转录激活p53在寒冷诱导在13-Lined麻木地松鼠Ictidomys tridecemlineatus

文摘

转录因子p53位于中心的多个通路相关的细胞对压力的反应。通常被称为一个肿瘤抑制,它负责启动不同的行动保护基因组的完整性,从细胞周期阻滞细胞凋亡。本研究调查的规定p53蛋白在冬眠13-lined地松鼠Ictidomys tridecemlineatus在torpor-arousal周期的多个阶段。成绩单和p53蛋白水平均升高在骨骼肌早期和晚期蛰伏阶段的冬眠周期。核本地化p53在麻木,也增加了,这是与增加其DNA结合活性和p53的表达转录目标p21CIP,gadd45α,14-3-3σ。p53的增加转录活动似乎是独立于其磷酸化Ser-15, Ser-46,和ser - 392,符合一个缺乏检查点激酶激活在麻木。序列分析显示独特的地松鼠p53蛋白氨基酸替换,可能导致增加蛋白质稳定nonhibernators相比。总的来说,研究结果提供证据的潜在作用p53在麻木的保护骨骼肌。

1。介绍

冬眠是一种自适应策略以戏剧性的变化在生理学、动物的行为,和生物化学反应环境压力增加。这种表型可塑性不同哺乳动物组织中,甚至在血统龙延伸至单孔目动物和有袋动物1]。啮齿目包含一些最深入研究冬眠的黑熊们,包括本研究的主题,13-lined地面松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)。即tridecemlineatus、中央北美草原的居民通常会冬眠从10月到4月,季节性变化,增加代谢需求时会见了限制食物供应。冬眠的即tridecemlineatus特点是周期性唤醒和再入低代谢状态(1]。生理、动物经历身体温度的降低(从37°C至1 - 2°C)、心率(从200 - 300 3 - 5次/分钟),灌注率(< 10%的正常)和呼吸率(从100 - 200年到4 - 6次/分钟)在进入麻木(1- - - - - -3]。总的来说,代谢可以降低2 - 4%的发热的利率(4]。尽管有这些翻天覆地的变化,即tridecemlineatus从麻木中经历没有不良影响,包括有限的肌肉萎缩的迹象,尽管几个月的活动(5]。

虽然休眠的生理和行为变化研究了一段时间,对底层的分子机制。以降低代谢率来降低全球转录和翻译(2,3]。基因继续转录和翻译可能会从细胞的角度了解冬眠的关键。一个基因的调控在冬眠期间可能被证明是必要的,是p53。p53蛋白是一个著名的转录因子由于突变在癌症的患病率(> 50%),但其抗癌特性的来源在于其融入多种逆境应答通路(6]。压力因素如缺氧、热或冷休克,DNA损伤,或营养不足可以通过posttranslation修改(即激活p53。,phosphorylation, methylation, and acetylation), resulting in its transcriptional activation or repression of numerous downstream target genes [7]。这些转录程序会导致不同的细胞反应,尤其是细胞周期阻滞,衰老和细胞凋亡6,7]。细胞周期阻滞特别是主要涉及p53下游目标导致离解或核的细胞周期蛋白/ Cdk复合物,促进细胞分裂所必需的事件(如DNA复制,中心体复制,和有丝分裂纺锤体的形成)(8,9]。MDM2 p53的重要调节器,这除了是一个转录目标通过ubiquitin-proteasome p53促进其降解途径(10]。

鉴于冬眠地松鼠能够经历戏剧性的生理变化,证明高压力和繁重的nonhibernating动物,而能够保持他们的组织和器官的完整性和功能,它是合理的怀疑p53鉴于其的参与作用,保护细胞,通过细胞周期阻滞能量守恒。这项研究调查了p53的转录和蛋白质水平变化及其下游的几个目标的骨骼肌即tridecemlineatus在冬眠。我们表明,p53表达水平和转录活动期间升高麻木,这是监管转化水平和独立的转译后的修改。我们还确定几个地松鼠特定氨基酸替换,可能导致p53的整体提升稳定性可以协助转录激活在麻木。

