文摘

潜在的作用机制lignocellulolytic酶降解木质纤维素的生物质尚不清楚;因此,它是至关重要的酶参与的交互过程进行调查。在这项研究中,退化的玉米棒孢子丝菌carnis和参与lignocellulolytic酶的生物降解进行了超过240 h栽培时期。玉米芯是通过退化60%左右美国carnis最后发酵。收益率的水解酶,纤维素酶和木聚糖酶,高于氧化的酶、漆酶和过氧化物酶,超过144 h发酵周期。最高产量的纤维素酶(854.4 U /毫克)和木聚糖酶(789.6 U /毫克)在96年和144年h,分别。漆酶和过氧化物酶产生合作最高产量为489.06 U /毫克和585.39 U /毫克144 h。急剧下滑的纤维素酶在生产144 h (242.01 U /毫克)和木聚糖酶在192 h (192.2 U /毫克)表明,他们最初的角色的生物降解木质纤维素的生物质在漆酶和过氧化物酶扮演后来角色。优化降解玉米穗轴(76.6%)和酶水解和氧化的生产实现了2.5%的接种体pH值6.0。结果显示协同水解和氧化的酶之间的相互作用,可以优化提高生物降解。

1。介绍

木质生物质,被认为是有机材料的质量从生物性或物质有各种可用资源转换成bioproducts [1]。这些资源可以被利用来创建新的生物材料,如燃料、化工、动物饲料、土壤调节剂、肥料(2]。然而,未充分利用或无效的管理这些微生物导致的环境污染在地球表面将人类置于各种风险(3]。

化学水解方法曾用于恢复纤维素从木质纤维素的微生物,但方法是非常昂贵和能源密集型产业,因为它涉及机械加工与酸,碱,和蒸汽爆炸4,5]。这个重大挑战因此使得寻找更好的和有效的方法水解木质纤维素通过生物方法对lignocellulolytic酶的生产非常重要。

纤维素酶、木聚糖酶、漆酶和氧化酵素是细胞外lignocellulolytic酶催化降解木质纤维素的的能力。纤维素酶,参与降解木质纤维素的水解酶,包括内切葡聚糖酶,exoglucanases,β-glucosidases催化水解纤维素的线性多糖聚合物与许多葡萄糖单糖单位不仅生产液体燃料,还生产其他化学物质,可以潜在的替代品石油衍生品(6,7]。木聚糖酶(endo-1 4 --D-xylanohydrolase)在解聚的木聚糖中扮演重要的角色,主要的可再生hemicellulosic植物细胞壁的多糖。它催化作用降解木聚糖的酶切xylosyl xylooligosaccharides骨干和释放短,由木聚糖进一步水解为木糖单位1,4 -β木糖苷酶(8,9]。漆酶和氧化酵素oxidoreductive酶被认为是最有效的清除木质纤维素木质素的组成部分。这些lignocellulolytic酶已报告拥有广泛应用于纺织、造纸和纸浆,食品、化学和酶技术行业以及生物燃料工业发电(3,10,11]。

研究表明,某些种类的白腐真菌(WRF)可以实现高效降解木质纤维素的生产工业有用的oxidoreductive和水解酶在培养适当的媒体含有碳和氮的来源,可以刺激他们的生长和增殖12- - - - - -14]。WRF不仅能产生lignocellulolytic酶也能穿透这些酶底物运输的材料,如木屑通过菌丝的扩展(15]。然而,缺乏信息的交互lignocellulolytic真菌菌株的酶降解木质纤维素的生物质。此外,机制的交互lignocellulolytic酶提高生物降解木质纤维素的白腐真菌还不清楚。因此,有需要检查的交互的木质纤维素降解酶水解和氧化和降解过程的相互作用的影响(14,16不同发酵条件下。在这项研究中,我们调查了一些工艺参数对生产的影响lignocellulolytic白腐真菌和检查这些酶的酶相互作用,提高了木质纤维素的生物降解。

