文摘

发达的方法三个酶组成的胆固醇酯酶,胆固醇氧化酶和过氧化物酶的制造安培计的生物传感器为了确定总胆固醇血清样本。金纳米粒子(AuNPs)和羧酸盐多层碳纳米管(cMWCNTs)被用来设计核心的工作电极,共价固定化曹,切,合。聚丙烯酰胺层涂终于在工作电极,以防止酶浸出。化学合成金纳米粒子受到透射电子显微镜(TEM)分析粒子的形状和大小。工作电极受到红外光谱和x射线衍射。AuNP的联合行动和c-MWCNT显示增强electrocatalytic活动在一个非常低的潜力0.27 V。pH值,温度40°C,响应时间为20秒,分别观察。生物传感器显示广泛的线性范围从0.5 mg / dL - 250 mg / dL (0.01 mM - 5.83 mM)和最低检出限为0.5 mg / dL(0.01毫米)。生物传感器显示45倍的可重用性和稳定的60天。生物传感器是成功测试来确定总胆固醇与无显著的干涉amperometrically血清样本血清组件。

1。介绍

增加死亡率由于心血管疾病(心血管病)在目前情况下,有必要开发更先进的诊断方法。这些先进的诊断方法应该疾病在早期和防止它致命的。胆固醇被认为是危险因素,当血液胆固醇高于正常水平,因此导致心血管疾病(CVD)的风险1]。此外,高血压或糖尿病也会增加更多的风险。血液的胆固醇水平升高的因素之一负责冠状动脉疾病、高血压、肾病综合症或肝硬化、动脉粥样硬化、心脏病和中风(2]。当太多的胆固醇在血液中循环,慢慢建立层内部的内墙动脉狭窄和不灵活的(2]。

有几种方法如量热法(3),液相/气相色谱法,高效液相色谱法、光谱光度测量的方法和基于热敏电阻的分析用于确定胆固醇浓度(4- - - - - -8]。上面的方法快速、准确、敏感但受到限制:他们需要训练有素的人力资源,他们需要样品预处理,需要大量的时间,他们只是局限于实验室缺乏现场监控。这些方法的一个有前途的替代是一个生物传感器能够确定胆固醇更迅速和更敏感的水平可移植性的加上点(9]。生物传感器大会由三个组件:biorecognition层(酶在这种情况下),特别是与分析物和生物反应,生成一个传感器感知这些反应和过程的生物响应可测量的信号,第三个组件和一个显示单元。传感器组装生物传感器的一个重要组成部分在确定精度和灵敏度10]。直接固定曹各种支持有助于确定不同样品中胆固醇的浓度。作为血清胆固醇酯的形式存在,为了确定总胆固醇、格瓦拉随着曹是必需的。胆固醇酯酶首先水解酯化胆固醇和进一步氧化生产cholest-4-en-3-one胆固醇氧化酶和过氧化氢(H₂O₂)。在测量电流的生物传感器应用电势在H₂O₂让氧化产生电子和电子的流动会产生电流。当前生成的直接与血清中胆固醇浓度成正比: 减少干扰的新方法是使用辣根过氧化物酶(合)。合与ferroheme / ferriheme对氧化还原中心相关。减少状态到氧化状态转换是通过直接的电子转移。在其3 d配置合血红素组在外部区域,提高了氧化还原中心之间的直接电子转移和开展网站出现在传感器(11]。合的再生是通过直接电子转移: 固定化酶在合适的支持可能会降低米氏常数或者它可能提高双分子的速率常数,使生物传感器的性能(12- - - - - -15]。曹和胆固醇水解酶切已经固定在导电聚合物16)喜欢聚吡咯薄膜(17)、PVC带(18)、PB /聚吡咯(PPy)复合膜19),醋酸纤维素/碳电极[20.),醋酸纤维素/ Pt电极[21),electropolymerised PPy电影(22),聚3-thiopheneacetic酸膜/ Pt电极[23)和PANI-pTSA-Ag / ITO (11),和溶胶-凝胶法的电影24]。进化的纳米材料生物传感器领域也有了翻天覆地的变化。纳米级尺寸,石墨表面化学,electrocatalytic碳纳米管的性质使他们一个有趣的材料传感目的。单身,微碳纳米管(25,26],热合[27),CNT-chitosan / GCE [28)、铁₃O₄-SiO₂/ MWCNT [29日),石墨烯改性石墨电极(30.),石墨烯/ Pt NPs [31日),Pt /非盟氧化锌纳米棒(32),NSPANI-AuNP-GR / ITO [33),AuNPs /非盟电极[34],graphite-teflon矩阵[35],Pt-Pd双金属纳米颗粒装饰字母(36]的支持已被用于生成的生物信号的转导为胆固醇测定电信号。PVC也被用于固定胆固醇水解酶。曹和切PVC表面共价固定在烧杯充当反应细胞和合成立于碳电极(37]。