2。材料和方法

2.1。动物

Thirteen-lined地面松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)被许可捕捉器(TLS研究,密歇根州)和交付给j . m . Hallenbeck博士的实验室(国家神经疾病和中风研究所、国立卫生研究院,医学博士)。动物治疗方案是相同的如前所述详细(11]。松鼠被斩首的牺牲了六个不同的时间点。发热的控制条件(EC),松鼠牺牲后活跃在4°C 3天没有进入了一个新的布特麻木。在其他条件,松鼠被牺牲在进入麻木(EN),与体温()降至18-31°C, 1 - 2天后在麻木(ET)稳定在5 - 8°C, 3 - 5天后在麻木(LT)稳定在5 - 8°C,在早期兴奋(EA)上升到9 - 12°C,在interbout觉醒(IA)恢复~ 37°C至少18 h。组织切除,存储在液态氮,和运输在干冰卡尔顿大学,在那里,他们储存在−80°C到使用。依法松鼠都关心动物福利法案和所有动物实验得到美国国立卫生研究院的事先批准。

2.2。总RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成,rt - pcr

使用之前,所有材料都接受0.1% (v / v) diethylpyrocarbonate (DEPC)和热压处理过的。总RNA分离使用标准试剂盒技术从地面松鼠肌肉组织的六个时间点,有四个独立的样品准备好每个时间点。RNA质量评估使用吸光度的比值在260和280海里,另外1.5%琼脂糖凝胶上电泳确定18岁和28 s核糖体的完整性。

整除3μg的RNA从每个样本稀释了7μL DEPC水。一个μ200 ng / LμL oligo-dT底漆被添加到每个样本,其次是孵化在65°C 5分钟。四个μL 5 x第一链缓冲区,2μL(0.1德勤,1μL(10毫米核苷酸(BioShop), 1μL (M-MVL逆转录酶(表达载体)添加到每个管。样本在42°C的环境为45分钟互补脱氧核糖核酸的合成。一个10⁻¹和10⁻²稀释的cDNA创建并存储在−20°C到使用。聚合酶链反应(PCR)进行了如前所述[12]。引物用于这项研究如下:5′-CCTGCTGATGGAACGTCTCT-3′, 5′-GTAAGCTGTTCATGGTAGGC-3′(α微管蛋白),5′-GAGGTCGGCTCTGACTATACC-3′, 5′-ATTCAGCTCTCGGAACATCTC-3′(p53),5′-AACCTGCTCTCCGTGGCCTAC-3′, 5′-CTCGTCGAAGGTGGTCTTGG-3′(14-3-3σ),5′-GCCAAGCTGCTCAACGTAGA-3′, 5′-GATGTTGATGTCGTTCTCGC-3′(gadd45α),5′-CAATCAGCAGGAACCGTCAG-3′, 5′-GAGTCCTGATCCAACCAATC-3′(mdm2)。

2.3。组织准备和免疫印迹

冷冻组织样本中均质1:5 (w / v)均化缓冲(20毫米玫瑰,pH值7.5,200毫米氯化钠,0.1毫米EDTA,氟化钠10毫米,1毫米Na₃签证官₄,10毫米β甘油磷酸盐)补充了一些晶体PMSF和1μL蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(Sigma-Aldrich)。样本离心后的上层清液收集在4°C g在10000×15分钟。蛋白质浓度的样品通过Coomassie蓝染色方法测定使用BioRad准备试剂,与牛血清白蛋白作为标准。蛋白质浓度的样品被调整到10μ克/μL与均化缓冲,然后稀释到5μ克/μ通过添加等量的L 2 x SDS缓冲区(100毫米Tris-base, 4% w / v SDS, v / v甘油20%,v / v溴酚蓝,0.2%和10% v / vβ巯基乙醇)。样本加热5分钟在95°C和储存在−20°C到使用。

免疫印迹过程进行了如前所述[13]。抗体用于本研究如下:p53(# 2527,细胞信号),phospho-p53 (Ser15;# 9284,细胞信号),acetyl-p53 (Lys382;# 2525,细胞信号),phospho-p53 (Ser392;# 9281,细胞信号),phospho-p53 (Ser46;# 2521,细胞信号),phospho-Chk1 (Ser296 # A00727-40 Genscript) phospho-Chk2 (Thr68, GTX61178 Gentex), MDM2 (sc - 813号,圣克鲁斯生物技术),和GAPDH(# 2118,细胞信号)。

