧化还原谷胱甘肽(GSH)、L-ascorbic酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),和其他等价物(减少9,10]。
细胞生理机能是由氧化应激介导的氧化还原状态变化调制特别减少谷胱甘肽(11]。谷胱甘肽是一种亲水抗氧化剂与亲核硫醇基被报道参与调控基因表达,蛋白质合成、细胞增殖、信号转导、细胞因子的生产、细胞凋亡、免疫反应,和蛋白质glutathionylation [11]。谷胱甘肽保护细胞和生物分子与氧化损伤,从而提供一个强大的抗氧化剂防御机制对活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS) [12- - - - - -14]。
姜黄素(1E6E)1、7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) 1, 6-heptadiene-3, 5-dione)、biphenolic分子分离姜黄(姜黄)pleotropic健康保护作用包括抗氧化、抗炎、心血管保护,anticancerous和反血管增生属性(15,16]。姜黄素的生物属性的广泛是由于它能够绑定到超过100确定不同的分子靶点17]。姜黄素调节细胞活动通过与膜结合蛋白和调制信号级联互动活动通过改变双层膜的流动性(17]。姜黄素的作用在调节氧化还原状态是复杂的和仍然不是完全理解。本研究进行了探讨在体外姜黄素对红细胞的pmr活动的影响存在剂量依赖的相关性和验证通过在活的有机体内研究Wistar鼠。我们也报告在网上姜黄素与细胞色素的对接还原酶比较MoleDock H-bond分数和天然配体βnadh。姜黄素的影响也在等离子体氧化还原状态评估以及红细胞谷胱甘肽的浓度和血浆铁与氧化电位(PFEOP)。
2。材料和方法
2.1。化学和仪器
姜黄素是从生物基本购买公司,加拿大安大略省(猫。数量#CB0346)。DMPD (N,N二甲基-p苯二胺盐酸盐)购买从西格玛奥德里奇,印度。其他化学物质的最高纯度从默克公司购买印度、印度和HIMEDIA实验室。数字酸度计网络扫描500由默克公司生产的pH值是用来测量解决方案。分光光度测量进行紫外可见分光光度计(日本岛津制作所- uv - 1800)。
2.2。实验研究
2.2.1。动物
男性患白化病老鼠(纯种菌株)体重介于150到200 g从CDRI购买,印度勒克瑙。动物被安置在聚丙烯笼子里每笼老鼠(6)°C下12 h: 12 h暗周期。动物喂养与标准颗粒饮食从新德里获得行业有限,勒克瑙,印度和免费获取饮用水。协议的研究是符合机构伦理委员会的指导方针,阿拉哈巴德大学。24老鼠被随机分为四组(六大鼠/组):组(I):控制,没有接受治疗/补充;集团(II):实验控制,老鼠通过口服途径补充0.9%氯化钠溶液;集团(III):姜黄素治疗组(340毫克/公斤合著。、盐);集团(IV):姜黄素治疗组(170毫克/公斤合著。生理盐水)。口服补充姜黄素和牺牲的老鼠进行了辛格的方法和Rizvi [18]。
2.2.2。制备血红细胞和包装在体外实验与姜黄素
老鼠的血液肝素化是离心机在4°C 800×g 10分钟。新鲜血浆用于实验分析。等离子体去除后,淡黄色的外套,和上15%的包装细胞,剩下PRBCs与10毫米洗两次磷酸缓冲盐pH值7.4。在体外姜黄素的影响被观察到孵化与姜黄素(10洗涤红细胞−5米到10−8M)为30分钟37°C(如前所述19]。
2.2.3。测量的pmr活动
pmr活动测量方法后Avron和Shavit20.]。简要0.2毫升PRBCs悬浮在磷酸缓冲盐(PBS)包含5毫米葡萄糖和1毫米铁氰化钾(新鲜)的最终体积2.0毫升。悬浮液是孵化为30分钟37°C,然后离心机在4°C 1000×g 5分钟。收集到的上层清液为亚铁氰化物化验内容使用4,7-diphenyl-1, 10-phenanthroline二磺酸二钠盐和测量吸收535海里。pmr的活动计算通过使用消光系数,= 20500−1厘米−1。pmr活动中表达μ摩尔亚铁氰化物/毫升PRBC / 30分钟。
2.2.4。谷胱甘肽的测定
