表达和描述小说的基因fr47在寒冷的树蛙,Rana sylvatica

文摘

树蛙,Rana sylvatica许多适应,让它存活冻结高达65%的全身水在冬季。这样的改编被发现包括小说冻结反应基因的表达被认为是重要的适应和生存。在这项研究中,组织应力响应的一个小说基因的表达,fr47在七树蛙,评估组织。针对冻结,成绩单的表达fr47显著增加六个组织:心脏、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和睾丸。的表达fr47也强烈调节组件应力冻结,即缺氧和脱水。一个动态的变化fr47表达式也观察到在蝌蚪的发展过程中,与低表达在胚胎阶段(14到20 Gosner阶段),增加通过中间(阶段26-43)和转换阶段(阶段44-45)。这些结果表明,fr47可能有一个角色在发展和蜕变,除了冻结,缺氧,脱水耐性。新创FR47蛋白质结构分析显示膜相关的功能和可能的GRB2协会的可能性。这假设是交互可能影响肌醇1,4,5-trisphosphate生产,增加在树蛙冻结。

1。介绍

北部的几个物种林地青蛙显示非凡的能力忍受长期冻结他们的体液。到目前为止,生理、生化和分子反应冻结公差树蛙都已经被广泛地研究过了,Rana sylvatica(1- - - - - -4]。冻结的起始发生成核的表面水分渗透皮肤的青蛙。传播的冰通过青蛙将持续到65%的全身水冻结。重要的是,冻结带来各种各样的压力在青蛙的细胞和组织,包括广泛的亚细胞结构损伤和直接的物理伤害组织从冰晶的形成2]。整个有机体的水平,主要的生理问题是缺氧(即。,lack of oxygen) that results through the freezing of the lungs and heart, as well as ischemia (i.e., disruption of blood flow) that occurs once the blood plasma freezes. Another major freeze-associated concern is dehydration, as the formation of extracellular ice from pure water creates hyperosmotic stress on unfrozen cells. Effectively, this causes water to osmotically withdraw from cells, resulting in a sharp decrease in cell volume. The collective consequence of these stresses necessitates specific biochemical and physiological adaptations that ensure the frog will thaw come spring with minimal cellular damage as a result of freezing.

先前的研究已经探讨freeze-induced基因表达的变化通过使用不同的筛选cDNA数组,或差异显示技术(1,5,6]。特别感兴趣的,肝组织的互补脱氧核糖核酸库的筛选冷冻树蛙显示freeze-induced upregulation三个独特的基因,因为认定li16,fr10,fr47(7- - - - - -9]。这些基因代码冻结反应小说蛋白质很少或没有明显的同源性,任何识别基因/蛋白质在当前序列存入基因库。

目前,fr47是最大的和最不理解这三个小说的冻结反应基因(10,11]。的fr47信使rna序列包含3678个核苷酸,并翻译成390 -氨基酸蛋白质,与计算分子量约为46 kDa。前面分析的Kyte-Doolittle FR47蛋白质的疏水性阴谋表示高度疏水区域附近的糖基的蛋白质氨基酸位置350 - 370 (8]。疏水区域中是常见的膜相关蛋白,可能代表一个跨膜段和可能参与细胞膜相关的细胞过程。目前的研究提供了一个深入的分析表达式fr47基因转录的多个器官树蛙冻结,缺氧,脱水压力,以及在开发过程中蝌蚪。还提供了洞察的数据结构和功能相关的潜在膜FR47蛋白质的树蛙冻结公差。

2。材料和方法

2.1。动物治疗和组织准备

成年男性木青蛙和木蛙卵收集从养殖池塘附近主教的米尔斯,安大略省,在早春。成年青蛙在四环素浴洗和容器内衬举行潮湿泥炭藓在5°C在实验开始前1 - 2周。从这个条件控制成年青蛙取样。冻结曝光,成年青蛙放入容器内衬湿纸巾和转移到−4°C孵化器。在这个温度下,青蛙酷并开始冻结在45到60分钟(12]。60分钟后,温度提高到−2.5°C和冻结时间定时从这一点。青蛙是冻结的24小时后取样。

缺氧实验,5°C能适应成年青蛙被放置在密封容器(700毫升,5 - 6青蛙/ jar)被设置在碎冰和先前与氮气冲洗15分钟。包含青蛙,一旦容器被刷新和氮气进一步20分钟和后用封口膜密封好。容器被放置在5°C孵化24小时。这一次后,氮气线是连接和青蛙快速采样。