2.4。核提取物

核提取准备的骨骼肌EC和LT时间点使用修改后的版本的方法描述Dignani et al。14]。大约0.5克的组织样本中均质1毫升的均化缓冲(10毫米玫瑰,10毫米氯化钾,10毫米EDTA, 1毫米德勤,pH值7.9)的10μL蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(Sigma-Aldrich)。样本离心机在10000 g×10分钟在4°C。包含细胞质的上层的部分被删除和存储供以后使用。球在150年resuspended剩余组织μL核提取缓冲(20 mM玫瑰,400毫米氯化钠,1毫米EDTA, 10% v / v甘油,和1毫米德勤)为1.5μL蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(Sigma-Aldrich)和1 h在冰上孵化而摇摆。再悬浮离心机在10000 g×10分钟在4°C。包含核分数的上层清液被收集。核分数的一部分存储在−20°C DNA结合使用的酶联免疫吸附试验(ELISA),而其余核分数被视为上述用于免疫印迹。使用组蛋白H3的主要抗体免疫印迹(# 9715,细胞信号)证实了核提取物的纯度。

2.5。DNA结合ELISA

核提取物的浓度如上所述调整到10μ克/μL与核提取缓冲。井的96孔酶标涂上探讨了链霉亲和素与双链1 h RT biotin-labelled p53的包含绑定序列的DNA探针:5′-TACCCGGGCATGTGCTAAGCATGCTG-3′, 3′-CAGCATGCTTAGACATGCCCGGGTA-5′。与PBST洗涤三次后(PBS Tween-20 0.05%),每个孵化了20μg蛋白质样品1 h RT (~ 24°C)在5°C或冰。这是紧随其后的是清洗和探测与p53主要抗体(PBST 1: 1000) 1 h RT风潮。洗后,探讨了油井HRP-linked二级抗体(PBST 1: 4000) 1 h RT的风潮。与PBST四次洗涤后,解决方案包含3、3′,5、5′-tetramethylbenzidine被添加到每个对p53绑定检测。反应是停止的1 M盐酸和吸光度读450海里(655海里),参照记录和用于计算相对p53 EC和LT样本之间的DNA结合。

2.6。统计数据

西方的屁股成像及其相对强度量化使用ChemiGenius能与GeneTools程序(SynGene)。相对蛋白质含量归一化到管家GAPDH在mRNA水平正常化α-tubulin。数据被绘制为±SEM手段和测试与学生的意义以及(两个数据点)或单向方差分析(三个或更多的数据点;评估的显著差异,Holm-Sidak测试)接受为显著。

2.7。p53蛋白的序列分析

蛋白质序列p53的检索Ictidomys tridecemlineatus(基因身份证:101957738),Erinaceus europaeus(基因身份证:103113788),鼠耳蝠brandtii(基因身份证:102240449),鼠形(基因身份证:24842),Cricetulus将(基因身份证:100682525),智人(基因身份证:7157)猕猴属fascicularis(从NCBI基因身份证:102135998)和使用Geneious对齐序列分析软件。地松鼠的氨基酸改变残留在位置被保存在其他四个nonhibernating哺乳动物被确定为独特的p53替换。

3所示。结果

3.1。p53的表达升高在麻木,但不是不同的修改

p53蛋白对posttranslation修改多个站点,其中至少有18个网站磷酸化和乙酰化作用(至少1015]。它已经表明,转译后的修改不需要对整体p53激活;然而,磷酸化和乙酰化在不同站点可以稳定p53导致随后的转录激活。p53的水平磷酸化丝氨酸15,46,392年和382年在赖氨酸乙酰化是骨骼肌的调查即tridecemlineatus在麻木的六个阶段。在骨骼肌、总p53在早期(大约增加了双重的)和后期()麻木()。有趣的是,没有明显变化的转译后的修改p53形式测量在这个研究。这些结果表明p53可能激活通过upregulation麻木中总p53蛋白水平。