血浆和红细胞谷胱甘肽测定根据布鲁斯的方法(21]。方法是基于sh组谷胱甘肽的能力减少5、5′-dithiobis, 2-nitrobenzoic酸(DTNB)成黄颜色的阴离子产品的吸光度测量在412海里。水溶液中已知的减少谷胱甘肽浓度用于标准校准。谷胱甘肽的浓度决定了使用标准的阴谋。谷胱甘肽的浓度表示μ等离子体和mg / mL PRBCs g / mL。
2.2.5。氧化剂的等离子体
等离子体氧化能力的等离子体等效铁氧化潜力(PFEOP)测量根据Mehdi法和Rizvi [22]。短暂的100毫米原液DMPD是由溶解209毫克的DMPD 10毫升蒸馏水。100毫米醋酸缓冲(pH值5.25)混合制备的100毫米醋酸钠(75.98毫升)和100毫米醋酸(24.02毫升)将pH值5.25。1毫升DMPD股票的解决方案是添加到100毫升醋酸缓冲(0.1米,pH值5.25)将DMPD浓度为1毫米。氯化铁的标准曲线是由以0.020 - -0.20 mM氯化铁为最终浓度2毫升的解决方案(1.9毫升DMPD与100年解决方案μL氯化铁相应解决方案)。最终的解决方案保持15分钟和吸光度是在505 nm DMPD空白。100年μL(4次)稀释的等离子体添加到1.90毫升DMPD工作方案(1毫米醋酸缓冲)。整个内容混合好,保持室温孵育10分钟,然后离心5分钟在6000×g在4°C。上层清液的吸光度是在505 nm DMPD解决方案没有等离子体为空白。这一发现吸光度与三价铁为最终浓度标准曲线。等离子体氧化能力报告为毫米铁等离子体的等效/ L。
2.3。计算研究
2.3.1。蛋白质和配体结构的准备
人类NADH-cytochrome还原酶的三维结构是下载蛋白质数据库(pdb id = 1 umk,分辨率= 1.75)(23,24]。输入文件的蛋白质是由使用Molegro虚拟码头工人(MVD)。失踪的氢原子和债券订单信息。靶蛋白的活性位点腔是选择基于Kesharwani et al。25]。姜黄素的结构和其他选择的配体从pubchem下载数据库和准备使用MVD。
2.3.2。对接仿真
对接仿真研究是由Molegro虚拟码头工人(MVD),一个自动对接软件惠普Z800工作站。仿真结果返回五个不同的姿势MoleDock和H-bond分数(26]。
2.4。统计分析
统计分析是由图垫棱镜5版本5.01 (Graphpad软件公司,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。单向方差分析(方差分析)是为了评估参数之间的关系之后,Bonferroni之间的多重比较检验比较不同治疗组。所有的值被视为具有统计学意义。
3所示。结果
图1显示,在体外姜黄素(10−5米到10−8米)触发的pmr差别浓度依赖对这些活动从Wistar鼠红细胞获得。观察到10的pmr差别最大对这些活动−5米(姜黄素);减少效果观察姜黄素的浓度降低到10−8M。在活的有机体内口服补充姜黄素(340和170毫克/公斤合著)大鼠显著()降低红细胞的pmr活动与控制和实验控制老鼠(图2)。效果那么明显观察到低浓度的姜黄素;效果是相似的在体外观察。图3显示了一个提出了pmr活动姜黄素的作用机理。
的二级结构(卡通)表示人类NADH-cytochrome的活性部位还原酶(1 umk.pdb)一起对接构象配体如图4。分子对接仿真结果图中描述5(一个)和表1的活性位点残基催化人类NADH-cytochrome的单位还原酶(1 umk.pdb)。Arg91,Ile109 Tyr93 Lys110 Tyr112,Phe113,His117 Thr116 Phe120、Gly123 Gly124, Lys125,Met126,Ser127,Thr181,和Gln210积极参与氢键和疏水作用βnadh。图5 (b)表明,姜黄素与His77积极互动,Pro92 Tyr93, Thr94, Val108, Ile109,Lys110Gly179 Thr181,Gly182,Pro185 Thr184 Cys273, Pro275氨基酸催化中心。五和两个氢键形成氨基酸出席的活性部位β分别nadh和姜黄素。表2表明,姜黄素的MoleDock分数和H-binding能源与NADH-cytochrome自然配体相比相对较低还原酶(βnadh)。
(一)
(b)