在目前的方法,结合三种酶被用于电化学生物传感器的发展,固定三种酶(曹、格瓦拉和合AuNPs和c-MWCNT基础电极确定胆固醇血清中胆固醇。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

胆固醇酯酶纯化假单胞菌物种(165.8单位/克);4-amino-phenazone,特里同x - 100、胆甾醇酯和羧酸盐微碳纳米管(c-MWCNTs)从西格玛化工有限公司购买美国。胆固醇氧化酶的链霉菌属sp。(500单位/ 10毫克)和辣根过氧化物酶(合)(80 U / mg)获得SISCO研究实验室pvt Ld,孟买。银色的线从当地市场购买。所有其他的化学物质在实验均为分析纯。金纳米粒子(AuNPs)是合成生物技术中心,妇女们Dayanand大学Rohtak。

2.2。仪表

稳压器(瑞士万通PSTAT迷你910年,瑞士)是用于电化学研究。超声破碎法是用铬技术超声波液体处理器。TEM jem - 2100 f显微镜(AIRF JNU,新德里)使用;瓦里安7000红外光谱谱仪(AIRF JNU,新德里)被用于进行傅里叶变换红外(FTIR)光谱。x射线衍射(XRD)所提供的设施对金纳米粒子和c-MWCNTs物理系,医学大学,Rohtak。日本岛津公司公司2450紫外分光光度计使用进行光度测量生物技术中心。

2.3。金纳米粒子的合成

化学合成的金纳米粒子使用柠檬酸盐还原法(38]。亚氯酸(HAuCl 100毫升0.001%的黄金₄在97°C)煮连续使用电磁搅拌器搅拌。然后,添加1%柠檬酸钠溶液;在4到5分钟解决方案变成酒红色和进一步加热4至5分钟,然后在室温下冷却。最后离心球干为进一步使用。透射电子显微镜(TEM)的合成AuNPs AIRF在商业基础上,完成JNU,新德里,确认新合成纳米颗粒的形状和大小范围的粒子。

2.4。制造切/ ChO / HRP-AuNPs / c-MWCNT修改银工作电极

制造战略工作电极组成混合c-MWCNTs和金纳米粒子(AuNPs)石蜡油在固定比例,直到获得一个一致的粘贴。塑料空心管(3厘米×4毫米)充满了纳米材料通过上面了。银(Ag)线与乙醇和ddH打扫干净了₂O通过声波降解法,然后插在粘贴填充管实现电接触。然后上面的电极被允许干然后沉浸在赵的混合物,格瓦拉,合解决方案2小时,这样酶在电极表面可以绑定。羧基(羧基)组出现在热合形式与氨基酰胺债券目前的酶形成共价键。然后,电极表面覆盖着一层薄膜的聚丙烯酰胺(PAA)有助于防止酶浸出。