3.2。监管机构的p53在麻木不差异表达

MDM2蛋白是E3泛素连接酶在正常和相应条件下功能的主要对手p53通过连续退化monoubiquitination [10]。MDM2蛋白水平的调节倍在早期兴奋,同时保持不变,其他麻木时间点(图2(一个))。在细胞DNA损伤、缺氧等压力,p53可以增加蛋白质转译后的修改通过破坏稳定的p53-MDM2交互。检查点激酶(分)1和2是两个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化激活在DNA损伤的,可以反过来使磷酸化p53在Ser-15缓解其抑制MDM2 [16]。我们测量的磷酸化水平Chk1和相关的激活残留。如图2 (b)磷酸化Chk1 (ser - 296)是增加了倍在进入麻木,而在其他时间点保持不变。与此同时,磷酸化水平的Chk-2(刺- 68)在整个torpor-arousal周期保持不变。缺乏Chk1/2激酶激活在蛰伏阶段是符合我们的观察一个稳定p53磷酸化水平在麻木(图1)。这些结果表明,通过规范化DNA损伤激活p53通路可能没有发生在骨骼肌,麻木的upregulation MDM2在早期兴奋或许renormalize p53蛋白质含量作为退出冬眠动物。

3.3。核级别的p53在麻木和DNA结合活性增加

p53发挥它的功能,它必须被运送到细胞核和绑定到目标基因的启动子。p53蛋白在核溶解产物的相对量比较控制条件和后期骨骼肌中麻木。如图3(一个),核p53水平明显升高了近6倍()晚麻木而发热的控制水平。这增加核p53蛋白在后期麻木也由p53 DNA结合活性的增加在后期麻木(图3 (b))。p53 DNA结合活性升高了麻木倍比控制;当绑定也获得了类似的调查结果分析进行了5°C,与后期麻木溶解产物也显示倍增加p53 DNA结合活性。

3.4。成绩单p53的表达及其目标升高在麻木

确定p53的增加核表达和DNA结合活动后期麻木伴随着增加下游p53基因的转录,我们测量p53下游靶基因的转录水平14-3-3σ,gadd45α,p21以及的mRNA水平p53的抑制剂,其原则mdm2的骨骼肌即tridecemlineatus(图3)。的mRNA转录水平p53显著升高在早期麻木()、晚麻木()和interbout兴奋(),而mdm2记录大多是在整个麻木周期稳定。p53下游基因的转录水平14-3-3σ在早期和晚期麻木(显著增加和、职责),同时记录级别的gadd45α增加在晚麻木()和转录水平的p21增加在晚麻木()和早期兴奋()与控制。这些结果表明,总p53蛋白质含量的增加在麻木是伴随着升高p53信使rna水平,而这反过来会促进核p53积累的增加和随后的下游基因的转录。

3.5。独特的p53蛋白序列的识别

人类的p53蛋白是最常见的突变在癌症的目标,超过50%的癌症肿瘤表现出p53基因的突变位点(17]。尽管大多数p53突变导致非功能性蛋白质,基因突变而导致的增益函数也被报道(18]。确定地松鼠p53蛋白包含任何独特的氨基酸替换,可能导致其微分调节,我们一致地松鼠p53蛋白序列两个冬眠和四个nonhibernating哺乳动物识别潜在的独特的氨基酸替换。如图5和表1,共有12个地松鼠独特的氨基酸替换被确定在守恒在四个nonhibernating物种的残留物。的12个松鼠特定p53氨基酸,只有3残留物(Asn 24、Pro 299和Pro 362)守恒在至少一个其他冬眠动物(布兰德的蝙蝠,鼠耳蝠brandtii,或欧洲的刺猬,Erinaceus europaeus)。赖氨酸的替换参数在290年(292人类)和Ser位置职业地位364(366人类)地松鼠是特别感兴趣的,是相关的先前的研究这两个氨基酸残基转译后的修改和参与调节p53的稳定性。赖氨酸- 292残留在人类被MKRN1乙酰化和有针对性的(Makorin无名指蛋白质)促进p53退化,突变的赖氨酸- 292参数被证明通过阻力显著增加p53稳定向MKRN-1介导的降解(19]。同时,磷酸化的ser - 366残留在人类IkappaB激酶2 (IKK2)导致p53泛素化和随后的退化,而氨基酸替换在ser - 366 Ala导致p53的增加稳定和其转录活性(20.]。这些结果表明,独特地松鼠p53序列的变化可能导致潜在的蛋白质稳定性增加,这可能帮助其提高骨骼肌蛋白质表达和转录活动在麻木。