图6表明,在体外,孵化的姜黄素(10−5米到10−8与鼠红细胞显著(米)谷胱甘肽浓度增加;最大的影响是观察到10−5姜黄素M;低浓度引起较小的反应。体内,姜黄素(340和170毫克/公斤合著)补充显著()在血浆和红细胞谷胱甘肽浓度增加(数据7(一)和7 (b))。图8显示,在活的有机体内姜黄素(340和170毫克/公斤合著)补充显著()减少了氧化剂等离子体(PFEOP)的潜力。
(一)
(b)
4所示。讨论
红细胞的pmr起着重要的作用在调节抗氧化状态的等离子体在衰老和年龄相关的疾病的进展27,28]。Rizvi等人提出,长物种固有的高红血球pmr活动提供了有效的武器来对抗氧化应激(2]。膳食多酚pmr活动有调节作用与细胞内化(3]。姜黄素已被报道与磷脂双层膜头组织通过氢键在低浓度在高浓度和疏水尾地区;这些交互可能诱导膜流动性的改变和相关交通系统活动(29日,30.]。
我们的结果表明,姜黄素表达下调pmr活动健康的红细胞在体外(图1)以及在活的有机体内(图2以剂量依赖性的方式)。观察到的效应可能是由于两相的交互姜黄素与双层膜和/或相互作用的活性部位的氨基酸pmr。一个假设的提出姜黄素的分子机制pmr活动是在给定的图3。
pmr由氧化还原酶和细胞色素的电子载体蛋白作为主要的实体还原酶(EC 1.6.2.2)是一个关键酶。建议的机制入手,交互的姜黄素组膜可以减轻氧化应激膜没有影响pmr以外的活动。然而,交互在膜疏水尾地区提高姜黄素的浓度降低了pmr的活动。
图4,展示了人类NADH-cytochrome的活性部位还原酶(1 umk.pdb)。积极分子对接模拟的结果表明,姜黄素和氨基酸形成氢键相互作用:Lys110和Gly182,和疏水作用His77 Pro92 Tyr93, Thr94, Val108, Ile109, Gly179, Thr181, Thr184, Pro185, Cys273, Pro275氨基酸活性部位腔。结果表明,姜黄素具有良好的MoleDock分数由于疏水性和H-bonding互动;然而,竞争与天然姜黄素配体的相互作用βnadh, NADH-cytochrome还原酶NADH-cytochrome要求更高浓度的姜黄素表达下调还原酶活性。
Mitochondria-deficient细胞(通过维持细胞)幸存下来的比例NAD / NADH和辅酶Q降低移植pmr活动(31日]。细胞内氧化还原分子如谷胱甘肽被报道和捐赠质子NADH-cytochrome交互还原酶(32]。pmr活动增加报道与损耗的细胞内谷胱甘肽浓度(33]。据报道,“氧化还原缓冲”蜂窝系统的容量是证实主要是由谷胱甘肽,细胞的氧化还原状态的指标(34]。细胞谷胱甘肽水平较低已被证明更容易对辐照和压力(35]。
在这里,我们发现,在体外,姜黄素诱导的氧化还原状态红细胞谷胱甘肽浓度增加(图证明6)。口服补充姜黄素的健康的老鼠也引起血浆谷胱甘肽水平(图7(一)在红细胞(图)7 (b))。观察之前,口服剂量姜黄素大鼠增加肝细胞的氧化还原状态通过增加的活动γgc(谷胱甘肽合成的速率限制步骤),GPx和销售税(36]。以前我们也报道,姜黄素强烈保护人类红细胞谷胱甘肽水平对氧化应激(19]。我们观察姜黄素补充减少健康老鼠的PFEOP价值表明红细胞减少脆弱性对氧化应激,从而减少pmr活动。
5。结论
结果表明,姜黄素与双层膜下调等离子氧化还原系统的交互活动,效果更明显在更高浓度(> 10−6米)。此外,姜黄素还会刺激细胞内谷胱甘肽,同时减少氧化剂等离子体的能力。受损的氧化还原状态和改变pmr活动参与各种年龄相关的疾病。上述研究结果提供证据表明姜黄素是一种有效的分子可能被用作补充战斗病态与氧化应激有关。此外结果可能部分解释传统治疗策略的有效性基于使用姜黄年龄相关性疾病的预防。
缩写
| pmr: | 质膜氧化还原系统 |
| 坏蛋: | 姜黄素 |
| 谷胱甘肽: | 减少谷胱甘肽 |
| PFEOP: | 等离子体铁氧化电位。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关。
确认
支持的工作是科学和工业研究理事会,新德里,印度,以奖学金的形式角色辛格作为高级研究员。拉杰什·库马尔Kesharwani承认CLC生物提供许可使用MVD软件。阿拉哈巴德大学生物化学系,支持拳头从科技部授予,印度的政府。