生产和高耐热性的特征β葡糖苷酶在甲基纤维素的生物降解尖孢镰刀菌

文摘

的生产β葡糖苷酶从尖孢镰刀菌研究了在降解的纤维素基质(Avicel,α纤维素,羧甲基纤维素(CMC)和甲基纤维素)。优化生产β葡糖苷酶使用纤维素基质支持最高收益率的酶检查超过192 h发酵时期和不同pH值的3.0 - -11.0。的β葡糖苷酶生产为特征的工业应用的适用性。甲基纤维素支持的最高收益率β葡糖苷酶(pH值6.0和177.5 U / mg) 30°C发酵解放为2.121的96 hμ摩尔/毫升葡萄糖。粗酶的最佳活动pH值5.0和70°C。酶稳定广泛的pH值4.0 - -7.0范围内的相对剩余活动60%以上经过180分钟的孵化。β葡糖苷酶表现出高耐热性,其83%的原始活动保留在70°C 180分钟后孵化。的活动β葡糖苷酶被Mn增强^{2 +}和菲^{2 +}相对活动分别为167.67%和205.56%,在5毫米和360%和315%,分别在10毫米。所表现出的性质β葡糖苷酶显示适用性改进酶的工业应用的纤维素化合物的水解成可发酵糖,可用于能源发电和生物燃料生产。

1。介绍

纤维素是全球最丰富的可再生生物聚合物和农业废料约占1.5×10¹²吨的总生物量年产量在热带地区(1,2]。纤维素被认为是全球碳排放的最重要来源之一(3,4]。

纤维素作为一种可再生的能源的价值使得纤维素水解强烈的主题研究和工业利益2]。已经有许多研究,旨在获得新的微生物能产生较高的纤维素分解酶特定的活动和更高的效率(5]。纤维素酶在自然生物降解过程中发挥重要作用植物木质纤维原料高效降解纤维素分解真菌、细菌、放线菌和原生动物。在工业上,这些酶发现新颖应用生产可发酵糖和酒精,有机酸、洗涤剂等化学物质。多种纤维素酶提供一个重要机会来实现巨大的生物质利用的好处(6]。纤维素酶是合成的微生物。真菌和细菌纤维素降解的主要自然代理(7]。

木质生物质酶参与的生物降解的纤维素酶系统,其中β葡糖苷酶是组成(8]。这是因为这个系统完整的纤维素水解为葡萄糖需要的酶(多种纤维素酶),包括内切葡聚糖酶,exoglucanases (cellobiohydrolases)β葡糖苷酶。β葡糖苷酶水解纤维二糖裂开了β-(1 - 4)链接生成葡萄糖。因此,β-glucosidases允许纤维素分解酶功能更有效地通过生产葡萄糖和纤维二糖和减少纤维二糖抑制(9]。需要一个相当大的增加β葡糖苷酶的活动,特别是在纤维素酶糖化的生物能源,强烈刺激的研究β葡糖苷酶(8]。

的β葡糖苷酶家族(EC 3.2.1.21)是一个广泛的酶催化水解的各种各样的苷(10]。虽然一些生物分泌或内切葡聚糖酶β葡糖苷酶,在其他生物,β葡糖苷酶缺乏或生产数量不足(11]。当β葡糖苷酶分泌较低,纤维二糖积累而不是葡萄糖(12]。纤维二糖积累作为feedback-inhibitor纤维素的解聚endo和exoglucanases [13)这是一个关键因素在工业规模将纤维素转化为葡萄糖(14]。可以缓解这个情况在工业规模由外生的纤维素生物质转化β葡糖苷酶酶。

获得有效和耐热性的β葡糖苷酶已经成为许多研究在世界范围内的目标。在糖化酶热稳定性是至关重要的一步,因为蒸汽总是用来制造更适合酶法水解底物(15]。耐热性的酶可以同时使用,直接在糖化过程中没有预冷过程。针对激烈的耐热性的要求β葡糖苷酶在工业应用中,我们调查了在这个研究的生产β葡糖苷酶,病圃在纤维素的生物降解不同的深层发酵条件下,产生的生化特性β葡糖苷酶。

2。材料和方法

2.1。化学物质

对硝基苯-甘氨酸,βAvicel -D-glucopyranoside,甲基纤维素,盐酸、醋酸钠,蛋白胨,钠trioxocarbonate (IV)、氢氧化钠、磷酸二氢钾,磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸镁、氯化汞、氯化锰、氯化钙、氯化铁(II)、铁(III)氯化,牛血清白蛋白(BSA)、三(羟甲基)氨基甲烷,和葡萄糖产品Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。所有其他化学物质均为分析纯。