2。材料和方法

2.1。材料

羧甲基纤维素、白桦木材木聚糖,2,2′-azino-di——3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic酸(abt),二硝基水杨酸、酒石酸钠钾,牛血清白蛋白(BSA),硫酸锰,硫酸铜,酪氨酸,亮氨酸,纤维二糖,avicel,木糖,色氨酸,天冬氨酸,谷氨酸,过氧化氢和媒体组件产品Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。玉米穗轴从当地市场购买。玉米棒是晒干和粉微粒是利用碳源的基底媒体。进一步处理的玉米穗轴粉进行了使用标准筛平均大小为1毫米。所有其他化学物质均为分析纯。

2.2。真菌菌株

所使用的微生物是一个从腐烂的木材白腐真菌隔离选择Ijare柑橘种植园,帕斯州,尼日利亚西南部。被确认为压力孢子丝菌carnis生物技术部门的联邦工业研究所,拉各斯,基于形态学和生化方法所描述的柯林斯et al。17]。真菌菌株是保持新鲜马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)偏和储存在4°C。

2.3。剂的制备和生产Lignocellulolytic酶

种子文化是由增长的铂环量在30毫升含有葡萄糖培养基斜面培养法(10.0 g / L),硝酸铵(2.0 g / L), KH₂阿宝₄(0.8 g / L), K₂HPO₄(0.2 g / L), MgSO₄h·7₂O (0.5 g / L),酵母提取物(2.0 g / L)与pH值调整到锥形瓶200毫升6.0 [10]。文化孕育了72年30°C hr在160 rpm摇晃孵化器(英国斯图亚特)。抱种子文化是用作生产培养液媒体。种子培养液1.5毫升(v / v)构成3%被转移到一个基于50毫升玉米棒(CCB)媒体包括玉米棒(10 g / L),硝酸铵(2.0 g / L), KH₂阿宝₄(0.8 g / L), K₂HPO₄(0.2 g / L), MgSO₄h·7₂CuSO O (0.5 g / L)₄h·5₂O (0.25 g / L),酵母提取物(2.0 g / L),和MnSO₄h·7₂O在pH值为6.0。年底的192小时的潜伏期,文化是在10000转离心收获而使用冷藏15分钟在4°C台式离心机(埃普多夫5810 r)。细胞自由上层清液回收粗酶制剂和化验的纤维素酶,木聚糖酶、漆酶、过氧化物酶。

2.4。酶化验

2.4.1。纤维素酶活性测定

生物质分离后得到的上层清液对酶活性进行了分析。内切葡聚糖酶(CMCase)活动决心使用木头和Bhat[描述的方法18)做了一些调整。一百五十毫升(150μ酶提取了450 L)μL 1% (w / v)羧甲基纤维素(CMC)在50毫米醋酸钠缓冲(pH值4.8)的埃普多夫管和孵化40°C 20分钟。反应是400年终止的μL(二硝基水杨酸在100°C (DNSA)和煮5分钟。对空白吸光度被记录在575海里。一个单位的CMCase活动表示为1μ摩尔葡萄糖解放在标准试验条件下每分钟。

2.4.2。木聚糖酶活性测定

木聚糖酶活性决定根据萨哈的方法(19)与轻微的修改。反应混合物组成400人μL 1% (w / v)解决方案的白桦木材木聚糖在50 mM Tris-HCl缓冲pH值9.0与100年孵化μL文化的上层清液为15分钟40°C。释放还原糖是化验使用DNSA方法(20.]。木聚糖酶活动的一个单位被定义为解放的酶量1μ摩尔的木糖在标准试验条件下等效每分钟。

2.4.3。漆酶活性测定

漆酶活性决定根据波旁的改性方法和帕斯(21]。这样做是通过监测spectrophotometrically在420 nm(吸光度的变化_420年)相关的氧化速度1毫米2,2′-azino-di——[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate] (abt)在50毫米醋酸钠缓冲(pH值3.8)。化验进行750年1毫升在室温下比色皿μL abt - 250μ酶提取的L。被定义为一个单位的漆酶活动导致的氧化的酶量1μ摩尔的每分钟abt的摩尔消光abt激进的阳离子(产品)的反应= 36000⁻¹厘米⁻¹。

