文摘
每年有超过200000例浸润性乳腺癌诊断;除草剂污染当地水源可能导致这些癌症的发展。G蛋白耦合受体GPR30,被确认为一个潜在的孤儿受体可能与三嗪除草剂阿特拉津等农业实践中最常利用chlorotriazines之一在美国。我们的目标是确定chlorotriazines GPR30的表达的影响。两个乳腺癌细胞株mda - mb - 231和MCF-7,以及一个正常乳腺细胞,MCF-10A,服用100倍的阿特拉津,氰草津、或西玛津,水平在EPA侧面安全水平为每个化合物。使用实时PCR,我们评估GPR30 mRNA GAPDH控制相比的变化。我们的研究结果表明,GPR30表达增加乳腺癌细胞水平低于美国环保局饮用水污染限制。在这个治疗,细胞的生存能力是不变的。相比之下,治疗chlorotriazines减少GPR30在非癌变MCF-10A细胞的表达。因此,我们的研究结果表明,细胞环境和潜在的转移可能发挥作用在GPR30农药接触反应的程度。
1。介绍
每年超过11亿磅的杀虫剂使用在美国,占世界人口总数的百分之二十五的使用(1]。这些环境的化学物质可能会有可怕的后果在组织发展如果带接触一些激素依赖性乳癌和卵巢癌等组织,这吸引了极大的关注作为一个每八个美国妇女诊断出患有某种形式的乳腺癌[2]。三嗪暴露与卵巢癌的发病率密切相关(3]。阿特拉津也导致小鼠乳腺肿瘤(4]。氰草津被认为是中等毒性显示细胞生存能力下降和产妇体重和可以导致抑郁症5]。西玛津被认为是无毒,尽管这是一个人类肺细胞诱变剂,导致乳腺肿瘤和甲状腺组织的老鼠,兔子和出生体重降低,同时增加fetotoxicity [6,7]。
通过rt - pcr分析,Albanito et al。3)表明,过量的基因,最终导致癌症的扩散是调节卵巢细胞系在接触莠去津。更重要的是,他们发现,这些基因调节癌乳腺癌细胞缺乏古典雌激素受体ERα和ERβ(8),这表明一个潜在的孤儿受体能够绑定到阿特拉津和引起细胞内的变化。膜结合G蛋白耦合的受体GPR30,被认为是一个模雌激素受体和潜在受体三嗪(9];它能够通过多种细胞通路包括诱导基因转录增加钙和营10]。
在MCF-7 GPR30存在细胞的一项研究显示通过荧光标记的雌激素受体定位在内质网衍生品(11]。变动等人表明,癌乳腺癌细胞株mda - mb - 231表达低水平的GPR30 [12,13]。Upregulation雌激素依赖的基因一直在观察这些细胞通过MAP激酶通路的感应GPR30绑定(14]。Cronan et al。15]发现六七MAP3-kinases他们测试调节肿瘤的生长和转移中mda - mb - 231细胞,暗示GPR30的存在(10]。最近的研究表明,尽管MCF-10A细胞可能缺乏或非常低水平的经典,他们通过GPR30[表达和调节基因的表达16,17]。
而不是集中在estrogen-based GPR30的激活,在这项研究中,我们介绍了可能改变GPR30基因表达通过接触三嗪类除草剂在两癌乳腺癌细胞系和一个正常乳腺细胞线。MCF-10A非癌变和MCF-7 mda - mb - 231癌症细胞系是处理三种不同浓度的阿特拉津,氰草津、和西玛津,侧翼水平被认为是安全的饮用水由美国环境保护署(EPA)。我们的假设是GPR30表达式将增加除草剂作为受体的配体,因此移植自己的表情。然而,我们期望看到离散细胞系和期望的差异,这些差异可能允许非癌变细胞之间的明确分离和转移的能力。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和维护
细胞系都从安博士的实验室获得Nardulli(厄巴纳伊利诺斯大学香槟分校,IL),亚文化从股市获得来自写明ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)。人类上皮腺癌mda - mb - 231细胞在DMEM / F-12媒体补充10%胎牛血清和抗生素(青霉素50国际单位/毫升、50μg / mL链霉素,5μg / mL硫酸庆大霉素)37°C湿润,5%的公司2环境。MCF-7人类上皮腺癌细胞保持在修改鹰的媒体补充5%小牛血清和抗生素,同时化验进行维护媒体或减少介质含有苯酚red-free修改鹰的媒体,并配以木炭dextran-stripped 5%牛血清和抗生素。MCF-10A细胞在DMEM / F-12媒体补充5%马血清,兆补充,和0.1μ克/毫升霍乱毒素。