2.2。微生物

所使用的微生物是一种真菌隔离从腐烂的木头选择Ijare柑橘种植园,帕斯州,尼日利亚西南部。被确认为压力尖孢镰刀菌生物技术部门的联邦工业研究所,拉各斯,基于形态学和生化方法所描述的柯林斯et al。16]。真菌菌株是保持新鲜马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)偏和储存在4°C。

2.3。剂的制备和生产β葡糖苷酶

剂的尖孢镰刀菌是由铂环量的增长在100毫升含葡萄糖培养基斜面培养法(10.0 g / L),硝酸铵(2.0 g / L), KH吗₂阿宝₄(0.8 g / L), K₂HPO₄(0.2 g / L), MgSO₄h·7₂O (0.5 g / L),酵母提取物(2.0 g / L)与pH值调整到锥形瓶200毫升6.0 [17]。72年的文化孕育了37°C hr在160 rpm摇晃孵化器(英国斯图亚特)。抱种子文化是用作生产培养液媒体。种子培养液4毫升(v / v)构成4%被转移到100毫升无菌生产媒体含有甲基纤维素(10 g / L), KH₂阿宝₄(2 g / L), ZnSO₄h·7₂FeSO O (0.003 g / L)₄h·7₂MnSO O (0.005 g / L)₄h·7₂MgSO O (0.002 g / L)₄h·7₂啊,(0.3 g / L), CaCl₂(0.3 g / L), CoCl₂(0.002 g / L), (NH)₄)₂所以₄(1.4 g / L),酵母提取物(0.1 g / L),尿素(0.3 g / L),和胨(0.25 g / L) pH值6.0和192 h孵化。术后48小时间隔取出细胞培养使用绘画纸滤纸过滤,滤液在10000 rpm离心机使用冷藏30分钟在4°C台式离心机(埃普多夫5810 r)。上层清液作为细胞外酶的来源。数量的葡萄糖(还原糖)解放在纤维素的生物降解周期确定使用DNS方法(18]。

2.4。酶测定

β葡糖苷酶活性决定根据木材和Bhat[描述的方法19),一些修改。一百五十微升(150μ酶提取了450 L)μ对硝基苯- L(6.67毫米β-D-glucopyranoside埃普多夫管和孵化40°C 30分钟。反应是400年终止的μL 1 M Na₂有限公司₃和对空白吸光度被记录在400海里。一个单位的酶活性被定义为所需的酶解放1μ在标准试验条件下的摩尔p-nitrophenol。

2.5。测定葡萄糖浓度在降解纤维素的解放

葡萄糖的浓度(或还原糖)解放生物降解媒体决意spectrophotometrically每隔48 h生物降解期间根据米勒(描述的方法18]。反应混合物构成了300年μ上层清液和700 LμL(二硝基水杨酸(DNSA)解决方案,这在100°C煮5分钟。这个反应混合物冷却是在水和吸光度是在575海里。葡萄糖降解时期中解放出来的数量估计使用葡萄糖标准曲线。

2.6。蛋白质含量测定

蛋白质浓度测定方法的布拉德福德(20.使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。在分析,200年μL(稀释染色试剂用移液器吸取到10μ样品溶液的L。混合物在室温下被孵化15分钟允许适当的色彩发展。对空白吸光度测量在595海里。的具体活动β葡糖苷酶表达为U /毫克的蛋白质。

2.7。pH值对生产的影响β葡糖苷酶在纤维素生物降解和解放的葡萄糖

的生产β葡糖苷酶研究在不同pH值3.0 - -11.0范围超过96小时的时期通过调整深层发酵培养基培养成各种pH值在30°C。的最佳pH值为β葡糖苷酶生产病圃决心培养期结束时通过测量酶活性使用标准化验。量的葡萄糖(还原糖)解放生物降解时期决心如前所述。

2.8。不同形式的纤维素基质对生产的影响β葡糖苷酶在纤维素降解和解放的葡萄糖

一些碳源进行了对生产的影响β葡糖苷酶,病圃。Avicel,α纤维素,羧甲基纤维素进行了测试在1% (w / v)的最佳pH值决定的β葡糖苷酶生产病圃甲基纤维素作为控制的地方。文化在160 rpm增长了96个小时。β葡糖苷酶生产栽培时期结束时测量来确定支持最高收益率的酶的碳源。量的葡萄糖(还原糖)解放生物降解时期决心如前所述。

