突触前神经毒性的蛋白质标记BmjeTX-I和BmjeTX-II毒素活性具窍蝮蛇属marajoensis(Marajo地区)蛇毒

文摘

神经肌肉准备接触b . marajoensis毒液显示频率的增加微型终极势紧张抽动便利化其次是突触前神经肌肉麻痹,没有肌肉损伤的证据。考虑到突触前干涉机械参与神经递质释放毒素(synaptophysin、synaptobrevin SNAP25蛋白质),这种通信的主要目的是分析,通过免疫荧光和免疫印迹,突触蛋白的表达,synaptophysin, synaptobrevin,和SNAP25 myography,光,透射电子显微镜的病理运动神经终端和骨骼肌纤维的小鸡二腹肌cervicis准备(CBC)暴露出来在体外BmjeTX-I和BmjeTX-II毒素b . marajoensis毒液。CBC孵化与毒素显示不可逆转的抽动张力封锁和氯化钾和ACh-evoked挛缩,影响和乙酰胆碱受体的积极colabelling确认他们的行动主要是运动神经终端。Hypercontraction和宽松的作用和突触泡消耗和运动神经损伤表明,毒素myotoxic和毒害神经的显示效果。synaptophysin封锁造成干扰,synaptobrevin, SNAP25蛋白质导致的结论是,BmjeTX-I和BmjeTX-II影响神经递质释放机械通过阻止突触囊泡的对接的轴膜神经终端。

1。介绍

在巴西,造成的事故具窍蝮蛇属蛇是接近74%根据国家系统事故的通知(斯楠)1];他们在巴西构成一个主要公共卫生问题。伟大的一部分,这些事故发生在偏远乡村地区远离适当的急救干预(2]。一般来说,表面变质图片的特征是明显肌坏死(3- - - - - -5]和系统性作用[6]。这种效应源于蛋白水解,myotoxic、凝血和出血性活动归因于磷脂酶A₂包含在他们的毒液。一个占主导地位的影响具窍蝮蛇属毒蛇咬伤事故被标记myotoxicity没有任何临床神经毒性的迹象。然而,在体外研究两栖动物、鸟类和哺乳动物的肌肉紧张准备显示神经毒性,总和/或不可逆的神经肌肉封锁,在非常低浓度的毒液7,8[]或毒素8- - - - - -10从不同的物种。因此,很可能直接行动的磷脂酶₂(中国人民解放军₂)myotoxins加上间接作用引起的组织缺氧的影响的关键角色具窍蝮蛇属毒液对肌肉和神经纤维,包括立即销毁电机轴突和完全消耗肌肉的运动神经的树干(11]。

巴西的物种具窍蝮蛇属属接近50。地理上,同一物种可以被分布在全国各地,而另外一些流行,例如,具窍蝮蛇属marajoensis,只存在于Marajo岛的帕拉州,在巴西北部[12,13)(图1)。

通知事故与b . marajoensis是罕见的;第一次的孩子咬伤出血性中风的风险b . marajoensisAnajas市Marajo岛,是最近报道;受害人所遭受的永久偏瘫后遗症是归因于推迟医疗干预14]。同时,事故发生的标本被囚禁一些右手拇指蛇的看守Butantan研究所;咬立即产生极度的痛苦和水肿,迅速传播她的手和前臂的一部分导致瘀斑和水泡形成。强烈的疼痛和悸动持续48小时尽管快速医疗在医院至关重要的巴西(Silvia卡多佐博士个人通信,西班牙Butantan)。

小鸡的神经肌肉准备二腹肌cervicis (CBC)和鼠标膈nerve-diaphragm (PND),浓度低至1 - 5所示μ克/毫升b . marajoensis粗毒液引起频率的增加微型终极势(MEPPs)发生与抽搐张力便利化其次是突触前神经肌肉麻痹,但没有证据的肌肉损伤(15]。