2.2。细胞生存能力
MCF-7和mda - mb - 231细胞被播种到96孔板在维护媒体(MCF-7和mda - mb - 231)或减少媒体(MCF-7)。电镀后24小时,媒体被替换为维护(MCF-7和mda - mb - 231)或减少(MCF-7)包含阿特拉津的媒体,西玛津,或在0.1 -氰草津,1 -,10倍环保署安全水平(表1)或DMSO控制。添加了阿特拉津为0.3,3.0,或30磅(μg / L;-64 - 0.64μ米),添加了氰草津为0.1,1.0,-17年或10磅(0.17μ米),西玛津添加为0.4,4.0,-92年或40磅(0.92μ米),24小时后,3μg刃天青添加和允许孵化前三个小时阅读吸光度在570和595海里iMark微型板块吸光度读者(Bio-Rad大力神,CA)。我们进行了单变量方差分析(方差分析)使用SPSS (IBM SPSS统计,IBM公司,阿蒙克,纽约)。
2.3。GPR30表达分析
在治疗之前,细胞被播种到12-well板块在各自维护媒体。电镀后24小时,媒体被替换为维护媒体包含阿特拉津,西玛津,或在0.1 -氰草津,1 -,10倍环保署安全水平(表1),或DMSO控制。24小时后,RNA是收获使用RNAzol(分子研究中心,Inc .,辛辛那提,哦)/制造商的建议。与DNase提取核苷酸治疗,互补脱氧核糖核酸合成使用rt - pcr和随机引物使用GoScript逆转录酶(Promega,麦迪逊,WI)根据制造商的建议。
实时PCR是一式三份40周期使用Bio-Rad iCycler智商(Bio-Rad大力神,CA)。GAPDH基因被用作参考。GAPDH(现成的引物序列,IDT DNA技术,珊瑚镇,IA)和GPR30引物18]从IDT DNA技术获得了实时PCR(珊瑚镇,IA)以下序列:GAPDH转发:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,GAPDH逆转:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,GPR30转发:5′-AGTCGGATGTGAGGTTCAG-3′,GPR30逆转:5′-TCTGTGTGAGGAGTGCAAG-3′。ΔCt值减去计算控制基因扩增循环GPR30的扩增循环在每个治疗。计算ΔΔCtΔCt值控制治疗(DMSO)减去从每个实验治疗。褶皱变化是计算使用2ΔΔct [19]。我们进行了单变量方差分析(方差分析)使用SPSS (IBM SPSS统计,IBM公司,阿蒙克,纽约)。
3所示。结果
以确保治疗农药没有造成戏剧性的变化在细胞生存能力,我们对待MCF-7乳腺癌细胞和3种不同浓度的阿特拉津、氰草津、西玛津。浓度选择在最大污染水平饮用水由美国环境保护署(表1)。
细胞生存能力是衡量使用刃天青,减少到resorufin新陈代谢的活跃细胞(20.]。我们维护MCF-7细胞减少介质消除激素治疗效果和阿特拉津、氰草津,或在0.1 -西玛津,1 -,或者10倍环保局饮用水24小时安全水平。我们观察到没有统计上的不同的变化在细胞生存能力的阿特拉津和氰草津相比只有微小差别(图0.1 x西玛津的DMSO控制1(一))。作为媒体可以诱导细胞应力最小,我们重复使用MEM与牛血清的可行性分析。与减少媒介,我们注意到无统计差异在任何浓度的可行性三个三嗪(图1 (b))。因此,我们继续丰富维护媒介的其余部分我们的研究。
(一)
(b)
评估的能力chlorotriazines诱导GPR30 mRNA表达的变化,然后我们对待MCF-7细胞相同的3种不同浓度的阿特拉津、氰草津,西玛津。信使rna是收获和利用合成cDNA,然后有选择地放大使用特定GPR30使用以前公布的引物,引物Girgert et al。18)或一个基因控制,GAPDH。管家基因,GAPDH水平波动不应该在治疗农药。
