描述鹰嘴豆种子贮藏蛋白质的利用二维电泳结合质谱分析

文摘

蛋白质组学分析是用来映射在长白猪和培育鹰嘴豆种子贮藏蛋白质网络登记入册。蛋白质提取分离的二维凝胶电泳(2 d-ge)在很大范围内3.0 - -10.0固定化pH梯度(IPG)条。比较说明两个不同地域之间的差异表达蛋白质是鹰嘴豆到达使用2 d-ge加上质谱分析。共有600个蛋白质斑点检测到这些登记入册。为胶液蛋白质表达模式显示三个蛋白质斑点调节和其他三个表达下调。用胰蛋白酶消化凝固态,这些差异表达的蛋白质被matrix-assisted激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)显示,45%的鹰嘴豆种子贮藏蛋白质氨基酸的同源性拟南芥。

1。介绍

基因组时代被公认为蛋白质组学作为生物的下一个前沿的研究。目前,生物功能相关的广泛的信息是通过蛋白质组学研究联锁与基因组研究。在植物中,只有很少有物种提供完整的基因组信息。在这种背景下,蛋白质组学技术提供了独特的机会来开发策略探索种子生物学研究为人类造福。比较或定量蛋白质组学是蛋白质组学的主要是利用分区(1,2]。它旨在确定蛋白质概况两个样本之间的差异不同的个体或从不同的治疗方法。蛋白质组学技术提供了一种高通量的技术在许多作物品种的身份验证。多才多艺2 d-ge加上质谱学研究,同时揭示了数以百计的蛋白质不同的亚型和转译后的修改,可能作为品种鉴定的标志。近年来,蛋白质组学特征一直被应用在一些小麦等主要农作物(3)、大米(4],大麦[5],卢平[6,大豆7绿豆],[8)的基因组已经完全或广泛的特点。

豆类营养价值著称,扮演着重要的角色在人类营养和作为补充来改善牲畜增长(9,10]。鹰嘴豆(中投arietinuml .)是世界上第三个最重要的豆科作物(http://www.fao.org/)。在印度,鹰嘴豆种子蛋白质的首选源,因为他们有丰富的消化的蛋白质来源。鹰嘴豆的种子贮藏蛋白质(SSP)主要是由清蛋白、球蛋白、谷蛋白(11]。遗传变异在种质资源池可以用来识别精英鹰嘴豆登记入册的农艺的重要性。比栽培鹰嘴豆长白猪鹰嘴豆到达更加多样化。一些这样的长白猪到达可能含有蛋白质特性优于栽培品种,可进一步用于鹰嘴豆改善(7,12]。因此,比较分析不同基因型种子蛋白质的利用蛋白质组学工具包括长白猪和培养对更好的理解很重要广泛的种子蛋白质。目前尝试描述了鹰嘴豆种子贮藏蛋白质的比较分析在长白猪和培育鹰嘴豆到达使用2 d-ge加上质谱仪可以帮助理解属性相关的功能特征。

2。实验设计

2.1。植物材料

这项研究是与长白猪和栽培鹰嘴豆登记入册。长白猪的鹰嘴豆加入ICC11284有多个抗病特性和源于苏维埃社会主义共和国联盟(苏联)。加入这个长白猪的种子收集从国际半干旱热带作物研究所(ICRISAT) Patancheru,印度海德拉巴(美联社)。印度产地栽培鹰嘴豆var。JAKI9218早熟和高产耐镰刀菌素从农业学院,获得Sehore (MP),印度。

2.2。鹰嘴豆总蛋白提取制备

总种子贮藏蛋白质提取使用过程[6]。提取脱脂鹰嘴豆面粉组成的解决方案7 M尿素,2 M硫脲,2%的家伙,和65毫米4-dithiothreitol(德勤)的比例1/30 (w / v)在室温下搅拌2 h。泥浆离心机在10000 g×30分钟在4°C和上层清液中提取的蛋白质进行了分析。