三个基本Asp-49磷脂酶A₂(中国人民解放军₂)已经被隔绝b . marajoensis毒液:Bmaj-9 (13679.33 Da) (16),BmjeTX-I (13808.89 Da)和BmjeTX-II (13863.97 Da)解放军₂年代(17),是显示在CBC presynaptically准备。在适当的浓度,BmjeTX-I和BmjeTX-II诱导在突触前神经肌肉接点封锁网站没有响应引起的肌肉和肌坏死与系统性的白细胞介素- 6的反应,适度的爪子,和细胞毒性小鼠骨骼肌C2C12成肌细胞和肌管17]。

毒的毒素作用于突触前网站干预在蛋白质的复杂的机械,如synaptophysin synaptobrevin, SNAP25,进行特定的角色在神经递质释放的精确的步骤。Synaptophysin不可或缺的突触囊泡的蛋白,结合synaptobrevin并可能阻止轴膜的囊泡对接终端;SNAP25是等离子体膜蛋白(t-SNARE),这与synaptobrevin形成一个稳定的复杂泡对接,负责启动和融合17]。改变在这个复杂的可以影响神经递质释放和诱导presynaptic-blocking效应。

在这个沟通我们描述我们的观察细胞病理学的运动神经终端和骨骼肌纤维暴露在体外两个主要毒素孤立的毒液b . marajoensis。我们的假设是BmjeTX-I BmjeTX-II影响神经递质释放机械通过阻止突触囊泡的对接的轴膜神经终端。

2。材料和方法

2.1。动物

男性HY-line W36小鸡(4-8-day-old)是由环球鸟类Agrovicultura Ltda(巴西坎皮纳斯,SP)。动物被安置在25°C下12 h光/暗周期与免费的食物和水。机构伦理委员会批准的所有程序都在动物使用(CEUA /圣弗朗西斯科大学协议000.11.10数量),并按照巴西社会实验室动物科学(SBCAL / COBEA)的指导方针。

2.2。毒素和试剂

BmjeTX-I BmjeTX-II隔绝B。marajoensis蛇的毒液纯化详细描述了Ponce-Soto et al。17]。

所有试剂都是来自Sigma-Aldrich(美国密苏里州)如果没有否则。兔子anti-glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH-FL335)从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国);OCT-Tissue Tek樱花Finetek。EPON嵌入- 812设备,醋酸双氧铀,四氧化锇,柠檬酸铅,戊二醛从电子显微镜科学(美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德)。免疫印迹试剂购自Sigma-Aldrich, Biorad Amresco,柯达。所有生理盐溶液的分析或排序等级。

2.3。小鸡二腹肌Cervicis (CBC)准备

小鸡()立即被吸入氟烷和二腹肌cervicis肌肉被移除和安装在一个紧张的1 g 5毫升器官含柠檬酸的解决方案(4.7 118.7作文mM:氯化钠,氯化钾,CaCl₂1.88,KH₂阿宝₄1.17,MgSO₄1.17,NaHCO₃25日,和葡萄糖11.65),pH值7.5在37°C, carbogen曝气(95% / 5%₂/公司₂,v / v) [18]抽动张力录音。准备被允许稳定至少20分钟前添加一个BmjeTX-I浓度或BmjeTX-II解放军₂毒素(10μg / mL)。这种浓度Ponce-Soto等所使用的是相同的。17]。

双极电极铂环被周围的肌肉和耦合到一个草S48刺激器(0.1赫兹,0.2毫秒时间,4 - 8 V)。等长肌肉收缩和挛缩记录通过力位移传感器(负载细胞BG-50克,Kulite半导体产品,Inc .)耦合到一个physiograph(古尔德模型RS 3400)。挛缩外生乙酰胆碱(哦,110μM)和氯化钾(氯化钾,40毫米)在缺乏领域得到刺激毒素加法和年底之前实验(120分钟)。

