调节的影响Eschscholzia californica生物碱在重组GABA_一个受体

文摘

花菱草(Eschscholzia californica可汗。)包含多种天然化合物包括几个这种植物只在发现生物碱。因为镇静、抗焦虑和镇痛作用,这种草药在许多国家目前在药店销售。然而,我们在分子水平上理解这些生物的影响仍缺乏。生物碱中发现大肠californica可以假设在GABA采取行动吗_一个受体,广泛表达于大脑主要抑制性中间神经元。电生理研究重组α₁β₂γ₂伽马氨基丁酸_一个受体显示没有影响的N-methyllaurotetanine浓度低于30μ然而,m . ()-reticuline表现积极的变构的调制器α₃,α₅,α₆GABA的亚型_一个受体。天线部分的镇静剂属性大肠californica被分配到chloride-current调制()-reticulineα₃β₂γ₂和α₅β₂γ₂伽马氨基丁酸_一个受体。有趣的是,α₁,α₃,α₅没有显著的影响()-reticuline 1 2-tetrahydroreticuline可待因和morphine-suspected ()-reticuline代谢物在啮齿动物的大脑。

1。介绍

加州罂粟在民间医学的镇静剂,抗焦虑药和antinociceptive效果(1- - - - - -4]。这些影响通常分配给protopine和allocryptopine(见图1)。这两种生物碱作为弱刺激器GABA的绑定_一个在老鼠大脑受体受体激动剂(5,6),抗炎剂(7)和乙酰胆碱酯酶抑制剂(7,8]。另一个aporphine生物碱分离出这种植物,即N-methyllaurotetanine (NMT),据报道,作为对手在血清素5受体(EC₅₀= 155海里,海里)(9]。Protopine和allocryptopine也发现阻止人类5 -羟色胺和去甲肾上腺素转运蛋白(hSERT和NERT)和具有抗抑郁效果在动物模型10]。然而,目前尚不清楚(也就是典型的药房准备。,30.0 mg of dry plant material per capsule) contain sufficient quantities of these alkaloids required to induce desired biological effects. Even though the presence of NMT in this plant has been clearly established, its content in the aerial parts of this perennial herb is currently unknown. Furthermore, it is not known whether or not this molecule interacts with the GABA_一个受体。

在目前的工作中,我们研究了从天线部分中提取总生物碱大肠californica通过两个方法。首先,标准氯仿/ SDS法(11]依靠离子配对的生物碱类阴离子洗涤剂(方法)。第二,干燥的植物是长时间浸渍在甲醇溶液,溶液的pH值调整,和生物碱提取到二乙醚(12)(B)方法。生物碱中包含不同的分数进行分析使用的二极管矩阵分光光度计以及高效液相色谱法和electrospray-tandem MS / MS谱谱/女士)。本研究的主要目标是确定活动的原则大肠californica负责报道镇静和抗焦虑效果(1- - - - - -4]。最后,我们想结束这种草药是否有潜力取代一些常用的合成药物和抗抑郁药睡觉。

2。材料和方法

2.1。化学物质

Protopine盐酸盐(≥98%)和α-allocryptopine(≥98%)来自Sigma-Aldrich(瑞士)。(年代)- (+)-Reticuline盐酸(95%,> 90% ee), (R)- (−)-reticuline(95%),和1,2-tetrahydroreticuline碘化(95%)在GABA在电生理实验中使用_一个受体是来自多伦多(加拿大)研究化学物质。硫酸吗啡盐五水化物(99.8%)和可待因认证参考材料(1毫克/毫升甲醇)从σ。Caryachine(98%)和O-methylcaryachine(98%)所提供的样本请Stefan Gafner(美国缅因州汤姆的)。