2.3。2 d-ge分析

提取的蛋白质受到2 d-ge分析按照标准程序(13]。等电点聚焦(IEF)进行使用7厘米,3 - 10 pH值梯度IPG带(美国Bio-Rad)。条是水化一夜之间在一个解决方案包含7 M尿素2% w / v皮套裤,德勤15毫米,0.5% v / v IPG缓冲pH值3 - 10(美国Bio-Rad)包含蛋白质样品。第一维度,300μ克蛋白质样本加载。这些数量是最好的电泳性能进行优化。16 h的被动补液后20°C,等电点聚焦和条执行最初集中在250 V以下3 h到8000伏小时矿物油。带组sds - page之前是平衡总25分钟。第一个维度后,带在平衡平衡15分钟buffer-I(50毫米Tris-HCl缓冲区,pH值8.8包含6 M尿素,w / v甘油30%,2% SDS,和1%德勤)为10分钟,然后平衡buffer-II(平衡缓冲我包含4% w / v碘乙酰胺代替德勤)。平衡后,将被转移到12% sds - page对二维分离以恒定电压200 V的3 h。电泳后,二维凝胶被染色可视化与胶体Coomassie蓝g - 250。蛋白质斑点可视化在白光下280纳米的紫外线透照器。

2.4。凝固态酶消化的蛋白质和MALDI-TOF分析

选择蛋白斑点的切除2 d-ge凝胶改性Gilson吸管技巧,转移到消毒0.5毫升直到消化管并存储在50%的乙醇。除去乙醇溶液后,凝胶块于100年孵化μL蒸馏水在室温下15分钟,然后在40μL 50%的乙腈(ACN)。此步骤重复了三次。随后的上层清液被移除和切除凝胶产物片段是40μL 50% ACN包含25毫米碳酸氢铵移除Coomassie蓝色污点。去除浮层后,凝胶块与40脱水μL 100% ACN和干下真空离心蒸发器。对蛋白质消化、20μL (10μg / mL胰蛋白酶在25毫米包含2.5毫米CaCl碳酸氢铵₂pH值7.8,添加到每个样本和孵化一夜之间在37°C。结果提取胰蛋白酶的碎片从凝胶50% ACN和5%三氟乙酸(组织)声波降解法。提取是干组织完整性和ACN溶解在50%和0.1%。质谱分析,得到的肽混合物结合矩阵解含有10毫克/毫升的cyanohydroxycinnamic酸(CHCA)在ACN 50% / 0.1%组织和应用MALDI-TOF-MS之前样板分析。仪器用于分析4800 MALDI TOF / TOF分析仪(应用生物系统公司),QStar精英耦合节奏Nano MDLC(应用生物系统公司)配备离子喷雾源运行分析师QS软件,和最终3000纳米高效液相色谱系统(Dionex)耦合到一个4000 QTRAP质谱仪(应用生物系统公司)。并购进行视MS / MS扫描模式(全女士扫描范围400 - 2000m / z)。蛋白质被确定的基础上他们的匹配蛋白在其他物种使用吉祥物搜索引擎(http://www.matrixscience.com/)。

3所示。结果与讨论

本研究涉及2 d-ge加上质谱分析的种子贮藏蛋白质转译后的表达式长白猪和培育鹰嘴豆登记入册。蛋白质被解析成7厘米地带有pH梯度的3 - 10组和随后分离质量的基础上,利用sds - page在第二维度。图1显示2 d-ge档案到达在11 - 170 kDa的分子量范围。2 d-ge蛋白质指纹图谱揭示内在的多态模式c . arietinuml .存储蛋白质分子量相同的几个点。不同π指向电荷异质性在长白猪和培养鹰嘴豆登记入册。六个明确的个体差异表达蛋白质点被确定和手动切除,胰蛋白酶消化,为下游MALDI-TOF-MS分析和处理。大多数的蛋白质表现出明显的分子质量的范围10 - 80 kDa登记入册。蛋白质样品受到2 d-ge在重复相同的条件下观察表达模式的一致性。实验质量和π是一致的复制和选择差异表达的蛋白质进行质谱分析。