2.4。通过光学显微镜形态分析

纵向cryosections CBC (),维护在carbogen-aerated克雷布斯(控制)或孵化10的解决方案μg / mL BmjeTX-I或BmjeTX-II 120分钟在间接的刺激下,收集到一定不好过玻璃幻灯片,permeabilized在乙醇和甲醇(−20°C, 10分钟每个浴),用蒸馏水冲洗,苏木精和伊红染色(他)组织学分析。

2.5。透射电子显微镜(TEM)的形态学分析

样本包含终极地区CBC (),在充气克雷布斯维护解决方案(控制)或孵化10μg / mL BmjeTX-I或间接刺激下BmjeTX-II 120分钟,是并排固定在轻微的纵向张力下蜡,30分钟immersion-fixed Karnovsky的解决方案在室温和一夜之间在4°C。在0.1之后,样品被洗甲次砷酸盐钠缓冲,你找找OsO在1%₄解决方案2 h,洗在同一个缓冲区其次是蒸馏水,与5%的醋酸双氧铀1 h,在蒸馏水洗,脱水丙酮系列,嵌入在环氧树脂树脂(环氧树脂:丙酮2:1,1:1,和1:2和纯环氧树脂)。超薄部分(60 nm厚)沾醋酸铀酰柠檬酸铅紧随其后906年狮子座透射电子显微镜检查(蔡司、从、德国)。肌肉纤维的超微结构和神经肌肉突触囊泡的形态测量学。

2.6。免疫荧光(如果)分析

横向cryosections CBC (动物),维护在carbogen-aerated克雷布斯(控制)或孵化10的解决方案μg / mL BmjeTX-I或BmjeTX-II 120分钟在间接的刺激下,收集到一定不好过玻璃幻灯片,permeabilized在乙醇和甲醇(−20°C,每10分钟),特里同x - 100和0.1%磷酸缓冲盐(PBS)(15分钟,房间温度)和PBS冲洗,在潮湿的孵化室在4°C与适当的初级抗体(稀释的最终浓度synaptophysin 1/150, 1/250 SNAP25,和1/300 synaptobrevin)。控制免疫反应是由省略主要抗体。第二天,幻灯片被允许回到室温,在PBS洗,孵化与适当的FITC-conjugated二级抗体(山羊anti-rabbit 1/80,兔抗体1/800,山羊anti-mouse 1/100)或TRITC-conjugatedα-BgTX(半二次抗体浓度稀释)在室温下2 h,然后安装在甘油果冻。积极的访问immunolabelling,使用荧光BX51TF显微镜(奥林巴斯光学有限公司,东京,日本),从6串行部分和积极的反应是用于统计计算(形态测量学)。

2.7。西方墨点法(WB)

CBC肌肉紧张准备(),维护在carbogen-aerated克雷布斯(控制)或孵化10的解决方案μg / mL BmjeTX-I或间接刺激下BmjeTX-II 120分钟,在1毫升的均质antiprotease鸡尾酒。整除的15μg蛋白用于12%钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(120 V, 90分钟)。后电泳蛋白质转移到硝酸纤维素(400毫安,90分钟),样品在一夜之间被封锁在PBS含有5% 4°C w / v奶粉和探测主要抗体(在PBS稀释含3% w / v奶粉的最终浓度synaptophysin 1/500, 1/500 synaptobrevin,和1/1000 SNAP25) 4 h。墨迹洗在PBS和孵化相应HRP-conjugated二级抗体在PBS稀释含1% w / v奶粉最终浓度的1/1000山羊anti-rabbit, 1: 5000年兔anti-mouse,和1:3000兔抗体,分别。

这些墨迹进行扫描、存储为TIFF文件并使用图像1.45 J s软件量化(Wayne Rasband NIH,马里兰州贝塞斯达,美国)。密度测量数据产生的内生控制孵化墨迹与GAPDH(1/1000,紧随其后的是1/1000山羊HRP-conjugated anti-rabbit)。在PBS冲洗后,免疫反应性的乐队是由化学发光检测(超级信号,皮尔斯西Pico化学发光底物,美国)使用x射线胶片(以下西电影柯达,美国)。实验数据用相对光密度来表示。