2.2。生物碱提取分析

生物碱提取过程(方法一)用于本研究相比稍微修改原始的生物碱提取的协议Chelidonium majus(11]。

方法。5克的干燥植物材料(Eschscholzia californica、Arcopharma瑞士一个mm 57426001)绿色粉末的形式提取到100毫升的甲醇(15分钟60°C)。有机溶剂(95毫升)当时在减压蒸馏在旋转蒸发器。绿绿的溶液被稀释50毫升蒸馏水和溶液pH值调整到1.0(盐酸drop-wise增加10%)。随后,100毫克的0.2 wt %十二烷基硫酸钠(aq)添加和氯仿提取生物碱(3×50毫升)。有机相用无水干Na₂所以₄和氯仿使用旋转蒸发器蒸发在40°C。最后,粗提物在10毫升甲醇溶解,过滤使用5.0μ米紧随其后的是0.45μ聚四氟乙烯微型滤波器。植物提取物是受到一个薄层色谱法(TLC)在二氯甲烷/甲醇(18:2)含0.1%三氟乙酸作为流动相。薄层色谱斑点减少使用刀片,提取到5毫升甲醇,进行质/ MS分析。电喷雾电离高分辨率质谱获得了英国《金融时报》/ ICR质谱仪力量4.7 t BioApex II(德国)。生物碱也使用二极管矩阵的高效液相色谱分析鉴定和商业生物碱的标准。图1演示了一个典型的生物碱分布大肠californica本研究中发现使用高效液相色谱法和质/ MS(见补充材料网上http://dx.doi.org/10.1155/2015/617620)。

方法B。大肠californica得到从Dixa AG(瑞士圣加仑)和凭证样本沉积在Interdelta(瑞士Givisiez) 132914号。细碎的干燥地上部分大肠californica(1.872公斤)在甲醇浸软10周。甲醇蒸发。干提取物的重量是412.5克(干物质的22%)。高效液相色谱色谱提取分离之前的图所示2(一个)。干燥的植物提取物aq溶解在1%。H₂所以₄,水相适应的pH值≅9和生物碱部分提取到二乙醚。分数(8.06 g)获得了一次二乙醚提取。为了隔离NMT,植物样本分离为两个分数:A1 (nonphenolic生物碱)和A2(酚类生物碱)。分数是溶解在1% H₂所以₄,pH值调整到13日,nonphenolic生物碱提取到二乙醚(分数A1)。剩下的水相酸化pH值8 H₂所以₄和第二次提取到二乙醚(分数A2,酚类)。蒸发后二乙醚的质量分数A1包含4.19克的质量分数A2包含2.02克。分数A2 NMT发现含有82%,10% reticuline, 8% caryachine(图2 (b))。在我们之前的研究中描述的方法(12]。简而言之,移动阶段准备从股票的解决方案1-heptanesulfonate钠0.01米和0.1米的三乙胺在H₂O,调整与磷酸pH值2.5。流动相由25:75 (v / v)乙腈(ACN):股票的解决方案。流动相B是60:40 (v / v) ACN:股票的解决方案。磷酸和钠1-heptanesulfonate取自Sigma-Aldrich(布拉格,捷克共和国)。ACN(高效液相色谱级)从默克公司购买(达姆施塔特,德国)。以下采用洗脱图:0 - 4分钟isocratically 100%;4-15分钟0 - 20% B;15-38分钟45% B;38-50分钟80% B;和50 - 60分钟isocratically 100%的流量将0.5 mL / min,注入体积是100μL,检测了使用爸爸(二极管矩阵检测器)280海里。分离生物碱的识别是基于比较他们的保留时间与真实的标准。定量分析了使用外部标准。LC-20广告的高效液相色谱装置由高压梯度泵LC-20广告,社民党M20A二极管矩阵检测器(日本岛津公司、日本)和syringe-loading样本喷射器(捷克易康姆)20 -μL外部样品环。生物碱分离C12列(Synergi RP-Max, 4μ米、150×4.60毫米ID、Phenomenex CA)。

