比较在体外绑定的研究TiCl₂(dpme)₂Ti (ada)₂(bzac)₂,TiCl₂(bzac) (bpme)钛复合物Calf-Thymus DNA

文摘

TiCl的绑定₂(dpme)₂(1),(dpme = 6,6′-dimethyl-2, 2′关于环),Ti (ada)₂(bzac)₂(2),(ada = adamantylamine;bzac = benzoylacetone), TiCl₂(bzac) (bpme) (3),(bpme = 4, 4′-dimethyl-2, 2′-bipyrdine)与小牛胸腺DNA (ct)研究了紫外可见光谱,热变性和圆二色性光谱。在紫外可见研究配合物1,2,3显示红色、蓝色和红色的变化,分别在添加ct-DNA连同hyperchromism。内在绑定常量()计算从紫外可见吸收研究2.3×10³米⁻¹,3.3×10³米⁻¹,7.1×10³米⁻¹为配合物1,2,3,分别。熔化温度的变化(Δ)计算每个复杂2 - 3°C。圆二色性(CD)研究显示蓝色转变为复杂2为配合物和红移1和3随着分子椭圆率上升的复合物。结果显示复杂的绑定模式2不同于1和3。

1。介绍

金属配合物与DNA之间的相互作用是当前的主题调查开发新药物化学领域的一类药物。目前,许多研究领域的过渡金属配合物作为抗菌1,2)和抗癌剂(3,4在文学)等等。过渡金属成为抗癌药物的作用已经探索了在1969年被发现后顺铂。顺铂被发现更有效的对许多类型的癌症,尤其是睾丸和卵巢肿瘤(5- - - - - -8]。它通过与亲核形成共价键N7-sites嘌呤碱基的DNA,暴露于DNA的双螺旋结构的主要槽(8]。但由于其副作用,全球许多努力已经合成的新小说nonplatinum抗癌药物(9- - - - - -12)希望发现新的类药物有更好的化疗效果和减少副作用。第一nonplatinum抗癌药物顺铂后二氯化钛budotitane和titanocene [13]。后来的许多衍生品budotitane和二氯化titanocene合成和测试几个癌症细胞系(14),但钛配合物的作用机制至今仍不清楚。大多数抗癌药物的主要目标,提出了DNA。顺铂在交互与DNA的作用机制是通过槽和它的作用提出了绑定(8]。我们有不同系列的钛配合物合成和执行在体外海拉细胞毒性研究、C6和CHO细胞系(15,16]。在目前的研究论文中,我们扩展了TiCl绑定的研究₂(dpme)₂,(1),Ti (ada)₂(bzac)₂,(2)和TiCl₂(bzac) (bpme), (3)复合物(更好的集成电路₅₀值对海拉细胞线)与客观calf-thymus DNA检查配体与金属的影响,随后在交互类型的机制。结果表明不同的交互方式1,2,3与ct-DNA复合物。

2。材料和方法

2.1。材料

2.1.1。细胞培养

使用的癌症细胞系细胞毒性研究宫颈癌细胞(海拉细胞线),中国仓鼠卵巢细胞(CHO),和老鼠神经胶质瘤(C6细胞株)从印度理工学院获得结合医学(IIIM),印度查谟。这些细胞被培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (pH值7.2 - -7.4)补充胎牛血清(10% FCS)、青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100μg / mL)在37°C下5%的股份有限公司₂湿润的气氛。细胞治疗与不同浓度的复合物溶解在二甲亚砜(DMSO),而未经处理的控制文化只有DMSO对集成电路的计算₅₀价值。

2.1.2。MTT试验

合成的细胞毒性活性复合物对海拉,C6,和CHO细胞株决心使用比色3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑试验(MTT)。这在96孔板的试验进行了一式三份(15,16]。简单,细胞颗粒resuspended 1.5×10完全生长介质⁵细胞/毫升和100μL细胞悬液/被播种在细胞培养板。细胞治疗与不同浓度的复合物和孵化12 h有限公司₂孵化器(37°C, 5%的公司₂和90%相对湿度)。此后,20μ肝癌和L(刚做好的解决方案(5毫克/毫升PBS、无菌过滤)被添加到每个。文化板块在150 rpm轻轻地搅拌5分钟,彻底把MTT拌入媒体,然后孵化4 h 37°C,允许MTT代谢。MTT甲瓒晶体(MTT代谢产物)在100年resuspendedμDMSO的L。然后,盘子被搅拌20分钟后以溶解甲瓒水晶和OD用ELISA测定读者(Biotek协同HT) 570海里。