阿特拉津治疗导致GPR30的表达的改变。在最低浓度,我们观察到适度增长了1.8倍和DMSO溶液治疗控制相比,在环保局安全水平增加(图2.7倍2)。然而,在高水平的浓度,倒在了未经处理的水平。虽然我们无法识别为氰草津任何有统计学意义的变化,观察趋势增加,2-3-fold增加在所有三个浓度表达式。虽然没有统计学意义,增长了3.1倍0.1 x走近意义()。西玛津治疗没有效果在较低水平;然而GPR30表达当时统计高10倍浓度(增加2.0倍)。
识别这些变化是否与三嗪治疗癌细胞的属性,我们分析GPR30表达式在另一个乳腺癌细胞系,mda - mb - 231,以及非癌变MCF-10A细胞系。观察图3mda - mb - 231细胞,治疗农药也导致温和,GPR30表达的1.5 - 2倍增加,尽管这些MCF-7细胞中观察到的模式略有不同。我们发现在GPR30表达显著增加EPA阿特拉津的安全水平,但不是在浓度高于或低于这一水平。相比之下,观察氰草津最低浓度的增加,和趋势增加1 x和10倍的浓度,与10 x接近意义()。西玛津,在0.1倍浓度增加观察,而1 x的浓度导致统计降低了GPR30的水平。
我们确定了最显著的差别,然而,在非癌变MCF-10A细胞。癌细胞形成鲜明对比,我们发现显著降低GPR30表达式(图4)。对阿特拉津,表达下降的趋势是,低于0.5倍的表情,几乎是统计学意义(0.084,0.1倍和1倍的浓度,分别地)。氰草津暴露也导致减少GPR30在0.1倍和1倍浓度表达式。西玛津治疗显著降低GPR30表达式只在0.6倍浓度最低,虽然浓度越高表明表达减少的迹象。
4所示。讨论
GPR30已被确定在各种组织,其中许多是ERα艾滋病患者,回顾了(10,21]。有相互矛盾的证据关于GPR30的能力与17β雌二醇;虽然有几个基因表达改变的报告通过雌激素GPR30[的交互22,23),其他报告阿特拉津的失败来绑定(24,25]。其他报告,更高水平的雌激素和抗雌激素必须利用非法响应(26]。相反,直接调节GPR30 ER表达MCF-7细胞(27,28]。
我们最初担心富人介质用于我们的初步研究可能会影响基因表达,由于GPR30的报道能够代替开车的雌激素受体基因表达(12,27,29日),酚红的培养基也可能产生反应(30.]。然而,最近的研究已经证实,酚红在当前维护媒体的数量不足够高的刺激过量基因表达(31日]。缺乏区别对待MCF-7细胞中细胞生长在降低介质(无激素和缺乏酚红)和维护介质(含血清和酚红)表明,正在执行的检测不依赖于任何求偶性的三嗪(图1)。这是符合我们之前的工作检查的可行性MCF-7和mda - mb - 231细胞治疗后四个除草剂水平略高于那些被视为安全的日常消费由美国环保署(32]。我们当前的研究检查水平,这项工作重叠,但看起来在一个较短的治疗时间48小时(24)。如果阿特拉津、氰草津和西玛津通过雌激素通路在我们的研究中,我们会预期的增加细胞生存能力即使在24小时的治疗,特别是降低介质(细胞内进行33,34]。事实上,最近的工作由de la Casa-Resino和Albanito康纳等人证实了早期的研究,chlorotriazine化合物不绑定和激活基因表达直接通过经典雌激素受体(35- - - - - -37]。结合以前的报道,这个改变生长和细胞反应MCF-7细胞在剥夺介质(38,39),支持我们的未来与我们的研究更丰富的媒介,提升细胞更强劲的增长。
尽管三嗪类除草剂使用的水平和我们以前的工作没有改变细胞生长,它也没有影响细胞迁移(32,40),我们想确定基因与chlorotriazine暴露GPR30发生变化。事实上,在检查GPR30的表达水平,提出了这些受体化合物,我们做了观察离散差异表达依赖于细胞环境。虽然水平GPR30在非癌变MCF-10A减少细胞暴露在低水平的阿特拉津,氰草津,西玛津(图4),我们看到癌症细胞系之间的显著差别。mda - mb - 231和MCF-7细胞,我们观察到一个增加,虽然GPR30的表情温和,在相同的浓度(数字2和3)。有趣的是,它提出了一个角色GPR30的对抗ER的增长α阳性的乳腺癌细胞,如MCF-7细胞系,但支持经济增长的er阴性肿瘤(27,41]。这可能是通过GPR30的能力限制ER活动(42]。