最后,所有选中的蛋白点进行质谱分析,对候选人蛋白质识别使用吉祥物(http://www.matrixscience.com/)的搜索引擎。放大视图之间的一些蛋白质斑点显示明显的微分表达式长白猪和培育鹰嘴豆登记入册,如图2。这些氨基酸序列的查询搜索发现和豆球蛋白显著的相关性α和β亚基的前兆c . arietinuml .质谱数据显示45%的鹰嘴豆种子贮藏蛋白质氨基酸的同源性拟南芥。一些蛋白质斑点分配通过同源基因的识别产品从其他种子栽培稻只允许氨基酸相对较低(表覆盖值1)。蛋白质组学工具最近被用来测试和检测过敏原,抗营养蛋白质,在许多种子基因型和抗病性等。海苔(Hypnea musciformis)多糖作为诱导子在鹰嘴豆的抗病反应(c . arietinum法蒂玛等。(L)。14]报道诱导植物抗毒素的组件,也就是说,isoflavonoids glycoconjugates,使用质技术。种子贮藏蛋白质和种子成熟过程中蛋白质合成后的种子发展阶段。这些成熟蛋白不同于晚期胚胎形成丰富的蛋白质(LEA蛋白),通常积累高水平在种子成熟的晚期。LEA蛋白的主要功能是低序列复杂性;发生的重复图案;热溶度;和一个明显缺乏定义的结构。

现在分析显示共有6个差异表达的鹰嘴豆种子贮藏蛋白质2 d-ge分析。早些时候的研究Pandey et al。15]虽然比较种子贮藏蛋白质报道大约600个蛋白质斑点在鹰嘴豆2 d-ge和蛋白质组的比较拟南芥和米饭。这些工人报告只有8蛋白在所有三个生物相同。根据这些员工中,有71%的鹰嘴豆核蛋白质是小说,建议进一步调查了解核蛋白质组。在另一项研究中,马尼et al。6]介绍了结合二维电泳方法研究白羽扇豆种子贮藏蛋白质用于基本调查。他们在扩展研究识别复杂的监管网络核蛋白质对脱水反应压力在鹰嘴豆。这些报告未来扩展平台和基础进行调查核蛋白质网络的鹰嘴豆和其他豆类。一些研究人员指出,2 d-ge数据可以使用在气候变化的背景下(16]相对于渗透压力包括干旱、盐、洪水、和金属压力。洪水压力导致转移替代能源的途径。施耐德et al。17]叶肉细胞的空泡的蛋白质组研究大麦叶片镉压力的反应。然而,这样的研究在鹰嘴豆的照亮跟踪基本应力路径负责。本研究探讨差异表达低丰度蛋白质和/或鹰嘴豆种子贮藏蛋白质,蛋白质网络和扩展信息可能有助于更好地了解关于他们的表达模式在成熟度级别。然而,进一步加强,使用第二代iTRAQ肽标签系统等蛋白质组学技术可以用来调查的反应作物对各种农业的障碍/压力。

蛋白质组学提出了一个强大的工具来研究蛋白质含量的变化与植物防御机制。肽质量指纹(及收购MALDI-TOF-MS仍是最复杂和强大的蛋白质鉴定技术。这种方法可以成功地应用和更高效的植物物种的基因组已经测序和注释。没有完整的基因组序列,然而,对于物种est序列可用时,仍然可以进行识别使用这种策略。种特异的EST数据库已被用于蛋白质识别作为一种替代方法在植物物种全基因组序列信息(18- - - - - -22]。目前比较蛋白质组分析长白猪和培育鹰嘴豆到达概要分析了2 d-ge揭示蛋白质差异表达。其中,三个名额是调节和三个蛋白质点表达下调。吉祥物查询搜索显示35%的保守序列的同源性m . truncatula和17%豆球蛋白α和β亚基的前身中投arietinumπ的6.20 l。另外切除鹰嘴豆蛋白表现出与物种的野豌豆属narbonensis在无关紧要的水平。然而,鹰嘴豆种子贮藏蛋白质显示最大的联系拟南芥的45%。这样,目前的调查提供了有用的蛋白质同源性信息的长白猪以及培养登记入册的鹰嘴豆和这些种子贮藏蛋白配置文件可能实际上是有用的生物标记的遗传多样性研究。

相互竞争的利益

作者声明,这项工作由他们是原始的,他们没有利益冲突。

确认

第一作者是感激中央邦委员会科技、博帕尔,印度为资助这个项目。谢谢也由于h·d·阿帕德海耶博士头,资源库,ICRISAT,海得拉巴,印度为种子的供应。作者也感谢Om Kumar博士(Ex)生物技术部门负责人DRDE-Gwalior,印度为提供必要的实验室设施。

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