4所示。讨论

冬眠是觉的状态,特征是全球能源消耗以降低代谢抑制要求延长生存。虽然很大程度上抑制转录,多项研究表明,选择基因的表达升高在麻木促进适应性对觉的状态,促进了许多压力诱导转录因子,包括FOXO Nrf2, Nfk -β(21- - - - - -23]。在这项研究中我们为特征的规定p53在冬天的骨骼肌地松鼠torpor-arousal周期,以确定激活p53之间中间蛰伏阶段的冬眠。锅等人的最近的一项研究显示,激活p53在肝脏组织的地松鼠松鼠夏天麻木而活跃,而p53显示肝DNA结合活性的增加;它并没有导致p53靶基因转录增加(24]。结合我们当前的结果,这表明p53监管组织特定的方式在麻木。此外,p53的差异转录活动观察到锅等人也可以部分归因于使用夏季活跃松鼠作为对照组,其中展品季节性基底基因和蛋白质表达的差异相比冬眠准备冬天松鼠用于本研究[25]。

激活p53蛋白是一种转录因子,针对多个压力,包括缺氧、热休克,氧化应激和DNA损伤(6]。在基因的转录激活p53结果的功能,促进细胞周期阻滞,细胞凋亡,细胞衰老;然而,最近的研究也表明p53在调节细胞新陈代谢的作用26]。p53蛋白含有大量的残留,转译后的修改,包括磷酸化和乙酰化作用,大多数这些残留物快速修改后细胞应激(15]。有趣的是,我们观察到无显著变化,p53蛋白的磷酸化和乙酰化状态在整个torpor-arousal周期,这在很大程度上是缺乏一致检查点激酶激活(图2 (b))。检查点激酶1和2被激活,共济失调毛细血管扩张突变(ATM)和共济失调毛细血管扩张和Rad3-related (ATR)磷酸化蛋白质的DNA损伤反应(27),进而使磷酸化p53启动转录反应;我们的数据表明,在麻木不激活p53 DNA损伤。尽管规范激活p53的磷酸化没有观察到,总蛋白质和p53的mRNA表达调节在麻木阶段(图1)缺乏类似的增加其主要阻遏MDM2(图2(一个))。总p53蛋白质含量的增加在麻木也与核p53蛋白质含量的增加和DNA结合活性,随着p53目标基因的转录(增加数据3和4)。虽然我们观察到一个健壮的海拔在核p53积累在后期麻木(~ 3),这是伴随着只有适度增加p53 DNA结合活性和下游基因表达(~ 1.5 - 1.8倍)。类似的观察不足招聘核p53的DNA也报道了锅et al .,这表明,患病率增加核p53在麻木地松鼠肝脏只有导致p53 DNA结合(增加40%24]。这些结果表明,其他代数余子式和监管机构可能会要求核的绑定和激活p53目标DNA,和总水平的核p53水平可能不是其转录活性成正比。有趣的是,尽管p53蛋白是调节在早期和晚期阶段,麻木的增长目标转录水平很大程度上只是在晚麻木(图观察4 (b))。的成绩单mdm2本身也是一个下游p53的目标,形成一个自动调整的反馈回路控制p53活动(10];然而,的mRNA水平mdm2晚麻木当p53激活期间保持不变。有趣的是,MDM2蛋白水平的调节在早期兴奋~ 1.5倍;这可能是由于小(无意义的)海拔mdm2在mRNA水平等和LT相比控制(图4(一))。p53的选择性增加目标基因在转录激活表明p53的亲和力不同启动子的下游目标多种多样,和独特的转录辅活化因子可能需要不同的目标在p53基因激活。在觉醒阶段,高架的表情14-3-3,p21,和gadd-45α观察到在后期麻木规范化回控制水平。据推测,造成的减少mRNA水平减少后期p53蛋白的表达唤醒麻木,导致下游的restabilization p53基因的表达。p53的褶皱感应下游靶基因在本研究范围内的1.6 - 1.75倍,尽管这可能被认为是次要的;之前的研究表明,稳定的p53芹黄素,类黄酮,可以抑制UV-induced皮肤肿瘤发生在老鼠,结果在一个小但重要的1.5 - 2倍增加p21表达(28]。此外,早期的研究表明,在细胞周期抑制剂p16略有增加1.5倍耐对癌症有显著影响(29日,30.]。