2.1.3。DNA结合实验

小牛胸腺DNA DNA从密度企业和股票购买解决方案是由溶解适量的DNA双蒸馏水。含钠甲次砷酸盐(pH = 7.4, 1.0×10⁻⁵摩尔L⁻¹氯化钠和0.1×10⁻³摩尔L⁻¹EDTA)用作缓冲溶液使ct-DNA样本。甲次砷酸盐缓冲液的浓度是20毫米。发现解决ct-DNA给的紫外吸光度比260和280 nm超过1.8,表明DNA从蛋白质充分自由。钛化合物溶解在DMSO溶液和三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液进行稀释进一步稀释。

2.1.4。仪器和测量技术

在uv - 1650日本岛津公司分光光度计测定紫外可见光谱在220到320纳米的范围。CD光谱被记录在JASCO j - 815分光光度计从220到320纳米范围内,平均三个扫描。DNA研究融化在卡里100分光光度计(美国瓦里安)配备温度控制器。

2.1.5节讨论。紫外可见测量

吸收实验是由保持钛复合物浓度不变(10μ米)而不同ct-DNA浓度从100年到180年μm .吸收值记录在每次连续添加ct-DNA后的解决方案。吸收数据分析和内在结合常数()计算。

2.1.6。热变性实验

DNA研究是融化在10到90°C的范围与5°C的区别通过保持钛复合物浓度10μ100 M和DNA浓度μM。

2.1.7。圆二色性(CD)的研究

在CD分光光度计最优室与干燥氮气使用前缺氧。的CD光谱ct-DNA孵化与钛复合物在摩尔比率([钛复杂]/ [ct-DNA])的0.1,0.2,0.3,0.4,0.5测量的波长范围220 - 320 nm。光谱的变化是监测一个空白,也就是说,钠甲次砷酸盐缓冲。

2.1.8。制备钛配合物

钛配合物被合成反应四氯化钛和氮含配体在预定的摩尔比率。然而,详细的合成过程和化学物质用于钛配合物的合成已经之前报道(15- - - - - -17]。拟议中的钛配合物的化学结构被用于DNA结合研究已经显示在图1。

3所示。结果与讨论

3.1。电子吸收光谱

吸收光谱都记录了一个固定钛配合物的浓度1,2,3(10μ米)的浓度增加ct-DNA (10 - 180μ米)(图2,3,4)。吸收光谱的复杂1,我们观察到典型的复杂结合ct-DNA增色效应后,从270到290纳米(图的转变2)。一些变化在钛结构复杂以及DNA在滴定曾被观察到。钛复杂的结构似乎得到修改和修改结构与ct-DNA交互。ct-DNA吸收强烈在260海里,但随着ct-DNA钛复杂的解决方案中,有一个从260年到280纳米波长的变化如图2。复杂的吸收光谱2在250纳米(图显示吸收带3)。外加ct-DNA钛复杂,吸收红移和增色效应。进一步增加ct-DNA原因增色效应以及轻微的蓝移。这种类型的行为表明DNA构象的变化与金属络合物在互动(18]。据报道在文学,减色性结果收缩的DNA螺旋轴以及DNA分子的构象变化;然而,hyperchromism结果从二次损伤的DNA结构(19]。观察hyperchromism效应可以是由于静电相互作用带正电的钛化合物和带负电荷的磷酸骨架在双螺旋结构的外围ct-DNA [20.]。最初的复杂2得到稳定后为复杂的过程一样1但由于笨重adamantylamine和benzoylacetone它变得不稳定。复杂的吸收光谱3显示在240和280海里(图吸收带3)。已经观察到,除了增加ct-DNA钛复杂(复杂3在240 nm),吸收带被转换为245 nm和明显的增色效应。然而,吸收波长在280海里不会显示任何转变。hyperchromism的程度表明部分或nonintercalative绑定模式,如静电力、范德瓦尔斯相互作用,氢键和疏水作用。结果表明,复杂的模式绑定ct-DNA包括强大的堆积DNA碱基对之间的交互和芳香组复杂。内在约束力的常数()的所有三个配合物是通过一块计算的与[ct-DNA]利用Wolfe-Shimmer方程(见(1从光谱滴定数据)(21,22]: (DNA) ct-DNA的浓度,是明显的消光系数,对应于灭绝的复杂的自由形式,和是指在束缚型消光系数。结合常数的计算(),消光系数测定波长的最大吸光度在所有三个配合物。在配合物1,2,3消光系数被发现在283、252和245海里。内在的价值绑定常数()计算是2.3×10³米⁻¹,3.3×10³米⁻¹和7.1×10³米⁻¹为配合物1,2,3,分别。结果支持这一事实结合DNA复合物具有不同的亲和力23]。绑定常量(越高)值获得复杂3表明更多的碱基对是用于绑定比复合物1和2。复杂的高亲和力3高的细胞毒性活动对海拉细胞线(24]。复杂的3对海拉细胞被发现更有效的与一个集成电路吗₅₀值为3.3μ米,在我们之前的研究中提到的(16]。的集成电路₅₀复合物的值(15,16]1,2,3列表在表1。我们的结果证实与Pd (II) 2, 2′关于复合物结合ct-DNA,增色效应是在同一行,绑定常数()值也几乎相同的大小(Pd (II) 2, 2′关于复杂是3.78×10³米⁻¹)[25]。观察到在所有三个配合物可以是由于hyperchromism共价相互作用的存在,也就是说,静电相互作用,氢绑定,槽绑定(主要或次要)与外部ct-DNA复合物的结构建议绑定和稳定的ct-DNA复合物26]。

