文摘

黑色素瘤是最激进的癌症之一,通常对标准化疗耐药。尽管大量的临床试验,任何成功的找到一个可以有效地破坏黑色素瘤的化学治疗剂尚未实现。Para-phenylenediamine (p-PD)据报道,染发剂纯粹作为外部染色剂。很少有人了解p-PD是否影响黑色素细胞产生。我们演示了p-PD介导凋亡人类和小鼠黑色素瘤细胞的死亡在体外。小鼠黑色素瘤肿瘤生长也逮捕了腹腔的凋亡活动管理p-PD几乎没有副作用。显示了这种细胞凋亡发生主要通过线粒体膜电位的损失(MMP),一代的活性氧(ROS),和半胱天冬酶8激活。p-PD介导细胞凋亡也证实了sub-G0 / G1细胞数量的增加。因此,我们的实验观察表明,p-PD可以开发潜在的更便宜的候选人作为黑素瘤的化学治疗剂。

1。介绍

黑色素瘤是最臭名昭著的已知类型的癌症之一。耐大多数类型的研究表明,黑色素瘤化疗通过利用其内在细胞凋亡阻力,通过重组增殖通路在黑色素瘤的发展(1- - - - - -3]。最近的研究表明,黑色素瘤细胞有能力死亡(凋亡延迟4]。

Para-phenylenediamine (p-PD)一直被认为是一个重要组成部分永久性染发剂(5]。很长一段时间,p-PD被用于纺织、皮革、和染发剂行业(6]。p-PD染发剂的报道完全是作为一个外部染色剂(5]。零星的副作用在人类和小鼠模型的p-PD报告(7- - - - - -10]。此外,一些报道的实验设计是不相关的真实使用(11- - - - - -13]。p-PD对皮肤和角化细胞的影响被Blomeke彻底调查和她的团队14- - - - - -16]。p-PD转化为自然氧化和self-conjugation Brandrowski的基地。除此之外,它表明,角化细胞做包含N-acetyltransferase 1 (NAT1)修改p-PD mono - di-N-acetylation,从而调节其毒性(14- - - - - -16]。p-PD的影响在不同的细胞类型和调查发现通过活性氧引起细胞凋亡(17- - - - - -19]。然而,很少做演示的结果p-PD治疗黑色素细胞或黑色素瘤细胞。

在这份报告中,我们调查的影响p-PD黑色素生产A375和B16-F10分别人类和小鼠黑色素瘤细胞系。这里,第一次,我们已经表明,p-PD造成破坏线粒体膜电位和代活性氧导致的凋亡细胞主要是通过激活半胱天冬酶8。我们的研究使用小鼠黑色素瘤模型表明,p-PD诱导细胞凋亡,抑制肿瘤生长。

2。材料和方法

2.1。材料

胎牛血清的边后卫,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) Trypsin-EDTA,抗生素和抗真菌的药物从生活技术,获得美国。单克隆抗体(9532)和anti-actin anti-PARP抗体(4970)从细胞信号技术,购买美国。Anti-caspase 8(9746)和Anti-caspase 9(9502)抗体与细胞信号技术,美国是一个慷慨的礼物Chitra Mondal医生,科学家,和anti-JNK抗体(sc - 137018),半胱天冬酶9抑制剂(1355 C),半胱天冬酶8抑制剂(1230 C),锅半胱天冬酶抑制剂(1355 C)来自Pijush博士。英国Das,首席科学家,印度理工学院化学生物学(IICB),印度加尔各答。从Abcam Anti-Bid抗体(ab77185),美国,是一种礼物从p c博士Sil的分子医学,Bose研究所,加尔各答。二乙酸Dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA)是一种礼物从美国Ghosh博士的生物化学、加尔各答大学。碱性磷酸共轭二次抗体对老鼠和兔子在山羊长大,A3562 A3687,分别。基于MTT细胞计数kit-8 (CCK-8),蛋白酶抑制剂鸡尾酒(P2714), n -乙酰半胱氨酸(NAC) p-PD,谷胱甘肽还原酶,谷胱甘肽,NADPH, EDTA、二硫化谷胱甘肽(GSSG), DTNB,和所有其他试剂如果不是说否则从Sigma-Aldrich公司购买,美国。Alexa萤石®568山羊Anti-Rabbit免疫球蛋白购买从生活技术,美国。