2.9。描述的β葡糖苷酶从病圃

2.9.1。pH值的影响β葡糖苷酶活性和稳定性

pH值对活性的影响β葡糖苷酶是由分析酶活性的pH值3.0到11.0使用50 mM各种缓冲区的pH值范围(glycine-HCl (pH值3.0 - -4.0),醋酸钠(pH值5.0 - -6.0),Tris-HCl(7.0 - -8.0),和glycine-NaOH (pH值9.0 - -11.0)]使用前面描述的标准试验程序。pH值的稳定性β葡糖苷酶是由孵化的粗酶解相关不同pH值的缓冲区(3.0 - -11.0)没有衬底180分钟40°C。剩余β葡糖苷酶活动确定了180分钟后孵化使用前面描述的标准试验程序。

2.9.2。温度的影响β葡糖苷酶活性和稳定性

温度对粗酶活性的影响是由孵化反应混合物的温度从20到90°C,持续15分钟。此后,的活动β葡糖苷酶测定如前所述。热稳定性是由孵化原油β葡糖苷酶在温度范围从30到300分钟90°C。整除的酶(100μL)撤回在30分钟间隔和被用来确定其残余的活动。剩余活动计算参考活动获得孵化之前担任控制。

2.9.3。金属离子的影响β葡糖苷酶活性

二价金属离子(Ca的影响^{2 +}、镁^{2 +}、铁^{2 +}、锰^{2 +}、铜^{2 +},Hg^{2 +})β葡糖苷酶活性测定添加5毫米和10毫米的金属氯化反应混合物。β葡糖苷酶活性测定使用标准分析程序的最佳pH值和温度。

3所示。结果与讨论

3.1。培养时间对生产的影响β葡糖苷酶在纤维素降解和解放的葡萄糖

β葡糖苷酶生产研究,以确定最优产量的栽培时期酶及其对解放的影响葡萄糖在纤维素的降解。对于生产的结果β葡糖苷酶和葡萄糖的解放病圃提出了在图1。β葡糖苷酶活性观察到48 h与特定活动67.33 U /毫克和增加到最大(130 U / mg)栽培的96 h。同样,自发增加浓度的葡萄糖解放退化期间观察48小时(1.637μ摩尔/毫升)直到96 h时最大得到解放的葡萄糖(1.758μ摩尔/毫升)。产量大幅下降β观察葡糖苷酶与特定活动的96 h后52.33 U / mg和41.3 U /毫克144 h和192 h记录,分别。酶的产量下降减少因此影响甲基纤维素的水解为葡萄糖生产同样获得了96 h后(图1)。减少酶生产后最优种植时期可能是由于失活或抑制发酵过程由于疲惫媒体或营养物质的积累有毒废物,阻碍了真菌的生长21]。获得的结果表明,葡萄糖和生产之间的相关性β葡糖苷酶量的葡萄糖解放在培养期间是依赖的产量β葡糖苷酶,病圃(9,22]。加西亚et al。23最近报道的最佳生产β葡糖苷酶从Lichtheimia ramosa(27.2 U /毫升)。然而,Quiroz-Castaneda等人报道最大的生产β葡糖苷酶在192 h的发酵Bjerkandera adusta和Pycnoporus sanguineus(24]。

3.2。pH值的影响β在纤维素降解葡糖苷酶和葡萄糖生产中解放出来

为了优化各种条件影响酶促降解纤维素和生产β葡糖苷酶,pH值被发现是一个关键参数影响的过程(25]。的生产β葡糖苷酶,病圃逐渐增加从pH值3.0 (60 U /毫克)直到pH值6.0时达到了最优生产(177.5 U / mg)呈现在图2。结果显示下降后酶生产pH值6.0。同样,甲基纤维素的生物降解病圃在不同pH条件下显示,退化过程与酸碱从3.0增加到6.0时得到最大释放葡萄糖的浓度(2.121μ摩尔/毫升)。然而,在这个最佳pH值,在葡萄糖的浓度逐渐下降解放观察从酸碱7.0到11.0(图2)。之前的研究表明,真菌多种纤维素酶的最佳pH值因物种而异(21]。最佳pH值记录在本研究pH值6.0支持萨拉赫丁等人的发现和Perez-Avalos et al .,谁获得最大的产量β从嗜中温株放线菌和葡糖苷酶纤维菌属flavigena分别在pH值6.0 [25,26]。同样,Otajevwo Aluyi最大降解纤维素的报道芽孢杆菌circulans在pH值为6.027]。然而,法28)最佳的生产报告β葡糖苷酶镰刀菌素proliferatumNRRL26517 pH值5.0,而邦萨尔et al。29日]报道pH值7.0支持的最大生产了多种纤维素酶的最佳答:尼日尔NS-2。Acharya和Chaudhary最大纤维素酶生产的地衣芽。WBS1 (0.388 U /毫升)芽孢杆菌WBS3 (0.342 U /毫升)在8和9的pH值,分别为(30.]。