2.4.4。过氧化物酶活性测定

总过氧化物酶活动化验的方法猎人et al。22]。过氧化物酶活性测定通过氧化0.24毫米2,2′-azino-di - [3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate] (abt)缓冲50毫米醋酸钠缓冲pH值5.0的5毫米H₂O₂在414海里5分钟在紫外/可见分光光度计(整合)。反应混合物(750μL)包含相同体积的abt、文化上层清液,和H₂O₂。过氧化物酶活动的一个单位(U)被定义为的酶氧化量1μ摩尔abt每分钟在pH值5.0和25°C的摩尔消光系数abt激进的阳离子(产品)的反应= 31100⁻¹厘米⁻¹。

2.4.5。蛋白质浓度测定

蛋白质浓度测定方法的布拉德福德(23使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。在分析,200年μL(稀释染色试剂用移液器吸取到10μ样品溶液的L。混合物在室温下被孵化15分钟允许适当的色彩发展。对空白吸光度测量在595海里。特定活动的纤维素酶、木聚糖酶、漆酶和过氧化物酶被表示为U /毫克的蛋白质

2.5。调查Lignocellulolytic酶的相互作用产生的孢子丝菌carnis在退化的玉米棒

2.5.1。培养时间对降解的影响的玉米棒和生产Lignocellulolytic酶的动力学孢子丝菌carnis

退化的玉米棒孢子丝菌carnis进行了在155 rpm颤抖的孵化器和30°C包含100毫升瓶建行的媒体。建行媒体的初始pH值调整到6.0之前高压灭菌法。建行媒体注射3%接种物的种子文化和在155 rpm颤抖的孵化器孵化。玉米棒和生产的酶的生物降解是监控以48小时的间隔超过240 h。在每个发酵期间,发酵培养基的筛选和总生物量发酵基质和菌丝组成的测量使用绘画纸滤纸在媒体上评估玉米棒的退化。实验一式三份完成。滤液此后离心机在4°C和6000 rpm,持续15分钟。得到的上层清液用于测定lignocellulolytic酶活动的根据标准程序。降解效率进行了计算

2.5.2。接种体大小对玉米棒退化的影响和生产Lignocellulolytic酶的动力学孢子丝菌carnis

效果不同培养液的大小是由不同比例的培养液引入无菌建行媒体。使用的接种物的百分比分别为1%,2%,2.5%,5%,7.5%,10%。玉米穗轴媒体(50 mL)准备和pH值调整到6.0。媒体被热压处理过的、冷却和接种0.3毫升,0.6毫升,0.75毫升,1.5毫升,2.25毫升,和3毫升,抱的种子的文化孢子丝菌carnis,分别。接种媒体被转移到一个颤抖的孵化器和孵化在155转144 h的最佳培养时间获得生产lignocellulolytic酶在退化的玉米棒美国carnis。在144 h,降解效率评估如前所述,发酵培养基配方离心机和上层清液用于测定lignocellulolytic酶的活动。实验一式三份完成。

2.5.3。pH值对玉米棒退化的影响和生产Lignocellulolytic酶的动力学孢子丝菌carnis

pH值对玉米棒退化的影响取决于准备建行媒体在不同pH值的4.0 - -10.0。建行媒体(50 mL)准备,媒体的pH值调整到4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,和10.0,分别。热压处理过的和接种2.5%的媒体孢子丝菌carnis种子文化。接种媒体在颤抖的孵化器孵化30°C (Stuart) 155转144 h后发酵培养基配方离心机。上层清液是用来测定lignocellulolytic酶的活性。降解效率被确定为早期的描述。实验进行了一式三份。

3所示。结果与讨论

3.1。培养时间对降解的影响的玉米棒和Lignocellulolytic酶的生产和交互孢子丝菌carnis

结果显示,14%的玉米穗轴被发酵(图48 h退化1)。观察退化的毕业典礼lignocellulolytic酶的生产。这表明酶催化分解木质纤维素的组件的玉米棒的代谢物孢子丝菌carnis利用增长(24]。观察到,随着培养时间的增加,降解增加到19.87%在96 h, 27.71%在144 h, 39.47%在192 h和退化得到约60%在240 h。结果表明,降解的玉米穗轴随时间增加。酶生产的分析结果表明,纤维素酶的产量是最高的在四个酶化验在48 h(图2)。纤维素酶是第一个酶,这种酶在玉米穗轴在退化为127.6 U /毫克是48 h,尽管低数量的木聚糖酶(69.68 U /毫克)和过氧化物酶(34.6 U /毫克)获得了在这个培养时间(图2)。然而令人惊讶的观察,漆酶没有检测到48 h。这可能是一个迹象表明,在木质纤维素的降解β1,4-bonds组件是第一个被水解纤维素使其他组件可以降解[6]。这种真菌的能力产生高水平的纤维素酶和木聚糖酶的重要性与碳源供应日益增长的文化和营养必不可少的生物合成的活动(10]。