2.2。细胞系、文化和p-PD治疗

A375 B16-F10细胞来源于人类和小鼠黑色素瘤,分别用于本文从国立细胞科学中心,购买印度浦那。细胞系培养在杜尔贝科的修改鹰的媒体含10%胎牛血清(美国生活技术)在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2和95%的空气在37°C (20.]。的股票解p-PD(100毫克/毫升)溶解在DMSO溶液和不同浓度培养基的准备最后的DMSO浓度的0.1%。这两种类型的细胞被播种密度 细胞/ 30毫米板和24小时40%融合发展。培养基被替换为新媒体之前添加不同浓度的p-PD治疗表示时间点的细胞。0.1% DMSO作为车辆控制。

对于使用MTT的可行性分析,5000细胞/被播种在96孔板为24小时。往下,细胞治疗p-PD或0.1% DMSO表示。在治疗后,媒体在每个被替换成100μL新的媒体10紧随其后μL (MTT试剂(CCK-8σ)。吸光度数据收集在一个间隔一个小时到四小时使用Bio-Rad (iMark)标。

使用半胱天冬酶抑制剂的研究,使用的过程非常类似于上面所描述的那样,除了细胞使用半胱天冬酶抑制剂2小时然后治疗24小时p-PD浓度表示。在一个平行实验,MTT试验是为了准确地确定可行的细胞的数量(吸光度)细胞生长中24小时。这个值从获得的值减去所有MTT检测使用半胱天冬酶抑制剂。这些纠正值集没有或抑制剂是计算使用以下方程: 在哪里 是在48小时内吸光度;“我”代表p-PD治疗细胞用半胱天冬酶抑制剂预处理和P代表细胞只有p-PD治疗。 表示细胞的吸光度24小时后播种。修正后的值变化百分比在活细胞从而获得对各自p-PD浓度绘制。使用的抑制剂浓度如下:8半胱天冬酶抑制剂(20μ(15米),半胱天冬酶9抑制剂μ米),锅半胱天冬酶抑制剂(40μ米)。细胞治疗只有这些抑制剂不显示任何不利影响。

2.3。免疫印迹分析

总细胞蛋白质含量控制和p-PD治疗细胞测量,然后1 x蛋白加载缓冲区的细胞被煮10分钟。蛋白质样品受到sds - page和凝胶转移到PVDF膜。5% BSA在PBS的膜被1 h在室温下颤抖,紧随其后的是隔夜孵化与各自的主要抗体在4°C。碱性磷酸酶结合相应的二级抗体在PBS用于1 h在室温下用颤抖的。与抗体的孵化,膜被广泛用PBS Tween-20包含0.2%。细胞膜是由电视台/ BCIP系统按照制造商的协议。

2.4。测定谷胱甘肽(GSH)、二硫化谷胱甘肽(GSSG)、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶活性

谷胱甘肽和测量GSSG根据协议Akerboom和sy [21]。原油提取游离了同等体积的2 M HClO4包含2毫米EDTA和孵化冰20分钟。然后,它在5000 g离心5分钟。得到的上层清液中和了2 M KOH包含0.3消息灵通的。在5000 g离心5分钟后,上层清液用于估计总谷胱甘肽(gssg谷胱甘肽+ 2)通过测量GR-dependent DTNB减少spectrophotometrically 412海里。相同的中和提取处理2-vinylpyridine (50: 1, v / v)在室温下1小时。然后,它被用于GSSG估计使用上面的方法。谷胱甘肽还原酶(GR)活性的原油提取游离决心通过测量NADPH氧化spectrophotometrically在340纳米21]。过氧化氢酶活性测定的吸光度下降在240 nm spectrophotometrically [22]。

2.5。膜联蛋白V-Fluorescein异硫氰酸酯(FITC) / DAPI染色试验

凋亡细胞检测的频率与膜联蛋白V-FITC(技术)。A375 B16-F10细胞与不同浓度的孵化p-PD不同时间点。孵化后,细胞使胰蛋白酶化,收集,用PBS, resuspended 1 x绑定缓冲(玫瑰10毫米,pH值7.4,140毫米氯化钠,CaCl和2.5毫米2)的浓度 细胞/毫升。在肿瘤细胞的情况下,他们洗,直接在绑定resuspended缓冲区。膜联蛋白V-FITC和DAPI (1μ添加了g / mL),在黑暗中孵化,持续15分钟。细胞接受了流量仪分析BD FACSVerse (BD生物科学)使用BD FACSuite软件。至少10000事件记录和表示为点阴谋。半胱天冬酶抑制剂的研究中,我们准备了3套A375细胞。第一个是A375细胞的控制,其次是100年μg / mL p-PD细胞治疗,第三是100细胞μ8 g / mL p-PD治疗但使用半胱天冬酶抑制剂。基底早期和晚期凋亡价值观首先从各自的值减去第二和第三组。然后使用这些修改值计算减少细胞凋亡数的百分比。细胞阳性只有膜联蛋白V-FITC对于膜联蛋白V-FITC和DAPI被认为是早期和晚期凋亡细胞,分别。