3.2。热变性的研究

复杂的稳定性1/2/3+ ct-DNA进一步证实了DNA融化概要文件。我们发现DNA的熔化温度和TiCl的熔化温度₂(dpme)₂/ Ti (ada)₂(bzac)₂/ TiCl₂(bzac) (bpme) + ct-DNA复杂()。熔化温度的变化()被发现近3°C,如图5(在温度改变计算,在那里,和融化温度在存在和缺乏钛复合物、职责)。熔点是由观察吸光度的变化。ct-DNA显示吸光度的变化在75°C,而TiCl₂(dpme)₂/ Ti (ada)₂(bzac)₂/ TiCl₂(bzac) (bpme) + ct-DNA显示吸光度的变化在78°C。人们已经发现,有3°C左右的熔化温度的变化。这个小的熔化温度变化ct-DNA可以称为槽钛复合物的相互作用的骨干ct-DNA [27],因为众所周知,槽绑定和静电绑定与磷酸盐骨架的DNA结果在熔化温度变化不大,而夹层的绑定模式产生重大变化在DNA双螺旋结构的熔化温度28]。因此夹层模式的可能性排除。

3.3。圆二色性(CD)的研究

ct-DNA显示了两个保守的CD乐队在紫外区域:积极的乐队在270海里由于基地叠加和消极的乐队在240 nm由于右手螺旋性的DNA。DNA的CD光谱变化的复杂1,2,3如数据所示6,7,8,分别。CD光谱的形状依赖于复合物添加的浓度(1,2,3)。当ct-DNA孵化与金属配合物(1,2,3),分子椭圆率上升是在正面和负面椭圆率。-带的强度(下降)会转向零级或以上零水平和强度的积极乐队(增加)显示在所有三个案例(重大的深色转变数字6,7,8)。与金属络合物在孵化的DNA1,增加分子的椭圆率值的积极和消极的椭圆率乐队一起展示了大约10 nm的红移。已经观察到的频谱(图6),当我们增加了复杂的浓度2ct-DNA,蓝移约8 - 10 nm已被观察到。然而,当ct-DNA与金属络合物孵化3(图7),分子椭圆率上升是在正面和负面椭圆形乐队以及红移约6 - 7海里。这可能是由于这一事实的DNA结合钛复合物影响DNA的构象变化。这种构象的改变是由于静电作用沿磷酸盐骨架和网站之间的基地有部分负电荷和带负电荷的磷酸基。有些研究人员认为,这种类型的CD光谱的变化可能反映了一个从b DNA结构转向一些贡献从一个像构象(29日),但这种现象可能是由于槽绑定稳定DNA的右手B形式(30.]。这种增强的CD的DNA在270纳米左右将扭曲诱导DNA结构(31日]。

4所示。结论

在目前的研究中我们报告ct-DNA绑定之前报道钛复合物的研究。DNA结合研究进行了使用吸光度光谱、圆二色性,和热变性技术。从这些研究中,似乎已经得出结论,钛配合物与DNA结合导致其结构变形按复合物的紫外可见和熔化行为,而CD研究表明,化合物2表现的不同1和3。此外,类型和配体的立体化学发挥重要作用在目标识别和互动。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者要感谢技术研究所主任Hamirpur,印度为提供必要的实验室设施开展工作。

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