在培养96 h,降解效率增加到19.89%(图1)。在这个培养时间,发现纤维素酶生产达到一个高潮最高产量为854.4 U /毫克(图2)。因此刺激提高木聚糖酶生产的130.5 U / mg)(具体活动96 h两次活动记录在培养(图48 h2)。发现,纤维素和半纤维素的水解玉米穗轴的组件增加,木质素组件变得更容易获得,与过氧化物酶活动共同增加明显。观察结果表明,漆酶生产96 h的栽培与特定的活动(图98.2 U /毫克2)。这表明,漆酶从这个生物不是主要代谢物真菌产生的增长需要在后期阶段的降解过程(25,26]。

96 h后,纤维素酶活性迅速下降,生产其他的酶(过氧化物酶,木聚糖酶和漆酶)大幅提升。获得了最佳生产这三种酶在144 h(图2(图)与木质纤维素降解了27.7%1)。令人惊讶的观察,最大生产木聚糖酶、漆酶、过氧化物酶得到纤维素酶生产下降。这表明酶的活动在降解过程中纤维素酶的作用取决于启动这个过程。它可以推断出,快速增长的退化是一个结果中观察到一代的许多开放结束通过纤维素水解增强的可访问性的顽固的木质素组件的玉米棒27]。随着培养时间的增加超过144 h,水解酶的生产下降(图2)。这种下降可能是由于疲惫的葡萄糖和木糖的主要代谢物从降解获得玉米棒孢子丝菌carnis需要的增长。这是观察到,在此期间,氧化的酶的产量还高(516.27 U / mg过氧化物酶;417.8 U / mg漆酶)占增加降解效率高达39.5%和59.81%在192 h和240 h的退化,分别。

获得的结果在lignocellulolytic酶的生产美国carnis在玉米穗轴退化支持Kachlishvili等人的发现,据报道,这些酶的生产是由一些担子菌发酵的最优144 h在发酵食品废物(10]。同样,Sharma等人报道最大的木聚糖酶的生产曲霉属真菌sp. 144 h的培养(28]。然而,一些真菌已报告生产lignocellulolytic酶120 h内种植,而一些超越144 h (29日- - - - - -31日]。

3.2。接种体大小的影响降解的玉米穗轴和Lignocellulolytic酶的生产和交互孢子丝菌carnis

调查的接种体大小对玉米棒退化的影响孢子丝菌carnis显示,微生物负载影响了降解过程。这是观察到的降解效率孢子丝菌carnis增加到73%在144 h时使用2.5%的接种体降解效率达到了59.8%在240 h的发酵培养液的3%(图3)。使用1%的接种体,4.03%降解的玉米穗轴实现在144 h。降解效率为44.83%,62.2%,58.7%获得了2%,5%,和7.5%的接种物,分别为(图3)。结果显示,最佳接种体大小是关键重要的降解研究降低培养液大小允许微生物文化将以较慢的速度,因此利用率不足的衬底产生代谢物。另一方面,大的接种体大小导致快速增殖的细胞得到营养耗尽迅速随时间(24]。令人惊讶的是,2.5%时产生最佳的水解酶剂大小使用纤维素酶活性为1024.22 U /毫克和木聚糖酶活动的779.82 / mg而2%的接种体大小支持生产氧化的酶与特定活动415.45 U / mg和757.41 U / mg漆酶和过氧化物酶(图4)。中存在的大量孢子接种体报道促进快速扩散和生物质合成的酶生产显然与这一研究获得的纤维素酶和木聚糖酶的生产(32,33]。