2.6。流仪对细胞周期的分析

p-PD治疗后,A375 B16-F10细胞( )收获和PBS冲洗。细胞颗粒固定在70%乙醇−20°C过夜。与PBS洗两次后,这些细胞被孵化与核糖核酸酶(1毫克/毫升)30分钟37°C,然后使用propidium碘染色(π)(50μ在PBS g / mL),其次是孵化RT在黑暗中30分钟。样本分析BD FACSVerse (BD生物科学)使用BD FACSuite软件。至少20000事件进行分析和记录23]。

2.7。流仪分析线粒体膜电位

p-PD处理和未经处理的细胞的线粒体膜电位进行分析(ΔΨm)使用JC 1染料(生命技术)根据制造商的指示。总之,在完成孵化,细胞在DMEM使胰蛋白酶化和收集。 细胞被沾染了2μM JC 1在37°C, 5%的公司230分钟。随后,这些细胞被洗前和PBS resuspended流仪分析BD FACSAria III (BD生物科学)使用BD FACSDiva软件。JC 1染色正常分化细胞将显示高荧光体育频道(PE荧光由于JC 1聚集在线粒体)的存在和低荧光在FITC通道(FITC荧光单体的JC 1存在于细胞);包含去极化的线粒体的细胞,观察将会逆转。至少10000事件进行分析和记录。数据表示为在细胞去极化的MMP的变化百分比。

2.8。流仪分析BrdU合并

我们使用了BD FITC BrdU流工具包,S期细胞比例的决心后,制造商的协议。总之,年底p-PD治疗,细胞被孵化与BrdU 15分钟,然后他们被BD Cytofix固定/ Cytoperm缓冲区。在那之后,细胞被BD Cytoperm对待™透化作用缓冲+细胞再次孵化与BD Cytofix / Cytoperm缓冲区之后DNase治疗暴露BrdU抗原表位。Immunofluorescent使用荧光染料染色完成共轭anti-BrdU抗体。最后,细胞被沾7-AAD随后分析BD FACSVerse使用BD FACSuite软件。至少20000个事件被记录和分析。

2.9。流仪分析细胞内ROS水平

细胞内活性氧的生产是由流式细胞术(24]。短暂,细胞使胰蛋白酶化p-PD治疗后,收集,并与PBS洗两次。 细胞被装满dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA) (2μM,生活技术)和孵化37°C在黑暗中15分钟。在肿瘤细胞的情况下,清洗和装载探针。然后,细胞被清洗和resuspended在500年μPBS的L。样本分析FACSAria III (BD生物科学)使用BD FACSDiva软件。至少10000事件进行分析和记录。可行的细胞结合,脱去乙酰基DCFH-DA, nonfluorescent DCFH反过来由ROS产生荧光定量氧化2′,7′二氯荧光素(DCF)。p-PD治疗显示了积极的绿色荧光的中值因此增加活性氧的量。ROS损耗研究A375细胞进行预处理1小时5和10毫米的谷胱甘肽和南汽,分别在标准细胞生长条件。1小时后,介绍了p-PD在中16小时。半胱天冬酶抑制剂的研究中,预处理是如前所述。

2.10。在活的有机体内抗肿瘤活性p-PD

B16-F10细胞( 细胞/ 50μL)皮下注射(南)的右翼Swiss-Albino小鼠肿瘤生成。及保养的动物是在坚持制度的指导方针进行的动物保健和使用委员会。肿瘤变得可见花了大约两个星期。动物们被分成四组( ,在那里 )。一组只包含没有肿瘤的老鼠。一组小鼠肿瘤轴承不及时治疗。轴承的其他两组肿瘤小鼠给予腹腔注射(2和4毫克/公斤/ 3天)按Wilcoxon p-PD方法(25]。流仪实验,单一的细胞悬浮液由p-PD处理和未经处理的小鼠肿瘤。在毒性研究中,动物们被分为三组( )。第一组收到车辆在正常生理盐水ip和第二和第三组收到p-PD剂量5和10毫克/公斤/ 3天(剂量1和2,分别地。)ip 6周。食物和水摄入的动物被观察到在这个时期。24小时后最后剂量在44天,血液通过心脏穿刺收集从每组血液学的估计和血清生化参数。