2.8。统计数据

定量数据被表示为平均值±标准偏差(SD)。统计学意义是由单向方差分析的Bonferroni紧随其后事后测试指示意义。所有分析都使用棱镜完成软件(GraphPad Inc .)、圣地亚哥、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。Myography

CBC准备孵化与BmjeTX-I或BmjeTX-II (10μg / mL)显示总、不可逆的神经肌肉阻滞最小值和分钟(分别从克雷布斯),类似于以前的报告(16]。解放军神经肌肉的影响₂毒素亚型导致增加间接刺激神经肌肉的痉挛反应的准备。所有的毒素干扰明显挛缩体内应用ACh和氯化钾120分钟孵化后()(图2)。

3.2。肌肉的形态和超微结构的分析

光学显微镜显示,控制CBC(孵化120分钟在柠檬酸溶液)提出了肌肉纤维与正常形态而CBC孵化BmjeTX-I或BmjeTX-II地区与纤维与不同病理状态,包括有液泡的或纤维肿胀,呈现松散和/或人口聚集的肌原纤维(图3),但也与正常区域(没有显示)。

透射电子显微镜是用来评估是否BmjeTX-I BmjeTX-II影响肌肉纤维的亚细胞的完整性和神经肌肉接点(NMJ)二腹肌cervicis。控制肌肉显示典型的超微结构与平行的肌原纤维和有组织的观察。纵向和横截面肌原纤维通常是由肌浆网的资料;subsarcolemmal细胞核和线粒体被观察到没有任何损害。肌肉内的轴突显示髓鞘和正常的神经纤维细丝和线粒体(数字4(一)- - - - - -4 (c))。

不是控制,CBC准备孵化与BmjeTX-I或BmjeTX-II提出hypercontracted纤维和集群的线粒体肿胀和/或剥夺嵴,模糊间线与失去作用,并观察无序。弥漫性肿胀sarcotubular系统也观察到,一些纤维表现出myonuclei染色质和核仁的改变。肌肉的运动神经纤维显示multishaped髓鞘和轴突(数据的改变4 (d)- - - - - -4(我))。区域与正常超微结构也存在(没有显示)。

为了支持抽动张力的发现表明BmjeTX-I BmjeTX-II解放军₂导致突触前神经肌肉封锁,我们进一步研究神经肌肉接点(NMJ)通过透射电镜超微结构。控制样品孵化与柠檬酸溶液没有预处理和突触后超微结构异常。明确定义了终端连续轴膜;这是一个很好的描述突触调整到排水沟和覆盖的许旺细胞的过程。像往常一样,突触囊泡和线粒体极化突触前轴膜和许旺细胞,分别;通常,突触后肌纤维膜在小鸡的肌肉;密度沿其长度是由于膜内的突触后受体(图的存在5(一个))。

相比之下,NMJs肌肉受到BmjeTX-I BmjeTX-II,尽管他们表现出形态类似于控制;很多人表现出一个清晰的和重要的()减少突触囊泡的密度在终端剩下的囊泡扎堆于小骨料;大量线粒体损伤和突触前膜的缺席也观察到(数字5 (b)和5 (c))。终端面积和单位面积突触囊泡的数量显著降低与控制()(数据5 (d)- - - - - -5 (f))。

3.3。突触前蛋白的免疫荧光

控制终端二腹肌cervicis肌肉紧张准备显示immunolabelling synaptophysin synaptobrevin, SNAP25蛋白(数字6(一)- - - - - -6 (c)),而孵化BmjeTX-I或同行BmjeTX-II显示所有三种蛋白质非常弱的表达。数据6 (d)- - - - - -6(我)说明神经肌肉接触区域的标签是非常微弱的。