剂尺寸超过2.5%,这是观察到有一个lignocellulolytic酶的生产下降,最终导致了快速降解效率的下降美国carnis。先前的研究已经表明,超过一定的培养液负载,酶产量可能减少由于营养物质的消耗,开发氧张力在中产生的增强的生物量。这些因素可能单独或集体导致减少代谢活动(34,35]。不同培养液大小已报告来支持这些lignocellulolytic酶的最佳生产。报告表明,降低接种体大小支持这些酶的生产,据报道,营养和氧含量在发酵媒体足够的为真菌的生长,因此加强生产lignocellulolytic酶(36]。粗麻布et al。33)最大的纤维素酶生产报告曲霉属真菌terreus剂为4%。Omojasola等人在他们的研究报告时葡萄糖产量下降一些真菌培养菠萝浪费在培养液大小使用6%和8%以上答:尼日尔以上为发酵使用4%和6%t . longibrachiatum由于纤维素酶产量低(37]。Niladevi等人观察漆酶生产的增加剂尺寸在1.0 - -4.0%,减少5%接种体大小(38]。水解酶的产量增加2.5%的接种体在氧化的酶美国carnis可能是一个原因在这剂获得的最佳降解大小表明水解酶降解过程中发挥更重要的作用比氧化的酶。

3.3。pH值对退化的影响玉米穗轴和Lignocellulolytic酶的生产和交互孢子丝菌carnis

优化各种条件影响酶促降解木质纤维素的生物质,pH值被发现是一个关键因素影响的过程。结果表明,玉米穗轴的退化美国carnis增加与pH值和最优降解76.65%获得(图6.0 pH值5)。随着过程往往向碱性区域,结果表明降解的玉米穗轴拒绝。这是观察到所有lignocellulolytic酶与纤维素酶生产的最佳pH值6.0是最丰富的一个,因为它有一个特定的活动608.52 U /毫克紧随其后的是木聚糖酶(517.6 U /毫克)和过氧化物酶(412.89 U /毫克),最少的是漆酶最大的具体活动(图360.6 U /毫克6)。碱性pH值增加的地区,这是观察到酶的生产水平下降导致降解效率较低。pH值10.0时没有发现水解酶,降解效率只有10%。

这个条件下的水解酶的生产过剩与水解酶的酶氧化确认执行主要和关键的角色在木质纤维素降解26]。同时,酶水解和氧化的最佳生产pH值6.0表明存在水解和氧化的酶之间的协同作用提高降解效率美国carnis。结果表明,降解木质纤维素的水解酶的作用取决于启动退化使访问顽固的木质素降解过程中组件。此外,结果表明,氧化的酶的作用机制取决于水解酶的作用[25,26]。

之前的报告其他的木质素分解真菌显示最大在酸性纤维素酶生产地区。最大的纤维素酶活动0.925 U /毫升的pH值4 Acharya等人观察到当他们使用黑曲霉固态发酵的锯末(39]。Sohail等人报道最大的纤维素酶活动的pH值4黑曲霉(40]。甘蔗废料通过固态发酵生产纤维素酶发酵使用黑曲霉和木霉在最佳pH值为4.5 (41]。伊卜拉欣-等人报道的最佳pH值4.5的纤维素酶生产优化研究[42]。托尔和伊卜拉欣-也发现纤维素酶生产的高产酸性地区最佳生产4.0 pH值对应于最大降解纤维素的鹰嘴豆农业废物基质(43]。同样,最佳pH值4.0和5.0报告了最高产量的粗木质素改性酶革盖菌属hirsutus栓菌属和摘要,分别为(44]。温家宝等人报道的最佳pH值5.0锰过氧化物酶的产量p . chrysosporium(45]。同样,Yasmeen等人报道,酸性环境下支持木质素改性酶裂褶菌属公社和灵芝(46]。这项研究的结果表明,酸性条件有利于lignocellulolytic酶的降解过程和生产孢子丝菌carnis这种情况下以协同的方式,增强更好的降解研究下的玉米棒。

4所示。结论

从这个研究结果给了一些见解协同水解和氧化的酶之间的相互作用参与降解木质纤维素的生物质。这些lignocellulolytic酶的没有任何可能影响降解的过程。提高降解木质纤维素的研究是通过优化工艺参数lignocellulolytic酶的高效生产。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。