3所示。结果与讨论

3.1。p-PD介导黑色素瘤细胞的死亡

探索p-PD对黑色素瘤细胞的影响,我们对A375 B16-F10细胞与不同浓度的p-PD各种时间点。相衬显微镜下初步调查表明,粘附细胞数量随p-PD浓度的增加而减小。所花费的时间观察附着A375细胞的完全丧失大约20,2和0.5小时,10和20毫克/毫升的p-PD分别。

量化这种细胞毒性效应,我们开展了基于麻省理工使用A375细胞生存能力分析和B16-F10细胞处理浓度增加p-PD 6、16、24、48小时。在6个小时的时间,p-PD没有任何两个细胞系细胞毒性效应。数据1(一)和1 (b)表明,大约60%的细胞仍然可行的两种细胞系时接受20和40μp-PD g / mL。治疗100μg / mL p-PD减少了可行的细胞40和20%的A375 B16-F10,分别。当处理100μp-PD g / mL, B16-F10比A375细胞被发现是更敏感的时间点。0.1% DMSO溶液,用作车辆控制显示细胞没有影响。

(一)
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(b)
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(c)
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图1
细胞毒性效应para-phenylenediamine和ortho-phenylenediamine (o-PD)对黑色素瘤细胞。A375 (a)和B16-F10 (b)细胞生长在一个96 -(5000细胞)板处理p-PD表示浓度对16日24和48小时37°C。(c)以类似的方式,A375细胞也接受o-PD 24和48小时浓度表示。四个井用于每个浓度在每一个时间点。一组未经处理的细胞(0.1% DMSO)一直作为控制每个时间点。吸光度读数(OD)每组从微型板块获得读者被用来计算变化百分比在活细胞治疗组在各自的控制使用表达式 。%活细胞控制权是p-PD策划针对各自的浓度。误差线表示SD; 。

研究这种化合物的细胞毒性是否特定对位异构体,我们也进行了类似的MTT测定使用o-PD的黑色素瘤细胞不同浓度处理。图1 (c)清楚地表明,尽管没有观察到细胞死亡在所有集处理o-PD 24小时浓度相似,治疗48小时,然而,一些细胞毒性效应但其程度比p-PD要少得多。

3.2。腹腔内管理p-PD Swiss-Albino小鼠黑色素瘤肿瘤质量的降低

后的决心p-PD在黑色素细胞的细胞毒性效应在文化、我们调查它的黑色素瘤肿瘤的小鼠的影响。之前,评估系统的细胞毒性p-PD在老鼠中,两组小鼠Swiss-Albino(男,3周大)腹腔内(i.p)注射p-PD(5和10毫克/公斤)的区间在6周内3天。治疗后,小鼠似乎相当活跃,未经处理的(数据没有显示)。因此,长达一个月的腹膜管理高达10毫克/公斤p-PD没有任何毒性Swiss-Albino老鼠的迹象。之后,探索p-PD在黑色素瘤肿瘤的细胞毒性效应,我们有皮下注射(南)注入B16-F10细胞( 细胞/ 50μL)的右翼Swiss-Albino小鼠肿瘤生成。两周后,当肿瘤可见,腹腔注射2和4毫克/公斤的p-PD给小鼠肿瘤。我们的结果表明,该p-PD治疗小鼠携带黑色素瘤肿瘤导致肿瘤的质量减少肿瘤大小(图显示2(一个);(C)和(D))和体重(图中相应的减少2 (b))。那些p-PD治疗肿瘤细胞显示细胞凋亡增加明显的膜联蛋白V流仪分析(数据没有显示)。

