文摘
相互作用的纳米粒子与凝血是重要的之前,他们使用的药物载体或治疗药物。本工作的目的是研究的主要影响二氧化硅纳米颗粒(SiNPs)止血法在体外。我们SiNPs效果研究的直接评估凝血酶原的激活凝血因子X和验证SiNPs对人体血小板的任何可能的影响。结果表明:SiNPs缩短凝固时间APTT、PT测试和增加引起的激活因子X RVV可能是因为内在途径因素对其表面的吸附。SiNPs抑制ADP诱导的血小板丰富的等离子体聚合,但在同一时间部分激活血小板,因为它展示了使用流式细胞仪。SiNPs使用的可能性纳米是强烈依赖于他们最后在血液中浓度和颗粒的大小。然而SiNPs非常有前途的作为防止失血后的止血剂代理损失。
1。介绍
凝血系统可以与纳米粒子的相互作用,有利或不利取决于纳米材料的用途。纳米颗粒可以被设计为促凝血的抗凝剂或携带药物干预其他病理条件凝固问题[1]。使用纳米粒子作为药物载体是极有前途的,是为世界各地的科学家们感兴趣的2,3]。纳米粒子可以作为抑菌剂(4]。二氧化硅纳米粒子(SiNPs)已被证明是一个有前途的替代为生物医学应用(5)作为一个小说在肿瘤研究向量或肿瘤代理人交付6,7),和作为抗癌药物的载体8,9]。使用SiNPs生物工程生物相容性的研究包括细胞毒性(10],免疫毒性[11,基因毒性效应(12)是至关重要的。本研究的目的是评估的主要影响SiNPs止血法在体外。
2。材料和方法
2.1。材料
2.1.1。化学物质
显色底物S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA)和S2236 (p-Glu-Pro-Arg-pNa)从BIOPHEN,购买和APTT-reagent是从Renam(俄罗斯)。Ecamulin纯化从Echis multisquamatis毒液被Korolova博士请捐赠。因子X从蝰蛇的毒液活化剂(RVV)和ADP买来σ(美国)。
2.1.2。硅纳米颗粒
架A300型非晶硅纳米颗粒(SiNPs) (Kalush、乌克兰)在400°C预处理2小时。由此产生的材料表面的平均空间为大约300米2/ g和粒子的大小范围从10到40 nm (13]。
2.2。方法
2.2.1。富血小板血浆(PRP)和血浆准备
静脉血液的健康志愿者没有采取任何药物治疗7天收集到38 g / l柠檬酸钠(9份血液1份柠檬酸钠)。PRP被离心分离的血液在160 g 20分钟23°C。可怜血小板血浆的制备PRP在1500 rpm spinned-down在30分钟(14]。
2.2.2。激活局部血栓形成质时间
激活局部血栓形成质时间(APTT)根据下列程序执行。0 1毫升血浆混合相同体积的APTT-reagent和孵化在3分钟37°C。的凝固是由添加0,1毫升的0.025米CaCl的解决方案2。凝血时间由凝血计监测太阳能# - 2410(白俄罗斯)15]。
2.2.3。酰胺酶活力测定
显色底物的水解(S2238、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA S2765, Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA)的影响下硅纳米颗粒(SiNPs)研究了使用读者(热电电子),E405-E492。分析在0.05 Tris-HCl缓冲区的pH值7.4解决方案,37°С。显色底物被在最后30 mM的浓度。SiNPs的最终浓度为0.4毫克/毫升(16]。
2.2.4。纤维蛋白原浓度研究
血浆中纤维蛋白原浓度决定了修改后的分光光度法。血浆(0.2毫升)和PBS(1 7毫升)在玻璃管中混合。凝固是由添加0.1毫升的类似酶的毒液蝮蛇halys(1 NIH /毫升),允许避免纤维蛋白交联(17]。混合物是孵化在30分钟37°C。纤维蛋白凝块取出来解决5毫升的1 5%醋酸。蛋白质的浓度用分光光度计测量sf - 2000(俄罗斯)在280海里()。
2.2.5。血小板聚集的研究
血小板聚集是基于测量浊度的变化血小板丰富的人血浆(18]。在典型的实验0.4毫升富血小板血浆与0.02毫升的0.025米CaCl孵化2和ADP最终浓度12.5μ米在37°C。研究了浓度SiNPs 0001和0,1毫克/毫升。聚合使用太阳能AP2110凝集计检测到10分钟。
2.2.6款。流式细胞术
孵化后的形状和造粒血小板与硅纳米颗粒(SiNPs)与血小板激活凝血酶监测在库尔特史诗XL流式细胞分析仪(19]。SiNPs(0, 1毫克/毫升)被加入1毫升的洗涤血小板悬液和样本孵化在90分钟25°С。散射和透射光监测检查血小板造粒和形状的任何更改。
2.2.7。统计数据分析
使用Microsoft Excel统计数据分析。所有化验进行一系列三个复制和数据配备标准的错误使用“Statistica 7。”
3所示。结果
3.1。蛋白质的凝固与SiNPs系统
无定形二氧化硅纳米颗粒(SiNPs)沉淀在PBS的最终浓度原液2毫克/毫升。所有样品使用涡SiNPs涨跌互现前颞。
基本凝固进行了测试APTT、PT的SiNPs悬挂在最后浓度0.2和0.4毫克/毫升。结果表明:SiNPs明显缩短凝固时间在测试浓度依赖方式(图1)。效果更明显比APTT PT。