尽管GPR30表达式在蚀变三嗪治疗,我们会疏忽把这些变化仅仅单独使用这些杀虫剂与GPR30的可能的交互。Albanito等人表明,阿特拉津可以直接绑定到GPR30激活Erk的磷酸化和基因表达3,36]。然而,GPR30的改变表现在我们的研究可能是也可能不是由于这些化合物与GPR30本身的直接交互。GPR30可以通过一些配体如调节EGF, igf - 1和VEGF (28,43,44)和可能被孕激素激活(45,46]。GPR30也已被证明能够激活c-Fos / AP1通路,反过来,这些trans-acting因素上调GPR30 [29日,47- - - - - -49]。
我们相信,我们能观察到的差异可能在GPR30的监管,三嗪可能暗示细胞的转移状态。阿特拉津的能力特别是导致基因调控变化也与以前一致xenoestrogens的观察能力,特别是chlorotriazines [23,50),虽然氰草津和西玛津的角色不如阿特拉津深入研究。我们之前的研究没有说明增长率的变化,当我们利用阿特拉津,氰草津,西玛津的水平远远超过饮用水中EPA安全水平(32]。同样地,当评估人工伤口诱导后的反应能力,MCF-7细胞显示没有变化的DMSO控制接触印迹聚合时,只有不到40%再生超过72小时(40];这是与雌二醇,刺激再生和迁移的影响。mda - mb - 231细胞表现出最初的再生速度低于控制,而MCF-10A细胞再生完全在同一时间间隔不管使用的治疗(激素或杀虫剂)。这个数据与相关检测原发性肿瘤,在GPR30超表达是在高档和激进的乳腺癌和卵巢癌26,51- - - - - -53]。激活GPR30触发细胞内的信号级联,导致增加水平的营地和激活蛋白激酶(22,23,54),以及激活Erk (8]。在几项研究已经显示Erk的活化导致转移从G1 S期,从而导致细胞分裂(55,56]。这些途径激活可能允许乳腺癌的进展(57- - - - - -59),这已经被Vivacqua直接建议et al。44]GPR30的过度积极的发展在estrogen-dependent乳腺癌表型。
将这些结果与我们当前的研究背景,我们看到,GPR30的差别是对这些在MCF-10A可能保护三嗪曝光后,与正常生长模式关联,无法应对进一步农药接触通过营地的途径。这是一个路径通常利用类固醇激素,自己表达下调受体的化合物(60- - - - - -63年限制细胞反应。然而,转移性细胞,通过upregulation GPR30,看到一个转变的细胞再生能力。我们可能期望的upregulation GPR30允许cAMP-induced“刹车”放在Erk通路,从而迫使细胞依靠感应的MAP激酶途径进一步发展(14]。因此,虽然有冲突的报道,chlorotriazine除草剂的毒性4),潜在的损害可能依赖于现有的细胞环境。
5。结论
三嗪治疗并没有改变在MCF-7细胞细胞生存能力;然而,我们观察到upregulation GPR30的mRNA。这种upregulation模式也发生癌变的mda - mb - 231细胞而不是良性乳腺癌细胞系MCF-10A。因此,转移细胞株可能发挥作用的潜在能力的细胞调节的GPR30成绩单时产生细胞暴露于环境配体。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者感谢Ann m . Nardulli博士和女士伊冯·s·齐格勒(伊利诺斯)乳腺癌细胞系和文化的建议,特拉维斯博士Wilcoxen(μ)统计的建议,和詹姆斯Mangis技术支持。这项研究支持Millikin大学霍华德·l·格雷维特赋予椅子(珍妮弗·r·施罗德),Brohard癌症研究基金会,Millikin大学生物学系。