(一)
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(b)
(b)
图2
身体的老鼠体重增加有或没有p-PD治疗。(一)p-PD对小鼠肿瘤发展的影响。最初,侧翼的两套Swiss-Albino小鼠皮下注射只有PBS (A)和B16-F10细胞(B)中提到的材料和方法。这些老鼠保存2周,直到可见肿瘤组(B)中形成的。组(B)的小鼠被分为三组:一个(C)是处理2和另一(D)是治疗4毫克/公斤p-PD了10天。一组(B)不及时治疗是控制。从每组代表鼠标的照片所示。每组由6小鼠除了组(B),最初18个老鼠用于实验。(b)身体重量的未经处理的小鼠(设置(一))(■),老鼠接受4毫克/公斤p-PD(⧫),老鼠在肿瘤(- - -)(设置(b))和小鼠肿瘤治疗2(▲)(设置(C))和4 (∙毫克/公斤(设置(D))的p-PD策划对天的治疗。箭头表示腹膜p-PD的时间管理。误差线表示SD; 。 指出了双尾 值≤0.018。通过传统的标准,这个被认为是具有统计学意义的差异。

有一些报道有毒p-PD啮齿动物模型的影响。这些研究的副作用p-PD报道大多是基于不切实际的设计,比如喂(9),局部应用(26),和皮下注射13高剂量的p-PD]。除了这些,仅据报道,人口的百分比是过敏p-PD浓度为1%以上(27,28]。凡士林油p-PD 0.3%可靠的报道是对接触性皮炎(26]。此外,一些标准抗癌药物的浓度范围进行静脉注射介于1和100毫米(FDA批准的药物对肿瘤)(29日]。最大浓度的p-PD我们使用是0.01%,相当于略小于1毫米。因此,根据这些报道,p-PD的浓度,我们使用认为非常的安全,有效减少黑色素瘤肿瘤小鼠的质量。进一步验证这一点,我们已经进行了血液学的接受治疗的小鼠和血清生化参数测量与控制(6周)。研究显示,没有死亡率和不良症状没有主要器官的生化变化选择较高的测试组治疗剂量(10毫克/公斤p-PD)。没有发现显著差异在身体体重增加/减少,主要器官的重量和血液学的生化参数的控制和测试组如表所示1和2。

表1
p-PD治疗对体重的影响主要器官重量的老鼠。
表2
p-PD治疗对小鼠血清生化参数的影响。
3.3。p-PD黑色素瘤细胞发生凋亡

理解p-PD治疗细胞死亡的机制,我们首先问是否它是细胞凋亡。为解决这个问题,我们已经测试了PARP的激活,著名的细胞凋亡的标志(30.]。,从A375细胞溶解产物,对待表示p-PD浓度在不同的时间点,分析了使用特定的抗体PARP通过免疫印迹。图3(一个)表明PARP活性形式的(89 kDa)是目前治疗的细胞溶解产物(通道2 - 4、6 - 8和10 - 12)。PARP的裂解形式在未经处理的样品(通道1、5、9)强烈相比少得多的处理样本表明天然凋亡的细胞群的存在。从这个结果同样清楚的是,要么全身PARP的比例降低(比较道6和7)或PARP活性形式的比例增加(比较车道10和11)浓度的增加p-PD治疗。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
在黑素瘤细胞p-PD介导细胞凋亡。(一)A375细胞治疗与p-PD表示。治疗后,细胞细胞溶解蛋白质加载缓冲区(材料和方法)。30μg总蛋白质的溶解产物被加载在每个车道和免疫印迹和探测PARP的激活。细胞并不接受p-PD(0),但有0.1% DMSO作为控制(通道1、5和9)。这些墨迹图是代表三个独立的分析。β肌动蛋白作为加载所有时间点的控制。(b)和A375 B16-F10细胞治疗48小时表示大量的p-PD和受到流式细胞术分析使用膜联蛋白V-FITC化验。DAPI被用作DNA染色。

细胞凋亡也进一步证实了通过流式细胞术使用膜联蛋白V-FITC。图3 (b)58岁的节目~ 7.5和85%的凋亡B16-F10细胞和~ 8.5,57岁和60%的凋亡A375细胞治疗0时,40和100μ克/毫升p-PD分别为48小时。生活的百分比,早期和晚期凋亡细胞控制和治疗样本表3。表也包含sub-G0 / G1粒子的数量取决于流仪细胞周期分析。一个明确的相关性观察凋亡细胞数之间估计两种不同的方法。是指出B16-F10细胞比A375细胞更敏感。此外,凋亡细胞的数量证实MTT比色与活细胞的减少试验(cp数据1(一)和1 (b)与表3)。