质方法用于识别生物碱(图“NMT分数”2 (b))开发使用Dionex终极3000 rs(热科学、CA)模块。化合物的分离实现了3.0×150毫米,5μm Synergi RP-Max C18 (Phenomenex)列在23°C和0.5毫升/分钟的流量。二元流动相系统是由0.1%的甲酸和质等级ACN(σ)。后20 -μL注入,ACN线性从20%上升到40%在10分钟,然后80%在接下来的10分钟。ACN举行10分钟占80%,其次是平衡的初始条件为3.0分钟。一个完整高效液相色谱运行是33分钟。高效液相色谱系统是连接到一个MicrOTOF-QII质谱仪(力量、德国),在积极的电喷雾电离作用模式。软件设定的电离作用条件如下:毛细管电压4.5 kV,终板抵消−0.5 kV,源温度220°C,反溶剂气体(氮气)流10 L / min, nebuliser(氮)压力3酒吧,和碰撞电池电压35 eV。基峰色谱(BPC)收购女士模式通过监测50到3000的范围m / z与光谱样本1 s的时间。目标化合物的识别依赖于同位素模式匹配与MS / MS和保留行为的结合。高分辨率的MS和MS / MS谱第一次调查来获取每个化合物的基本公式。复合是明确确定如果未知的分裂模式和目标生物碱是相同的。

2.3。电生理实验

从线性化质粒封顶cRNAs合成。多聚腺苷酸尾约400残留物被添加到每个记录使用酵母多聚腺苷酸聚合酶。cRNA量化在甲醛的浓度凝胶使用辐射红染色可视化的RNA。已知浓度的RNA梯子被装载在同一凝胶作为标准。cRNAs沉淀在乙醇/ isoamylalcohol 19: 1和干颗粒溶解在水中,储存在−80°C。非洲爪蟾蜍的卵母细胞(中心de资源以及Xenopes,嗯,3387年大学德雷恩,法国。动物研究允许Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinardienst伯尔尼(BE98/12))准备,注射,defolliculated如前所述[13]。简单地说,非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞注射50 cRNA解决方案包含的问α₁,α₂,α₃,α₅,或α₆结合β₁,β₂,或β₃和γ₂子单元的浓度10 nM: 10 nM: 50 nM然后孵化修改巴斯的解决方案在18°C测量前至少24小时。为α₁β₂δ10 nM:使用10 nM: 50 nM。电流测量使用国产的二电极电压钳放大器结合XY-recorder或数字化使用PowerLab 2/20(广告工具)使用计算机程序图。与一个模型的卵母细胞进行测试,确保更大电流的线性范围。响应是线性15μa电生理实验研究利用二电极电压钳方法持有−80 mV的潜力。生理盐水灌注介质含有90毫米,1毫米氯化钾,1毫米MgCl₂1毫米CaCl₂,5毫米Na-HEPES (pH值7.4)和由重力流应用6毫升/分钟。变构调节测量0.5 GABA浓度引起-1.5%的最大GABA电流幅值在相应的受体。GABA是20年代申请单独或结合变构化合物。灌注系统清洗药物应用程序之间用DMSO溶液清洗,以避免污染。药物溶解在10毫米在DMSO和存储−20°C。实验的最后DMSO浓度< 0.5%。这个浓度GABA DMSO并不影响电流引起的。silicon-coated玻璃管是用来稀释。这些稀释解决方案总是准备新鲜的实验前应立即。