(一)
(b)
特定的显色底物凝血酶原(S2238)和因子Xa (S2765)被用来避免纤维蛋白原吸附的影响通过SiNPs测试的结果。
我们研究了SiNPs对凝血的影响直接评估凝血酶原的激活和x因子凝血酶原被激活的凝血酶原激活剂Echis multisquamatis毒液(ecamulin)。由此产生的凝血酶活性检测到thrombin-specific显色底物S2238。结果表明:SiNPs在0.4毫克/毫升浓度并不影响的直接活化凝血酶原(图2(一个))。
(一)
(b)
直接由RVV [X因子被激活20.),活动激活因子与特定的显色底物S2765 Xa估计。结果表明,0.4毫克/毫升的SiNPs抑制因子X激活(图2 (b))。
因此我们观察到抑制SiNPs对凝血的影响,包括延长凝结时间由血栓形成质和APTT-reagent以及减少的因素Xa但不是凝血酶原的激活。
3.2。血小板聚集和激活
ADP诱导血小板聚集在PRP研究存在缺乏SiNPs最终浓度0.001和0.01毫克/毫升。结果表明,这些SiNPs浓度抑制率和血小板聚集(图的速度3)。0.001毫克/毫升的SiNPs两次聚合速率下降,引发了巨大的血小板解集。这些影响更明显当0.01毫克/毫升的SiNPs。
众所周知,纤维蛋白原参加彼此吸引血小板聚集的血小板和新形成的凝块。这就是为什么我们检查了SiNPs吸附纤维蛋白原的能力。结果表明,1毫克的SiNPs吸附0.325毫克的血浆纤维蛋白原。因此我们可以假设的纤维蛋白原吸附SiNPs 0.001和0.01毫克/毫升的浓度不能抑制血小板聚集的血浆纤维蛋白原。
血小板聚集的抑制作用可以解释为研究代理的作用在细胞内信号或/和绑定的纤维蛋白原与血小板受体IIbIIIa [21]。所以我们必须检查是否SiNPs可以抑制血小板激活。为这一目标激活凝血酶诱导的血小板使用流式细胞仪监测。血小板的形状和粒度直接和正交试验研究了光散射(18]。
来验证任何可能SiNPs人类血小板的影响,分析了PRP流式细胞术。休息人类血小板(a)和0.001毫克/毫升的孵化SiNPs (b)或0.01毫克/毫升的SiNPs (d)在5分钟。结果表明,静止血小板减少的人口%控制样本(a)%,% 0.001毫克/毫升的样品SiNPs (b)或0.01毫克/毫升的SiNPs (d),分别为(图4)。相比之下,活化的血小板凝血酶(c)导致戏剧性的变化血小板形态和粒度。因此,我们得出结论,SiNPs能够引起轻微的形状和粒度的变化没有引起血小板聚集的血小板,但可能影响ADP引起的血小板聚集。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
相互作用的硅凝血蛋白研究区。之前它是表明硅活动取决于粒径之间的几何关系,由硅和蛋白质分子(22]。在硅胶表面吸附蛋白质的构象在调节过程中发挥作用的功能和手机绑定23]。结果表明:SiNPs有效吸附纤连蛋白,纤维蛋白原,等等。也因此SiNPs调节细胞粘附过程通过吸收粘附分子(24),也通过直接整合在血细胞(25]。据报道,SiNPs渗透血小板质膜和刺激快速和长时间没有释放,IIbIIIa激活,最后血小板聚集(25]。
在我们的研究中,我们显示二氧化硅的促凝血的影响在一些研究报告和在战斗中使用纱布发展(26,27)引起的作用主要是通过SiNPs因素Xa激活。我们之前发现报道在28]表明,这种激活时不发生内在的凝血因子(即十二和XI)被孵化的体积。该数据对应的结果,证明表面吸附的因素十二SiNPs强烈依赖于粒子的大小(29日,30.]。然而,我们的实验显示,直接混凝剂作用SiNPs未激活的血浆或血小板聚集SiNPs的激活作用。尽管如此,研究SiNPs能够改变休息的形状和粒度血小板通过流式细胞术研究与其他科学家的数据证明公司的SiNPs活细胞(25]。我们可以假定小SiNPs从研究样本(10 nm)纳入细胞,激活他们(因为它显示了Corbalan et al。25)),但更大的纳米颗粒(40海里),也存在于样品抑制血小板聚集通过吸收纤维蛋白原(23,24)足够的血小板聚合(21]。
我们的研究结果也与最近获得的结果在活的有机体内SiNPs模型管理系统激活的凝血级联和血小板(显示30.,31日]。
5。结论
无定形SiNPs能够增加凝血级联的活化吸附和刺激的内在途径凝固的因素。这种效应导致缩短凝固时间的APTT、PT测试,以及增加的因子X激活血浆RVV,但与删除示例因素第十一和第十二。SiNPs没有PRP诱导血小板聚集,但改变了休息的形状和粒度和抑制血小板聚集。SiNPs使用的可能性纳米是强烈依赖于他们最后在血液中浓度和颗粒的大小。然而,SiNPs非常有前途的止血剂防止失血后的伤害。
缩写
| SiNPs: | 硅纳米颗粒 |
| RVV: | 罗素vipera毒液 |
| PRP: | 富血小板血浆 |
| APTT: | 激活局部血栓形成质时间 |
| PT: | 凝血酶原时间。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。