表3
细胞凋亡的量化。

有多个实例,在治疗与细胞毒性药物,细胞被逮捕在一个特定的细胞周期阶段,然后进行细胞凋亡(31日- - - - - -33]。因此,我们也调查p-PD在细胞周期进程的作用。流仪结果表明,细胞专门处理低浓度的p-PD时间点被逮捕在年代初阶段,随着时间的推移这些块消失(数字4(一)和4 (b))。治疗浓度较高的p-PD无法显示任何此类S期被捕。这种模式的原因还不清楚。验证逮捕在S期,BrdU掺入实验使用流式细胞仪完成。数据也证实了块在A375细胞的S期处理低浓度的p-PD(图4 (b))。类似的模式也被发现在B16-F10细胞(数据未显示)。

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图4
细胞周期阻滞在S期由p-PD。(a) A375细胞的细胞周期分布处理p-PD表示是由PI染色使用流式细胞仪。在S期细胞的数量每组确定和绘制p-PD浓度表示。误差线表示SD; 。(b)流仪分析BrdU合并A375细胞治疗p-PD浓度表示。BrdU积极在S期细胞培养在粉红色的。各自的百分比细胞大门旁边的数字显示细胞集群代表细胞周期阶段。

在凋亡细胞,激活PARP可能是两条截然不同的途径,结果还存在的外在和内在,激活8和9是各自的签名34,35]。描绘的可能性,我们使用相同的细胞溶解产物准备显示PARP的激活(如图3)检查活动的存在形式的这些还用免疫印迹。有趣的是,在较短的时间点(6 - 24小时),只有半胱天冬酶被激活(图85(一个)、车道3、4和6 - 8)。激活半胱天冬酶9只的样品处理(图48小时5 (b)通道2 - 4)。众所周知,激活半胱天冬酶8可能导致激活的出价,bcl - 2家族蛋白进而造成线粒体膜启动9半胱天冬酶介导的内在途径(35]。探索这种可能性,我们有检查减少全身的细胞溶解产物用免疫印迹anti-Bid抗体。在6 - 24小时的时间点,报价没有变化(图5(一个)道1 - 8),但它逐渐减少中观察到样品处理p-PD浓度的增加(图48小时5 (b)通道1 - 4)。从这些结果很显然,外在途径被激活之前固有的p-PD治疗黑色素瘤细胞。

(一)
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图5
p-PD激活外在凋亡通路早于内在的人类黑色素瘤细胞。(一)A375细胞治疗与p-PD表示。细胞治疗6 - 24小时内与蛋白质细胞溶解加载缓冲区(材料和方法)。30μg总蛋白质的溶解产物(图中描述的一样3(一个))在每个车道和加载进行免疫印迹和探索激活半胱天冬酶3,激活半胱天冬酶8日激活半胱天冬酶9,和报价。箭头和“⧫”表明半胱天冬酶8和9半胱天冬酶的酶切片段,分别。细胞并不接受p-PD(0),但有0.1% DMSO作为控制。(b)是细胞溶解和细胞治疗48小时分析通过免疫印迹如上所述探测与抗体活性半胱天冬酶9和报价。“⧫”表明裂解碎片的半胱天冬酶9。β肌动蛋白作为加载控制面板。这些墨迹图是代表三个独立的分析。
3.4。p-PD介导细胞凋亡早期黑色素瘤细胞需要激活半胱天冬酶8

药理抑制剂还用于标识主半胱天冬酶,负责的激活细胞凋亡的起始36]。我们使用不同的半胱天冬酶抑制剂和身上进行实验评估细胞生存和凋亡p-PD治疗的反应。,细胞被孵化与半胱天冬酶抑制剂治疗p-PD 24小时和细胞生存能力是衡量MTT试验为基础。结果清楚地表明,细胞使用8半胱天冬酶抑制剂在活细胞显示显著增加( ,图6)或死细胞数量的下降( ,图6)在p-PD治疗相比细胞抑制剂(图6)。半胱天冬酶的抑制剂8的保护作用是55岁,41岁的45%,20、40、100μ克/毫升p-PD分别。很明显,这种效应的抑制剂p-PD较小的细胞治疗。虽然半胱天冬酶的抑制剂9没有保护p-PD诱导细胞死亡,还存在显著的锅抑制剂预防细胞死亡引起的高剂量的尤其是p-PD。

(一)
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(c)
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图6
半胱天冬酶8抑制剂减少死亡的A375细胞的数量。细胞与半胱天冬酶的抑制剂预处理8 (a),半胱天冬酶9 (b),锅半胱天冬酶(c)为两个小时,随后接受p-PD 24小时。可行的细胞变化百分比设置与抑制剂预处理计算中描述的材料和方法。网络保护作用( )是白色的|价值栏+黑条价值|或死亡细胞数量的减少用▲。通过传统的标准,这种差异被认为是极其显著的。 指出了双尾 值≤0.005。每组进行了一式三份。