3.3。碳源对生产的影响β葡糖苷酶在纤维素降解和解放的葡萄糖

病圃生长在不同的商业纤维素基质包括Avicel、α纤维素、羧甲基纤维素(CMC)和甲基纤维素1% (w / v)作为评价的唯一碳源基质支持最佳收益β葡糖苷酶和葡萄糖的解放退化过程。结果表明,所有的商业支持生产基板测试β葡糖苷酶,病圃85.5不同收益率与特定活动的U /毫克,74.67 U /毫克,与Avicel获得68.67 U /毫克,CMC,α分别为纤维素(图3)。有趣的是,甲基纤维素支持的最高收益率β葡糖苷酶(130.33 U /毫克;33.1 U /毫升)病圃。高收益的β葡糖苷酶与甲基纤维素记录的报告没有生产β葡糖苷酶的真菌隔离以甲基纤维素为碳源。Avicel和CMC早些时候报道作为生产好的衬底β葡糖苷酶(25,31日]。因此这一结果使这种形式的纤维素基质的最佳诱导物的表达β葡糖苷酶在工业和生物技术过程。温和的生产β葡糖苷酶得到Avicel (88.5 U /毫克;16.11 U /毫升)相比,获得的收益与甲基纤维素(130.33 U /毫克)建议Avicel也是一个好的基质生产β葡糖苷酶,病圃(图3)。然而,这一结果是与一些先前的报告Avicel据报道,影响生产β由真菌葡糖苷酶。Saibi等人,Sørensen等人报道低收益率β葡糖苷酶,葡萄穗霉属microspora(0.48 U /毫升)曲霉属真菌saccharolyticus(分别为0.66 U /毫升),当Avicel作为碳源(32,33]。

CMC支持的最低收益率β葡糖苷酶(68.67 U /毫克;15.12 U /毫升)与收益率相比其他纤维素基板测试。结果显示,不同形式的用于种植影响纤维素酶生产。的低收益率β葡糖苷酶与CMC可以获得的结果CMC在媒体上的高粘度的限制酶促降解纤维素生产代谢产物增长所必需的(34]。然而,萨拉赫丁等人报道最大的生产β葡糖苷酶的嗜中温放线菌菌株KS-22CMC (25]。

不同纤维素底物的降解测试的结果显示,最大浓度的葡萄糖在降解过程中解放了甲基纤维素(1.76μ摩尔/毫升),其次是CMC (0.33μ摩尔/毫升),Avicel (0.31μ摩尔/毫升),α纤维素(0.21μ摩尔/毫升)。结果显示,收益率的β葡糖苷酶产生的病圃在不同的纤维素基质与还原糖的量是一致的(葡萄糖浓度)中解放出来。然而,一个引人注目的结果是获得与CMC产量较低β葡糖苷酶获得高数量的葡萄糖(图3)。这可能是由于降解物阻遏的生产β葡糖苷酶抑制在更高浓度的葡萄糖的存在。多种纤维素酶被葡萄糖(据报道之前压抑的32,34,35]。

3.4。描述的原油β葡糖苷酶从病圃

3.4.1。pH值对原油活性和稳定性的影响β葡糖苷酶

pH值的影响β葡糖苷酶的活动表明,该酶是活跃在广阔的pH值3.0 ~ 9.0的范围。观察增加酶活性随着pH值的增加与最优活动获得的pH值在5.0之后,出现了逐渐下降的情况(图4)。这项研究的结果同意许多商业的一些早期的报告β-glucosidases已报告在酸性pH值表现出最佳活动区域。Singhania和Karnchanatat等人报告了类似的最佳pH值为5.0β葡糖苷酶从答:尼日尔NII 08121和Daldinia eschscholzii分别为(36,37]。β-glucosidases来自不同物种的青霉菌已报告的最佳pH值范围4.0 - -6.0 (38- - - - - -40]。雷特等人获得最大的产量β葡糖苷酶从Thermoascus aurantiacus在pH值为4.541]。酶稳定pH值在4.0 - -9.0与60%以上的原始活动180分钟的孵化(图后留存4)。早些时候一直密切相关的结果报道Kaur等人β葡糖苷酶产生的Melanocarpussp。3922年MTCC最稳定在40°C (pH值5.042]。这些结果表明,β葡糖苷酶从尖孢镰刀菌展品范围广泛的pH值稳定,因此这使得β葡糖苷酶好生物不同pH条件下适用于工业应用。