成年青蛙注定脱水实验取样5°C地适应实验组的青蛙。容器被放置在一个孵化器设定在5°C和青蛙被允许失去水通过蒸发。青蛙很快被reweighed以不同的间隔,和身体水失去了使用方程计算,在那里是动物的初始质量,是在每个重质量,% H₂O是水总体重的百分比(控制木材的青蛙,% H₂是啊(%)13]。实验期间的平均失水率约0.5%的总身体水/人力资源,失去了和动物采样后立即他们失去了全身的40%的水。青蛙被从中取髓安乐死和组织都迅速切除,立即在液态氮冷冻,然后储存在−80°C到使用。

树蛙发展研究,鸡蛋被安置在价格低廉水族馆包含池塘水的混合物和dechlorinated自来水(~ 20°C),都洋溢着石头。蝌蚪被沸腾的美联储碎生菜软化,以及每天金鱼片。每2 - 3天,但是1 L水族馆水被这是取代新鲜dechlorinated自来水。1 L水族馆水保留提供任何蝌蚪微生物必不可少的环境。开发的蝌蚪,他们在不同阶段抽样,在液态氮冷冻。抽样定义为发生在阶段Gosner [1414到20](一个)阶段,未孵化的胚胎已经开发了一种神经褶皱,21 - 25日(b)阶段,孵化的蝌蚪,26 - 30日(c)阶段,在那里出现了肢芽,31-35 (d)阶段,回肢芽已发展成“桨”的脚(即。,没有脚趾),(e)阶段36-41,四肢已经开发出个体的脚趾,42-43 (f)阶段,一个肢体发展面前,44-45 (g)阶段,尾巴几乎完全吸收,出现萌芽状态。

2.2。RNA制备和互补脱氧核糖核酸的合成

冷冻组织重(100毫克为心脏和后肢骨骼肌和所有其他50毫克)和均质1毫升的试剂盒试剂(表达载体;猫# 15596 - 026)。均质化后,200μL(氯仿然后添加和样本简要漩涡。样本然后离心机在10000 g×15分钟在4°C。水上层清液(含分数)的RNA被和存储在一个1.5毫升RNase-free埃普多夫管。从这些样本,RNA是500年然后沉淀的μL异丙醇,在室温下是孵化20分钟。样本然后离心机在12000 g×15分钟在4°C。结果RNA丸是用1毫升的70%乙醇和离心机在7500 g×5分钟在4°C。颗粒被风干,resuspended 25μL RNase-free H₂o . RNA质量决定基于260/280 nm吸光度的比值和量化使用紫外分光光度计在260海里。

互补脱氧核糖核酸的合成,一个包含3整除μ克总RNA与RNase-free H稀释₂10 O最后一卷μl .每个示例1μ200 ng / Lμl低聚糖dT引物(5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′)然后添加样本孵化5分钟在65°C,随后快速冷却对冰1分钟。随后,4μL 5 x第一链缓冲区,2μL(100毫米德勤,1μL核苷酸混合物(25毫米),和1μL逆转录酶M-MLV酶(西格玛奥德里奇;猫# M1302-40KU)被添加到每个样本,其次是孵化为45分钟42°C,然后冷冻冰。所有cDNA样本然后serial-diluted储存在−20°C到使用。

2.3。聚合酶链反应扩增

聚合酶链反应(PCR), 15的混合物μL无菌RNase-free H₂啊,5μ1.25 L cDNA、稀释μL引物混合物,0.75μL 10 x PCR缓冲(表达载体),1.5μL MgCl 50毫米₂,0.5μL核苷酸混合物(25毫米),和1μL (Taq聚合酶相结合的总量25μl .引物设计引物设计程序使用v。3(Scientific and Educational Software) based on the sequence forfr47(加入基因库AY100690)。引物序列fr47和α- - - - - -微管蛋白表中列出1。扩增的PCR是95°C程序用于7分钟,其次是28-35周期94°C的1分钟,1分钟53°C,和72°C 1.5分钟,最后10分钟72°C。