8这种保护作用的半胱天冬酶抑制剂对细胞凋亡也验证了流式细胞仪实验膜联蛋白V阳性细胞的数量在应对p-PD(24小时内)减少了37 73%,早期和晚期凋亡,分别用8半胱天冬酶抑制剂预处理时相比,“没有抑制剂”。这些结果表明,很大程度上p-PD诱导凋亡的死亡的黑色素瘤细胞介导的激活半胱天冬酶8。

3.5。线粒体膜电位的中断

如上所示,p-PD治疗长时间导致tBid在这些细胞的形成。tBid是一个已知的破坏线粒体膜电位(MMP)。测试是否治疗中的MMP细胞经历了任何改变,流动仪测量使用JC 1比率荧光染料。而结果显示tBid形成,我们的数据表明,细胞治疗1μ克/毫升p-PD低至2小时发生了降低MMP(图7)。很明显,为了应对p-PD治疗,MMP更容易激活半胱天冬酶8或收购,因此它可能是一个治疗的直接结果。

(一)
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(b)
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图7
p-PD黑色素瘤细胞的线粒体膜电位去极化。p-PD治疗(如显示了两个小时)和未经处理的(0μg / mL)黑色素瘤细胞受到JC 1染色MMP的测量。两种细胞系,细胞集群在PE高荧光在每个点的顶部封闭的情节(红色和绿色B16-F10和A375细胞,分别地。)呈现健康的细胞群。细胞集群为PE低荧光在底部封闭的每个点阴谋的一部分(绿色和蓝色B16-F10和A375细胞,分别地)代表的细胞去极化的线粒体。细胞百分数的封闭的人口是陈述的极化p-PD线粒体的影响。一块代表实验数据显示在这里。每组进行了一式三份。
3.6。ROS生成p-PD治疗

已经证明,MMP的破坏使ROS生成(37- - - - - -39]。DCFH-DA染色用于揭示ROS的状态控制和治疗细胞。我们的流式细胞术结果显示6小时p-PD治疗ROS生成的细胞类型是微不足道的(数据没有显示)。很明显,A375细胞显示显著增加活性氧的量(图16小时后治疗8)。这一趋势仍在继续24小时处理样本(数据未显示)。细胞分离p-PD治疗小鼠肿瘤还显示大幅提高ROS水平相比,未经治疗的肿瘤(数据未显示)。


图8
p-PD治疗增加了A375细胞的活性氧水平。控制细胞和细胞治疗p-PD 16小时受到DCFH-DA污渍。流仪分析染色细胞中描述的材料和方法完成的。一组实验数据显示在这里。ROS的百分比变化计算使用表达式( )×100 / 。每组进行了一式三份。

生化实验也用于验证结果。减少的比例减少,氧化谷胱甘肽(GSSG谷胱甘肽)和增加酶的活动,如谷胱甘肽还原酶(GR)和过氧化氢酶通常用作标准细胞氧化应激的指标/ ROS。我们测量的结果表明,过氧化氢酶和GR活动增加了 %, %,分别在细胞溶解产物处理100μ克/毫升p-PD(表24小时4)。有大量减少谷胱甘肽的量( %)导致的 %减少谷胱甘肽:GSSG比p-PD细胞治疗。所有这些生化证据结合仪数据流强烈表明p-PD治疗给予强烈的氧化应激的细胞。

表4
氧化应激诱导的生化参数的变化在100年µ克/毫升p-PD A375细胞24小时。

在这一点上,我们使用NAC p-PD接触之前,谷胱甘肽(GSH)预处理验证黑色素瘤细胞的活性氧对细胞凋亡的影响。很明显从表5这些方法,特别是南汽,减少活性氧诱导的p-PD (40μg / mL)。这些方法也减少p-PD治疗细胞凋亡的程度(表5)。这个结果强烈之间建立了关联ROS生成和p-PD治疗黑色素瘤细胞的凋亡的死亡。此外,调查是否p-PD调节MMP的损耗是否依赖ROS, NAC做了类似的实验。流式细胞术分析使用JC 1确认MMP的扰动是独立于表明活性氧ROS代生产下游MMP的中断。