3.4.2。温度的影响β葡糖苷酶活性和稳定性

原油的活动β葡糖苷酶从病圃确定在不同的温度下从30到80°C。酶显示出最佳的活动在70°C(图5(一个))。结果显示,57.96%和77%的相对活动记录60°C和80°C,分别(图5(一个))。活动在80°C的温度的损失可能是由于热变性。最优的活动β葡糖苷酶从病圃支持的结果Singhania [36)也报告70°C的最佳活动β葡糖苷酶从答:尼日尔NII 08121后的酶活性下降。相反,巴蒂等人报道65°C的最佳温度和热稳定性β葡糖苷酶从腐皮镰孢霉菌(43]。同样的,一个最适温度60°C已经报道了β葡糖苷酶的种类青霉菌属(39,40,44]。热稳定性研究的结果表明β葡糖苷酶从病圃是高度耐热性的,因为它保留了原始的50%以上活动150分钟后孵化在升高的温度下(图5 (b))。的β葡糖苷酶最稳定在70°C,它表现出良好的稳定性在宽温度范围内的40°C - 80°C。有趣的是,这种酶保留原来的65%以上活动在这个温度范围后60分钟的孵化有96%的剩余活动展出70°C(图5 (b))。许多商业β-glucosidases从真菌早些时候报道被发现在短时间内是稳定的高温后,他们成为变性(9,45,46]。Kaur等人报道β葡糖苷酶从Melanocarpussp。MTCC 3922年损失了超过80%的最初活动30分钟后60°C孵化(42]。刘等人报道,本机β葡糖苷酶分泌来自烟曲霉菌Z5适度稳定孵化60分钟时温度高达50°C,只保留在70°C(约50%的活动9]。它的高稳定性β葡糖苷酶从病圃在长时间的潜伏期在高温下使酶耐热性的和适用于水解纤维素材料。耐热性的β-glucosidases已报告表现出巨大潜力使用在食品加工行业,如能源和lignocellulolytic微生物生物转化成可发酵糖代减少所需的酶量和保持undenatured细长的水解条件下(46,47]。

3.4.3。金属离子的影响β葡糖苷酶活性

金属离子的影响的活动β葡糖苷酶显示活动增加金属离子测试除了Hg的存在^{2 +}。相对活动获得的锰的存在^{2 +}、铁^{2 +}、钙^{2 +}、镁^{2 +},铜^{2 +}分别为167.67%、205.56%、105.55%、111.11%和150%,分别高于100%的控制(图6)。在更高浓度的10毫米的金属离子,快速增加的活动β观察葡糖苷酶相对活动的360%,315%,150%,120%,180%与Mn获得^{2 +}、铁^{2 +}、钙^{2 +}、镁^{2 +},铜^{2 +},分别。酶活性的提高这些金属离子的存在可能是由于这些离子的反应某些氨基酸残基在蛋白质的活性部位,导致酶的构象变化支持更高的活动。β葡糖苷酶活性被抑制在Hg的存在^{2 +}(图5和10毫米6)。这一研究获得的结果同意一些早期的报告中β-glucosidases一些真菌的物种在锰的存在得到了增强^{2 +}和毫克^{2 +}(48,49]。同样,韩寒等人报道的活动的增强β葡糖苷酶从青霉菌simplicissimumH-11 Mn的存在^{2 +}和Ca^{2 +}(50]。先前的研究已经报道的抑制β葡糖苷酶活动Hg^{2 +}(44,51]。快速增加β葡糖苷酶活动的10毫米的金属离子测试这一研究获得的是相反的报告拉马纳坦等人的活动β葡糖苷酶的活动病圃与金属离子的浓度的增加抑制(52]。变化可能是由于不同的真菌菌株。Bhiri等人,汉族等人报道的活性的抑制β葡糖苷酶在铜的存在^{2 +}(44,50]。

4所示。结论

这项研究的结果显示甲基纤维素作为一种优秀的基质生产耐热性的提高β- - - - - -葡糖苷酶从尖孢镰刀菌与其他形式的纤维素相比使用。所表现出的性质β葡糖苷酶表明酶是否适合工业应用的水解纤维素化合物成可发酵糖,可用于能源发电和生物燃料生产。

利益冲突

本文作者确认内容没有利益冲突。

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