骨骼肌可以接受萎缩在长时间不用或固定;有趣的是,冬眠哺乳动物是保护正常的肌肉损失,尽管长时间的不活动期间麻木。虽然冬眠的黑熊们抗肌肉萎缩,Andres-Mateos等人的研究表明,肌肉组织损伤后再生在冬眠哺乳动物实际上是延迟而激活松鼠和表明肌肉分化抑制在麻木,直到受伤(6 - 8周后31日]。激活p53蛋白在最近的研究里它又显示出它的转录抑制myogenin (myod),肌原性的监管因素在肌肉分化中起着至关重要的作用32]。由p53建议镇压myogenin可能有助于防止异常分化或肌原性的细胞增殖在不利的激活p53 /压力的细胞环境。激活p53在麻木中观察到我们的研究也可能功能以类似的方式消极调节肌肉分化在麻木和符合我们之前的观察减少myod在麻木(mRNA水平33]。激活p53可以作为潜在的信号机制推迟不必要的骨骼肌分化在麻木,使重定向和优先级的能量消耗来支持功能至关重要的组织如心脏和大脑在冬眠。

有趣的是,我们观察到两个松鼠特定氨基酸残基序列替换,在人类通常修改信号p53 MKRN1降解和IKK2(图5)[19,20.]。MKRN1转录coregulator和一个目标p53的E3连接酶降解通过承认K292氨基酸残基。K292残渣是高度保守的秀丽隐杆线虫人类和突变在几个不同的人类癌症19]。p53的突变K292和邻近K291残留高度增加p53稳定,只有14 - 18%降解存在MKRN1相比减少了70%的野生型(19]。与此同时,磷酸化的p53 IKK2 S366导致其泛素化β-TrCP1盒蛋白质和随后针对退化MDM2的独立20.]。K292和S366保守氨基酸残基,必须促进p53退化在人类,都是改变地松鼠残留,可以不再被乙酰化(K292R替换)或磷酸化(S364P替换)。其它氨基酸变化的潜在利益是赖氨酸Asn替换位置24的地松鼠。p53此前报道的K24N突变在人类妊娠期罕见的癌症;虽然这p53的突变增加了灵活性transactivation域,它似乎并没有显著改变其与MDM2 [34]。

p53的细胞水平通常是由它的速度是通过ubiquitin-mediated退化的途径,而通过的速度合成(35]。虽然MDM2功能的主要对手p53表达,我们的研究表明,p53表达的增加没有MDM2蛋白水平的变化也会导致p53的激活转录活动。尽管独特的氨基酸残基的功能意义地松鼠需要进一步分析来确定它的功能,它可以表明这些替换可能导致p53的整体提升稳定在麻木当MDM2水平不受影响。独特的氨基酸改变冬眠的黑熊们曾被报道和建议作为潜在的进化适应方法导致表型的改变。胰岛素生长因子- 1受体在长寿和冬眠鼠耳蝠brandtii蝙蝠包含独特的高度保守的氨基酸替换single-transmembrane域,这被认为是与胰岛素基因表达的改变相关的蝙蝠在长寿GHR所观察到的类似^−−/老鼠(36]。序列的变异glycerol-3-phosphate脱氢酶(G3PDH)的地松鼠也被报道,具有独特的氨基酸替换将有助于减少刚性结构与其他哺乳动物相比,这可能会占更大的热稳定性G3PDH酶功能在不同温度(37]。

5。结论

在这项研究中,我们报告的激活p53转录反应迟钝阶段期间13-lined地松鼠。增加p53活动似乎是独立于选择转译后的修改检查在这项研究中,而是p53蛋白表达增加的结果。我们还发现了两个氨基酸替换在独特的地松鼠p53蛋白序列与其他nonhibernating哺乳动物;特别感兴趣的K290R和S364P替换这两个残留导致p53在人类的泛素介导的降解。总之,我们的结果表明,激活p53转录反应是由其upregulation在转录和翻译水平,并需要进一步的实验来阐明的意义地松鼠特定的氨基酸替换,和这些变化是否导致p53稳定nonhibernating哺乳动物相比的变化。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

约书亚Hefler Cheng-Wei吴同样起到了推波助澜的作用。

确认

感谢是j·m·层编辑论文的审查。这项研究是由一个发现格兰特从自然科学与工程研究委员会(NSERC)加拿大的肯尼斯·b层(# 6793),NSERC Cheng-Wei Wu博士奖学金,NSERC USRA Hefler约书亚。

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