3所示。结果

3.1。生物碱识别和量化

图1显示所有14的化学结构大肠californica生物碱中确定目前的工作。其中九个是量化使用高效液相色谱法和适当的生物碱标准(表1),而其余化合物被验明正身质/ MS、质(见图2和3和数字S1-S8)和女士比之前报道的数据9]。这种方法的优点是源于这一事实每个研究生物碱给只有一个父离子(+ 1),可以进一步分散到串联MS / MS,以便每个生物碱已经可以很容易地确定自己的指纹签名和女士,尽管它存在于复杂的生物碱混合物(见补充材料)。它被怀疑12]protopine和allocryptopine水平在空中的部分大肠californica可以高于相对快速生物碱提取(方法一)提供干燥粉末材料将浸渍在甲醇溶液长时间(B)方法。很明显从数据见表110周后,即使浸渍protopine相当低的数量和43-fold高于allocryptopine。另一方面,相比之下,而protopine收益率低,大量的,“碳足迹”NMT超过11倍protopine eschscholtzine及其水平相当。不幸的是,这位前复合质/ MS分析数据时误解了法布尔et al。14]。很明显从MS / MS分裂模式显示在我们的图3 (b)那m / z354.1对应于这个pavine生物碱6年代,12年代-neocaryachine-7 -O甲基醚N卫理公会教徒盐而不是protopine-as声称在图5法布尔和同事(14]。请注意,这两个化合物的分子质量几乎是相同的。这是不幸的,因为他们的工作,视为参考生物碱检测领域罂粟科植物,实际上错过检测protopine-suggested这种草药活跃的原则之一。除了NMT,我们已经确定了相对较高的reticuline(> 1毫克/克干物质)在空中的部分大肠californica(表1)。这是相当重要的观察考虑可能的生物活性的生物碱(见下文)。检测reticuline这种植物可能是错过了在老年研究由于缺乏高效液相色谱柱分离从NMT的使用。

3.2。生物的影响大肠californica生物碱

GABA Protopine和allocryptopine预计将采取行动_一个受体在微摩尔的范围5]。很明显,这两种生物碱的水平大肠californica分析了在目前的研究(表1)相对较低,因此submicromolar protopine水平在一个药店胶囊(300毫克)应该无法调节GABA的开幕_一个受体在体外和在活的有机体内。因为我们的大肠californica提取被发现含有相对大量的核磁测井仪,它被怀疑,这种分子可以结合伽马氨基丁酸_一个受体和负责镇静。有趣的是,初步radiotelemetry C5BL / 6 j小鼠实验用NMT-enriched分数(reticuline NMT的82%,10%,和8% caryachine与其它小生物碱(图2(一个))显示短期镇静效果的剂量后10毫克/公斤30至54分钟口服(未诉Butterweck, j . Wedler佛罗里达大学盖恩斯维尔)。为了理解这种镇静是否将NMT GABA绑定_一个受体,电生理学的研究进行了使用高纯度NMT (99.8%)。

大肠californica生物碱对GABA有约束力_一个受体(在体外)没有研究到目前为止因为的存在γ氨基丁酸酸在植物提取物9]。因此,我们研究了纯NMT在重组GABA的影响_一个使用电生理技术受体。通常,4毫克的高纯度NMT是溶解在股票DMSO溶液滴定的重组和适当的稀释α₁β₂γ₂伽马氨基丁酸_一个受体。有趣的是,NMT滴定显示没有变构调节30μm .刺激1μM安定不是下降了10μM NMT,不含苯二氮结合位点的拮抗效应。同样,protopine没有显著影响到30的浓度μm .额外的实验研究(年代(> 90%)-reticuline HCl盐异构体提供多伦多研究化学物质)。再一次,这个分子的重组无显著影响α₁β₂γ₂浓度低于10受体被注意到μm .相反,约28%抑制氯电流在30的存在μ米(年代)-reticuline(图4)。类似的行为是观察在交换β₂亚基的β₁或β₃而在α₁β₂δ受体(图4)。激动人心的是,(年代)-reticuline表现积极的变构调制器α₃β₂γ₂,α₅β₂γ₂,α₆β₂γ₂受体。最大的刺激是在每种情况下约100%的最大GABA (EC效应和half-maximal刺激₅₀观察)约为6μm .相比之下,α₂β₂γ₂我们观察到的变构抑制受体(图4)。10μ米(年代)-reticuline本身并不引起电流α₃β₂γ₂受体。的情况下α₁β₂γ₂受体,只有小观察在高浓度抑制α₁β₁γ₂,α₁β₃γ₂,α₁β₂δ受体。而(R)-reticuline没有效果(见下文),调节效果(年代)-reticuline立体定向。如图5文件,1μM ro15 - 1788,拮抗剂苯二氮结合位点,不抑制10的增强作用μ米(年代)-reticulineα₃β₂γ₂受体而是刺激其行动。这表明(年代)在苯二氮结合位点-reticuline不采取行动。它可以推测(年代)-reticuline联系人的至少一个氨基酸残基α亚基是相似的α₃,α₅,α₆但不同于相应的残渣α₂,都必须不同于相应的残渣α₁。对齐的序列α子单元显示,只有少数职位资格的结合位点。