表5
南汽和谷胱甘肽预处理在A375细胞ROS生成和细胞凋亡。

然而,ROS增加应对p-PD不能被阻塞的激活半胱天冬酶8(数据未显示)表明这一事实刺激ROS p-PD治疗细胞发生独立的半胱天冬酶的激活8。

虽然p-PD黑色素瘤细胞的诱导凋亡的死亡与初始并发损失MMP激活半胱天冬酶8日和一代的活性氧,抑制半胱天冬酶8激活对活性氧的生产没有任何影响,封存的NAC也不能破坏MMP。然而,抑制ROS的NAC显示显著减少p-PD介导凋亡的死亡在体外(表5)。这个观察与MMP的损失发生的事实更早比ROS的感应清楚地表明,线粒体是p-PD的主要目标之一(见文本)。激活半胱天冬酶8启动后发生损失MMP的但在线粒体ROS的产生表明可能有一个角色在其激活如图所示(其他地方40]。似乎激活半胱天冬酶8和ROS的刺激发生随后通过两个独立的途径可能有积极的反馈。事实上,有报道显示类似的ROS和激活半胱天冬酶8[之间的相互作用41,42]。虽然MMP的中断发生早期低浓度的p-PD,半胱天冬酶9只观察到细胞的活化处理更高浓度的p-PD 24小时。这可以解释为引用先前的例子报道哪个州,MMP特别是小损失减少基质并不一定导致细胞色素C的释放(43,44]。在我们的例子中,p-PD作为细胞渗透还原剂的中断可能造成MMP的没有任何明显的细胞色素C的释放明显从激活半胱天冬酶9在同一时间。

4所示。结论

皮肤癌是最可怕的恶性肿瘤由于其强大的抵抗化疗。皮肤癌的发病率正在上升尤其在高加索人群中(2,3]。病死率为黑色素瘤可能是最高的,不仅在皮肤癌,而且在所有类型的癌症(45,46]。目前,高剂量白介素2(2)和最近anti-CTLA-4(细胞毒性t淋巴球抗原4)通过激活免疫系统的运作是唯一治疗导致长期无病间隔(47]。尽管几十年的系统治疗调查使用细胞毒性,免疫,分子靶向制剂,治疗晚期黑色素瘤患者的存活率是非常沮丧的48]。我们的研究首次表明,人类和小鼠黑色素瘤细胞接受ROS介导凋亡死亡与o-PD p-PD但不是对待时在体外。最重要的是,腹腔注射2和4毫克/公斤p-PD抑制的增长率B16-F10诱导小鼠黑色素瘤肿瘤(图2)。然而,长达一个月的腹膜政府高达100毫克/公斤p-PD没有任何毒性Swiss-Albino老鼠的迹象。膜联蛋白V阳性细胞的总数增加p-PD治疗肿瘤的老鼠。这个观察证实我们的在体外发现p-PD介导黑色素瘤细胞的凋亡的死亡。

综上所述,我们的观察表明,p-PD介导凋亡破坏人类和小鼠黑色素瘤细胞主要通过MMP的损失,激活半胱天冬酶8,ROS生成。我们进行的实验有更深层次的见解黑色素瘤细胞的凋亡的死亡机制p-PD和本研究创建一个平台来开发它作为一个代理,否则会成功杀死黑素瘤细胞,抵抗标准化疗。

信息披露

Debajit Bhowmick流Cytometrist的归属是斯伯丁的团队,部门的细胞和分子生物学,瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所。Nabanita Chatterjee目前附属在肿瘤学和血液学研究所,CancerCare马尼托巴省,温尼伯,MB,加拿大;温尼伯马尼托巴研究所细胞生物学,MB,加拿大;曼尼托巴大学和医学院,温尼伯,加拿大的MB。Subhadip Das目前附属在肿瘤学和血液学研究所,CancerCare马尼托巴省,温尼伯,MB,加拿大,和医学院,温尼伯,MB,加拿大曼尼托巴大学。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这个项目是由部门生物技术(印度生物技术部)11415 (BT /公关/马上回来/ 10/656/2008)和科技(DST) (SR /那么/ HS51/2008;SR / / PS81/2010),印度政府,高级研究中心(印度大学拨款委员会)、生物化学、现代生物学中心(UPE / UGC),和CRNN,加尔各答大学。Debajit Bhowmick和Rajarshi Chakrabarti,分别由大学提供的奖学金拨款委员会和科学与工业研究理事会,印度。