蛋白质研究显示100%的基底表达式控制,而他们显示规模比例synaptophysin > SNAP25 > synaptobrevin准备孵化BmjeTX-I和synaptophysin≥synaptobrevin = SNAP25准备孵化与BjmeTX-II(图6 (j))。乙酰胆碱受体的突触后膜,使用TRITC-conjugated标记α金环蛇毒素(α-BgTX),是保存完好的所有实验团体(数据未显示)。

3.4。蛋白质免疫印迹的突触前

CBC制备匀浆显示比例微分控制在三个突触前蛋白质检测。基线SNAP25 synaptophysin是双重的,它把双打synaptobrevin的基线。相比之下,没有synaptophysin的表达式,synaptobrevin或SNAP25蛋白质被发现在匀浆与BmjeTX-I或BmjeTX-II CBC孵化。显著差异()控制和中国人民解放军之间的观察₂s-incubated准备(图7)。

4所示。讨论

在目前的研究中我们使用了两个计划₂年代纯化从B。marajoensis毒液,BmjeTX-I BmjeTX-II [17],它的毒液(15]presynaptically行动,拥有神经肌肉阻断作用[17]。我们的目标是评估蛋白质的参与突触前的设备在这种效应在CBC控制准备通过比较它们的内容与内容匹配两个解放军准备孵化₂年代在相同浓度毒素。

这项研究是在进行在体外准备,通常提供更快更可靠的信息影响神经肌肉接头组件。除此之外,在准备muscle-nerve孵化肌肉和运动神经纤维在密切接触毒素通过他们的长度,而不是有限的组织部分时肌内注射毒素。

小鸡二腹肌cervicis (CBC)准备孵化与毒素显示不可逆转的抽动紧张的封锁。氯化钾和ACh-evoked挛缩影响了中国人民解放军₂年代亚型表明在使用浓度烟碱受体没有影响;相反,它表明BmjeTX-I和BmjeTX-II (10μg / mL)行动主要是运动神经终端,其它的建议(17]。Bmaj-9,另一个presynaptic-acting解放军₂从B。marajoensis毒液,同样的诱导和不可逆转的封锁敏在相同的浓度和相同的肌肉紧张的准备;同样,挛缩诱发氯化钾和ACh Bmaj-9[保持不变的16]。

协议,1μ克/毫升的浓度较低B。marajoensis没有压抑的毒液能够诱导神经肌肉阻断剂对外源性ACh和氯化钾,阻断突触后乙酰胆碱受体或干扰肌肉收缩机制(15]。然而,浓度高达20μg / mL生产总封锁在100分钟(15),促进了氯化钾,ACh-induced挛缩的显著减少。数据显示的重要性集中披露myotoxic毒液和神经毒性效应。

基于数据,可以得出结论,毒液的突触前的行动可能是由于Bmaj-9 [16],BmjeTX-I, BmjeTX-II [17)和presynaptic-blocking效应与Bmaj-9 BmjeTX-I和BmjeTX-II高于。有趣的是,突触前封锁是快速实现更多只要三种毒素与整个比使用毒液。证实的解释我们的发现,这是不支持的我们可以推测,其他毒液组件可能对抗中国人民解放军的影响₂毒素。

抽搐的封锁张力与BmjeTX-I CBC准备孵化或BmjeTX-II被发现出现在连接与synaptophysin的转变,synaptobrevin, SNAP25蛋白质从二腹肌cervicis终极相对控制与显示总三个蛋白的表达(包含IHC和世行数据)。控制CBC孵化与柠檬酸溶液中突触前蛋白质划定的immunolabelling分布在突触联系myofibres指示一个手术二腹肌cervicis收缩结构响应间接电神经刺激;这些数据和乙酰胆碱受体的colabelling(乙酰胆碱受体)作为证明α金环蛇毒素标签即使在治疗制剂(图未显示)证实的正常模式和功能控制和突触后未受损伤的突触后机械治疗制剂(没有显示)。