怀疑(年代)-reticuline代谢物在啮齿动物有机体也检测调制。有趣的是,重组α₁β₂γ₂,α₃β₂γ₂,α₅β₂γ₂伽马氨基丁酸_一个10受体没有显著影响μ米的(R)-reticuline 1 2-tetrahydroreticuline可待因、吗啡(没有显示)。

4所示。讨论

在过去的三十年里,几个分析研究解决生物碱的问题检测和量化的绿色部分大肠californica(14- - - - - -16]。不幸的是,生物碱含量的显著差异被注意到。例如,protopine水平被发现随两个数量级从痕迹(9,14,16]可比水平californidine和eschscholtzine [15两个在这种植物最丰富的生物碱。为了确保绝大多数生物碱从干植物组织中提取,我们进行了浸渍在甲醇10周,其次是生物碱量化的二极管矩阵的高效液相色谱法。以来我们protopine特别感兴趣,allocryptopine水平GABA生物碱都建议采取行动_一个受体(5,6]。

电生理实验在不同的GABA在目前的工作_一个受体亚型表明protopine并不扮演重要角色的镇静效果大肠californica在以前的研究报道。典型的推荐大肠californica剂量是2 300毫克胶囊的干燥植物睡觉前(https://www.swissmedic.ch/zulassungen/00153/00189/00200/01041/index.html?lang=de)。很明显从液相色谱分析(表1protopine),α这种草药的天线部分-allocryptopine水平过低GABA显著调节氯离子流动_一个受体。protopine和allocryptopine被称为人类的5 -羟色胺和去甲肾上腺素转运蛋白抑制剂(10];然而,这些生物碱0.01 - -0.5毫克/克无疑是太低了促进抑郁症患者的5 -羟色胺和去甲肾上腺素水平。Hanus和他的同事们(4)进行了双盲安慰剂对照研究评估的有效性和安全性大肠californica结合Crataegus oxyacantha提取物用于治疗轻度到中度焦虑障碍。然而,Crataegus已知含有等黄酮类化合物槲皮素和芦丁,山柰酚、黄酮醇类和其他化合物已知行为对中枢神经系统(17]。槲皮素和山柰酚已报告在GABA绑定_一个受体(18),建议解释这些化合物的镇静和抗焦虑效果(18- - - - - -20.]。槲皮素还挣扎受体在体外它被建议作为一个候选人解释其antinociceptive属性(21]。即使一些黄酮苷槲皮素、芦丁和异鼠李亭以前检测到大肠californica(22),我们可以发现这种植物只在空中山柰酚的痕迹(高效液相色谱数据未显示)。然而,NMT作为一个相对强劲的对手的出现受体(9),因此,它不太可能促进antinociceptive的影响大肠californica。因此,必须存在一个机制,这种植物是如何影响哺乳动物的中枢神经系统。有趣的是,我们发现在目前的工作,空中的部分大肠californica包含(年代)-reticuline。它已被证明23),这种化合物可能通过神经母细胞瘤细胞转变成吗啡,这是结合μ阿片受体。后者的观察可以解释为什么纯(年代)-reticuline隔绝Ocotea duckei作为强有力的中枢神经系统抑制剂(24]。

用10%(遥测实验年代)-reticuline NMT的分数,显示镇静对小鼠的影响。然而,我们的电生理实验明确,没有积极的氯电流调制(年代)-reticuline重组α₁β₂γ₂伽马氨基丁酸_一个主要同种型受体在大脑中认为调解镇静效果。因此,(年代)-reticuline可能会在啮齿动物代谢明显高于其他复合展现GABA的调制_一个比父分子受体。据报道(25)(年代通过1)-reticuline可能在啮齿动物代谢,2-dehydroreticuline (R)-reticuline和其他生物碱中间体为可待因和吗啡。在这方面,尼克拉艾和他的同事们(26)监测蛋白激活HEK293a细胞表达人类生活μ阿片受体(铁道部)和测试绑定的吗啡和可待因。结合常数在铁道部确定摩尔范围(= 4±1海里),电子商务₅₀= 6±2海里激活了吗啡。可待因似乎antinociceptive效力与低很多常数和电子商务₅₀6μ这两种分子也在形成罂粟科家庭连续植物通过生物化学转换(年代)-reticuline-the吗啡是生物碱的最终产品(25]。