2.5。描述基于碳的工作电极

基于纳米材料的的核心工作电极(AuNPs / c-MWCNTs / Ag)电极)和酶电极(切/ ChO / HRP-AuNP / c-MWCNTs / Ag)电极)的特征是使用瓦里安7000红外光谱谱仪(AIRF JNU,新德里);在涂层PAA傅里叶变换红外(FTIR)光谱,在KBr样品制备完成。x射线衍射(XRD)研究也进行分析的稳定性c-MWCNTs与AuNPs混合。扫描电子显微镜(SEM)分析修改完成的工作电极的表面形态不同的加工阶段。

2.6。组装的胆固醇生物传感器

一个安培计的胆固醇生物传感器组装使用切/ ChO / HRP-AuNPs / c-MWCNT Ag作为酶固定化电极工作,Ag / AgCl纯粹作为参考,通过稳压器和Pt线作为辅助电极连接。

2.7。电化学研究ChO /车/ HRP-AuNPs / c-MWCNT Ag)电极

循环伏安法(CV)研究中,电化学阻抗谱(EIS),和所有其他测量电流的检测在整个实验过程中进行一个稳压器(PSTAT mini 910年,瑞士万通)使用三电极系统在电化电池。所有的循环伏安测量在室温下进行,并连续记录从−0.4 + 0.4 V与不同扫描速率(25、50、100 mV / s)。

2.8。动力学的研究方法

新开发方法的动力学特性进行了研究,包括最佳pH值、温度、响应时间、底物(胆甾醇酯)浓度的影响,,。

2.9。评价的方法

评价的方法进行了线性,最低检出限,百分比分析恢复精度和准确性。干扰物种生物传感器的性能的影响进行了研究。随着时间的推移贮存稳定性和可重复性的方法也进行了分析。

2.9.1。线性工作范围和最低检出限

线性范围和最低检测范围被绘制计算值与标准图像的值。

2.9.2。分析复苏

可靠性测试的方法使用不同浓度的乙酸胆甾醇(100 mg / dL和200 mg / dL)飙升(2.33毫米和4.66毫米)的血清样本,分析确定胆甾醇乙酸酯的复苏。

2.9.3。精度

当前方法的重现性和总胆固醇水平确定在样例同日(批处理)和在相同的样本存储在4°C一周(批次之间);变异系数(CVs)目前的计算方法。

2.9.4。精度

确定新开发的方法,精度10血清样本与胆甾醇酯飙升,然后测试标准拜耳的恩佐工具包和现在的方法;那么这两种方法得到的值使相互和回归方程。

2.9.5。干扰物质的影响

响应的方法分析了干扰物质的存在被发现血清中如丙酮酸、葡萄糖、柠檬酸、Ca^{2 +}、尿酸、抗坏血酸,丙酮,尿素,胆红素。干扰的影响,这些物质是由在反应混合物中添加干扰物种一个接一个在生理浓度。

2.10。贮存稳定性和可重用性的方法

每次使用前酶电极清洗使用洗涤缓冲(0.01米磷酸缓冲盐,pH值7.2与0.1%渐变20)。工作电极的稳定性研究的60天,当储存在4°C。工作电极的反应在每5天测定一次。

2.11。新开发的应用方法

血液样本(1毫升)和不同的年龄和性别组收集从健康人和人遭受疾病由于高胆固醇水平禁食12小时后,在Pt。BDS PGIMS, Rohtak。血液样本在1500×g离心5分钟,得到的上层清液(血清)收集测定胆固醇水平。血清总胆固醇的测试是由目前的方法。曹,切,合固定在工作电极表面催化胆甾醇乙酸酯的水解,产生H₂O₂然后由合氧化。合本身是再生,因为它直接将电子传递到电极。目前生产过程中直接与H的浓度成正比₂O₂生产总胆固醇本身是直接成正比。

3所示。结果与讨论

3.1。表征金纳米粒子(AuNPs)