复杂的突触前机械必须释放神经递质在神经肌肉突触间隙的结。最初,突触囊泡(SV)连接到一个好,丝状肌动蛋白细胞骨架网络突触前神经终端的一部分。神经递质囊泡与一个活跃的目标区附近钙通道(拘束)和码头到突触前膜和一个ATPase-dependent过程促进了SV启动。一旦启动了SV可以融合并释放神经递质。这个过程是由vesicle-associated、胞质膜蛋白(19]。

本研究的另一个重要的发现是,终端的面积显著降低在准备孵化与Bjme-TX-I Bjme-TX-II减少明显高于前者,而不是后者。此外,每个终端的突触囊泡数量显著减少当CBC准备孵化与中国人民解放军₂毒素。相比之下,突触囊泡的数量相对于终端的面积明显减少与Bjme-TX-II但不是Bjme-TX-I准备孵化。Synaptophysin表达式与SV完整性(19)及其缺乏准备孵化与毒素符合减少末梢的囊泡和抽搐的封锁张力与毒素制剂治疗。另一方面,神经终端的面积的减少似乎表明两种毒素的突触前行动超出了影响突触前的表达蛋白质,模糊的确切性质。

蛇突触前解放军₂神经毒素(跨越)麻痹神经肌肉接头(NMJs)脊椎动物骨骼肌减少SV的内容。研究使用的主要神经元突触肿胀、文化展示与表面接触的突触囊泡蛋白的细胞腔的域synaptotagmin我,和神经递质胞外分泌。其他研究使用一个克分子数相等的溶血磷脂和脂肪酸的混合物,它模仿跨越的生物效应,表明可能当地SV脂质变化释放的作用[19]。

在这项研究中,10μ克/毫升浓度的毒素也诱导改变肌肉纤维。很可能发生的变化是由损伤引起的磷脂双分子层的纤维膜所推断的组织学和超微结构的研究。神经肌肉阻滞和/或肌肉损伤,诱导BmjeTX-I和BmjeTX-II CBC准备,也在肌肉紧张与其他毒素制剂治疗,如BthTX-I [8,10]和BthTX-II [5从B。jararacussu毒液和BnpTX-I BnpTX-II毒素(9从b . pauloensis (neuwiedi)毒液。肌肉损伤的快速海拔在小鼠血浆CK活动也观察到Ponce-Soto et al。17]在活的有机体内两个毒素的研究。这些结果表明,BmjeTX-I和BmjeTX-II解放军₂年代myotoxic效果显示,大多数的毒液和毒素被隔绝具窍蝮蛇属蛇,这不是与烟碱受体的突触后肌纤维膜的损伤。

此外,肌超微结构的改变与BmjeTX-I和BmjeTX-II类似描述Rodrigues-Simioni et al。20.在青蛙肌肉紧张准备孵化B。jararacussu毒液。此外,肌肉运动神经轴突的变化是另外两个解放军的神经毒性作用的证据₂年代。

5。结论

没有参与突触囊泡蛋白的完整性(synaptophysin),泡对接,和发射机胞外分泌(synaptophysin、synaptobrevin SNAP25),在准备孵化BmjeTX-I BmjeTX-II,直接和有力的证据支持我们的假设,BmjeTX-I BmjeTX-II影响神经递质释放机械通过阻止突触囊泡的对接的轴膜神经终端。研究强化了假说,缺乏这些蛋白质负责两种毒素引起的神经毒性具窍蝮蛇属marajoensis毒液。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢吉尔多·雷特先生的技术援助和西尔维亚卡多佐博士从位于Biologico / Butantan研究所提供的照片B。marajoensis保持被囚禁。这项工作是支持Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗(FAPESP)必须占州政府拨款2011/00001-1 2005/53625-1。安东尼奥葡京和Rodolfo Melare硕士学生。犹尼亚安·r·b·弗朗哥,卡罗莱纳诉Bis和玛尔塔格雷西亚本科生支持由慰问Nacional de solcharships Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)(犹尼亚安·r·b·佛朗哥)和(Marta格雷西亚)。玛丽亚爱丽丝da Cruz-Hofling是1从CNPq研究员。

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