免疫反应性染色的成年老鼠大脑与内生吗啡和可待因gaba ergic中间神经元和星形胶质细胞(27]。吗啡人口集中在一个小的神经元可以函数作为一种神经调质能够影响间接gaba ergic神经元的抑制活性。特别是,小清蛋白(PV)的积极终端篮子细胞(gaba ergic中间神经元)的表达μ阿片受体和M2毒蕈碱的受体,针对锥体神经元的躯体部分配备α₁subunit-containing GABA_一个受体(28,29日]。这与缩胆囊素(CCK)积极interneurons-expressing主要是大麻素CB1和雌激素和metabotropic GABA_B受体。由于生物碱来自(年代)-reticuline生物转化能够结合μ阿片受体,这可能反过来影响GABA释放抑制性细胞的光伏终端和负责轻度镇静效果我们的遥测实验中观察到。提供有均匀分布和小退化(年代3)-reticuline,水平μ在啮齿动物的大脑可能估计。这也是足够高的影响α₃β₂γ₂和α₅β₂γ₂伽马氨基丁酸_一个受体。老鼠大脑的(年代13)-reticuline被估计为ng / g (30.),对应于平均浓度约为0.05μm .另一方面,只有一小部分的神经元含有吗啡metabolites-that,主要gaba ergic神经元(31日]。因此这样一个reticuline metabolite-dependent调制的抑制性中间神经元可能相关在活的有机体内的情况。

5。结论

ESI-tandem MS / MS和高效液相色谱法允许我们探测、识别和量化多数生物碱中大肠californica。氯电流的调制protopine,α-allocryptopine、核磁测井仪和在不同的重组GABA reticuline_一个受体亚型进行了研究在体外。我们选择研究NMT和reticuline来自这样一个事实:“NMT分数”部分3所示。2)表现出轻度镇静对小鼠的影响。另一方面,更丰富的californidine(第四纪pavine生物碱)无法穿透大脑血屏障(32),因此并没有包含在我们的电生理学研究。本工作的主要目标是识别的机制大肠californica生物碱能诱导镇静效果。目前工作的主要发现是,这种草药引起镇静不依赖于直接绑定GABA的生物碱_一个受体和氯电流调制。尽管(年代)发现-reticuline采取行动α₃β₂γ₂和α₅β₂γ₂伽马氨基丁酸_一个受体,最后,它可能会在哺乳动物体内转变成更强大的生物碱,然后能够绑定到GPCR受体在摩尔的范围内。我们相信,轻度镇静和antinociceptive干天线部分的属性大肠californica可能是分配给绑定的吗啡(和/或其它生物碱)在吗μ阿片受体。吗啡可能生成的啮齿动物连续生物体通过生物转化(年代)-reticuline出现在空中的部分大肠californica。生物碱的存在在加州罂粟空中地区以来,先前的研究可能是错过了tis分子可能coeluted NMT在典型的高效液相色谱条件下(14]。

总之,为了实现重要的药用效果(关于空中地区相对较低的生物碱含量确定这种植物),一个需要增加干植物剂量睡前1克以上,或者,最终,结合大肠californica包含其他的种种生物碱与其他草药。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢一种礼物的一些生物碱标准和相关的紫外可见光谱从Stefan Gafner博士。富有成果的讨论与Veronika Butterweck教授(医药技术研究所、Muttenz、瑞士),Stefan Gafner(美国汤姆的主),Yvon Desmurs,和乌苏拉Gotschmann (Interdelta、瑞士)是高度赞赏。

补充材料

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