实验室合成AuNPs通过透射电子显微镜(TEM)研究。数据显示,纳米颗粒的球形从10到30 nm大小(数字1(一),1 (b),1 (c))。

3.2。金纳米粒子装饰c-MWCNTs通过XRD分析

碳管的结构稳定和工作电极(AuNPs / c-MWCNT)由XRD表征研究,分析了特征峰的c-MWCNTs(图2,曲线(a))坚持即使在AuNPs的衍射峰,c-MWCNT粘贴(图2曲线(b))。峰值出现在19.6和21.5的独特的特征峰c-MWCNTs也出现在曲线(b)确保c-MWCNTs的典型石墨签名结构是稳定的,即使与c-MWCNT AuNPs涨跌互现。

3.3。通过红外光谱确认共价固定化

红外光谱光谱AuNPs / c-MWCNTs显示吸收峰附近的1011厘米⁻¹,1545厘米⁻¹,2250厘米⁻¹签名山峰的碳纳米管。酶固定化后,格瓦拉/ ChO / HRP-AuNPs / c-MWCNTs,一个新的签名的峰值出现在1537厘米⁻¹和1630厘米⁻¹和一个广泛的峰值上升3287厘米⁻¹这是由于羰基和酰胺债券。

3.4。表面形态新制作的电极

工作电极的表面形态进行了分析使用扫描电子显微镜制造的不同阶段。视觉形态特征的变化已经注意到电极表面的沉积物质。扫描电镜图像的工作电极和酶被显示在图3。

3.5。电化学分析切/ ChO / HRP-AuNPs / c-MWCNT Ag)电极

工作电极的电化学研究是由使用循环伏安法。合的还原电位测定固定于电极的核心,它是沉浸在0.01 H₂O₂30分钟,然后用蒸馏水洗之前执行循环伏安法。循环伏安法切/ ChO / HRP-AuNPs c-MWCNT Ag)电极报道从−0.4,+ 0.8 V在特定扫描率25 mV / s, 50 mV / s, 100 mV / s(图4)。的最佳扫描率50 mV / s被认为上述的生物传感器。制作生物传感器的重现性是通过运行4个简历周期检查扫描速度50 mV / s(图5)。在整个检查,观察一个顶点在0.27 V;这出现由于氧化合上电极。所以,据估计,切/ ChO / HRP-AuNPs / MWCNT Ag)电极提供最终信号和最小噪声为0.27 V和进一步用来分析决定。生物传感器在较低的工作潜力相比其他可用生物传感器由于表面积大的金纳米粒子和它们的高导电性质。

3.6。动力学研究的方法

改善生物传感器工作性能的各种参数,如工作潜力,温度、时间、底物浓度和pH值在制作生物传感器进行了分析。

3.6.1。响应的工作潜力

当前有不同的响应应用潜力的生物传感器如图6。工作可能跳过从0.0 V至0.7 V。增加的工作潜力,增加稳态电流反应观察。首先,它显示的当前值显著增加+ 0.1 V至+ 0.27 V,然后达到一个水平+ 0.27 V至+ 0.5 V, + 0.5 V后略有下降。因此,+ 0.27 V被选为的工作潜力检测胆固醇的生物传感器。

操作。反应pH值

pH缓冲的反应是不同的pH值范围内,pH值4.5至8.0,找到最佳pH值使用琥珀酸钠缓冲(pH值4.5 - -5.5)和钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.0 - -8.0)在最后一个0.02米的浓度。所有其他变异的标准试验条件除了博士最佳pH值被发现为生物传感器(图77)。

3.6.3。反应的温度

生物传感器的反应温度的持续提高5°C从20°C到60°C被审问。发现生物传感器显示最大响应在40°C(图8)。支持用于固定提供的微环境使其热稳定和保持其生物活性。

3.6.4。响应时间

测量电流的响应测量从5 s在间隔10年代60年代。响应时间从5增加到20年代后达到稳定(图9)。

3.6.5。反应底物浓度

底物浓度之间的线性关系从0.5 mg / dL - 250 mg / dL和经常被观察到。当前的方法做了一个双曲线电流响应和胆甾醇乙酸浓度之间的关系。一个重要反应是观察到的浓度500 mg / dL(图10)。

3.6.6。解决和值

的(应用程序)和(应用程序)的斜率和截距值是通过估算来解决当前与胆甾醇乙酸浓度的倒数的情节,也就是说,双倒数情节或Lineweaver-Burk阴谋。的和58.7 mgdL获得的值⁻¹马斯和0.9⁻¹分别(图11)。

3.7。评估当前的方法

3.7.1。线性工作范围和最低检测极限

工作的线性范围和最低检测极限的生物传感器被认为是在审讯生物传感器的性能。在当前方法,标准的图底物浓度和电流之间的反应是用于估计的线性范围和最低限度检测工作。当前生物传感器提供的线性工作范围为0.5 mg / dL - 250 mg / dL和最低检出限的极限是0.5 mg / dL远比先前宣布的生物传感器(表1)。

3.7.2章。分析复苏

通过分析复苏添加酶胆甾醇酯当前生物传感器的可靠性计算(表1)。均值分析复苏100 mg / dL和200 mg / dL添加胆甾醇乙酸酯的分别为99.1%和98.6%,分别。

3.7.3。精度

总胆固醇的浓度计算在同一天(批处理)和在相同的样本存储在4°C一周(批次之间)的血清样本反复检查当前生物传感器的可再生的性质。变异系数的值(CVs) < 0.61%, < 0.98%,在批处理和批次之间(表2)。结果远比各种早些时候报道方法(表6)。

3.7.4。精度

胆甾醇酯的水平增加血清样本是由使用标准的计算方法,也就是说,恩佐工具包和当前的方法,并分析了当前生物传感器(图的准确性12)。的回归方程被用来实现胆甾醇乙酸酯的结果新制作的电极有良好相关性工作吗比标准方法。这些结果表明,当前生物传感器提供了良好的精度。

3.7.5。干预研究

血清中各种物质追究可能干扰响应的方法,没有造成任何重大干扰胆固醇生物传感器的性能。不同的物质对生物传感器的工作表所示3。

3.8。可靠性和稳定性

生物传感器是可靠和稳定的。储存在4°C时,传感器稳定35使用后一个月和第二个月其性能降低(图13)。只有45%的活性生物传感器仍然结束时(图2月14)。的报道相比,生物传感器(表最好显示稳定6)。赵的固定,切,合AuNPs / c-MWCNTs Ag)基础工作电极是由稳定性好,可靠性和重现性。进一步阻止了酶降解和浸出涂层与聚丙烯酰胺的生物传感器也可以提高生物传感器的稳定性。

3.9。新开发的应用方法

不同样品中胆固醇的浓度决定的新开发的生物传感器。表4代表可能健康个体的血清中总胆固醇,包括男性和女性不同的年龄组计算当前生物传感器。总胆固醇水平被发现在154.17和225.89 mg / dL男性和144.56和225.58 mg / dL女性在正常范围内。表5概述了不同工作参数的新生物传感器制作的。

4所示。结论

一个新的生物传感器制造利用Au纳米粒子的导电性能及c-MWCNT粘贴。共价固定的秋,切,合在工作电极上被红外光谱保险。这切/ ChO / HRP-AuNPs / c-MWCNTs修改Ag)电极展品增强灵敏度的线性范围0.5 mg / dL - 250 mg / dL (0.01 mM - 5.83 mM),快速响应时间(< 20年代)、低检测极限(0.5 mg / dL)(0.01毫米),再现性超过55倍,和2个月的稳定。良好的相关性获得了与标准方法。此外,工作电极与聚丙烯酰胺聚合物涂层提供长期稳定和高可重用性生物传感器。工作了主管安培计的方法检测血清总胆固醇。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢物理系,导师Dayanand大学Rohtak, XRD设施和贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学提供,新德里,提供设施SEM、TEM和红外光谱分析。特别感谢将PGIMS Rohtak提供血清样本。