2.4。计算机建模

结构分析FR47是由第一次验证的存在解决了结构同源序列使用BLASTp针对PDB数据库的搜索。没有明显的冲击,另一种使用线程软件建模过程是受雇于I-TASSER [15]。最好的排名模型根据I-TASSER TM-score(测量两种蛋白质的结构相似性的度量)的类似蛋白质的折叠的结构3 qxy PDB文件中描述。pdb (TM-score 0.874,值为- 1指示一个完美的匹配)。最高得分FR47模型使质子化和优化了能量最小化使用MMFF94s力场模型分子操作环境(MOE) v.2011.10软件(化学计算组、蒙特利尔、QC、加拿大)。细胞定位的FR47预测使用PSORT II,一个程序,检测分选信号蛋白和预测他们的亚细胞定位16]。膜边界和蛋白质相互作用得到MOE (PPM服务器和可视化的17]。功能获得的见解是PredictProtein开放分析和寻找守恒SH2绑定域名使用DOMPEP [18]。

2.5。统计数据

PCR产品1%琼脂糖凝胶上分离沾SYBR绿色和可视化使用ChemiGenius成像系统(Syngene, Fredrick,医学博士,美国)。以确保没有发生饱和,最稀cDNA样本产生可见光波段被GeneTools程序用于量化。的表达α- - - - - -微管蛋白被发现不断表示在这项研究中使用的所有组织和应力,因此,选择合适的看家基因正常化fr47转录表达。数据表示相对于控制值(除了开发研究表示相对于Gosner阶段14到20 (14])和统计学意义表达的变化是由方差分析与事后Student-Newman-Keuls (SNK)测试使用SigmaPlot (v.11)。所有统计差异标记根据事后SNK分析的结果。

3所示。结果

3.1。FR47结构的预测、本地化和函数

蛋白质结构预测从先前发表的主要氨基酸序列FR47r . sylvatica(加入基因库AY100690)。后使用I-TASSER程序(数据结构预测1(一)和1 (b)),FR47蛋白质预测有一个高概率的胞内定位和显示高度的膜协会(图1 (c))。FR47是预测的高概率与细胞膜相互作用,我们用DOMPEP找到任何高度保守的SH2绑定图案作为一种识别任何可能的蛋白质相互作用,参与信号转导在冻结压力。尽管FR47的磷酸化状态未知,DOMPEP分析显示一个高度保守的主题参与phosphotyrosine生长因子receptor-bound蛋白2 (GRB2)绑定位置50 (SQVQLTKYLNAMVNY)(图(预测评分:1.00)2)。有趣的是,这个网站还预测是在此种地区PredictProtein开放分析(所以:0000410)。

3.2。的反应fr47冻结

随后multitissue分析fr47mRNA水平支持先前发表在树蛙的冻结反应模式。图3表明,在应对24小时冷冻,fr47心中转录水平显著提高倍相比,控制值()。显著升高fr47转录水平也观察到肾、肺、睾丸后24小时冷冻(- - - - - -,- - - - - -,倍、职责)相比,控制值()。脑组织显示没有变化fr47转录水平之间的控制和24小时冻青蛙。

3.3。的反应fr47缺氧和脱水

确定的反应fr47缺氧和脱水,转录水平分析了青蛙暴露于24小时缺氧或40%脱水。控制样品相比,fr47转录水平增加在所有组织除了青蛙被暴露于24小时后睾丸缺氧(图4)。肝组织显示最大的增长fr47转录表达,增加倍高于控制值()。控制值相比,显著增加fr47转录表达响应24小时缺氧还发现在骨骼肌(倍),大脑(倍)、肺(倍)、心(倍)、肾(倍)()。只有睾丸显示没有变化fr4724小时缺氧后表达。脱水至40%的全身水损失也引发的表达增加fr47(图三的七个组织测试5)。肝脏、心脏和脑组织显示dehydration-responsive增加- - - - - -,- - - - - -,倍值控制相比,分别为()。剩下的四个组织没有变化fr47表达反应脱水。

3.4。的表达fr47在树蛙开发

的转录水平fr47也观察到在七木青蛙的蝌蚪发展阶段(图6)。整个开发过程中的表达逐渐增加,最后导致一个倍增加fr4714到20之间的转录表达Gosner阶段(胚胎神经褶皱,用作起点)和Gosner阶段44-45几乎完全发达(青蛙)。增加第一次变得明显阶段26 - 30日,柔软的味蕾首先出现正值倍增加fr47表达式。的水平fr47转录仍相当一致的未来发展的三个阶段,与最后阶段经历比前一个阶段增加大于2倍。

4所示。讨论

促进冬季生存,树蛙进化多个改编,帮助减少损失,延长生存能力而在冷冻状态。先前的研究已经确定了三个基因,不仅调节响应冻结而且独特的青蛙没有已知的基因同系物(1,7- - - - - -9]。而两个小蛋白的功能和监管fr10和li16之前一直在探索,fr47基因是最大的和最不理解这三个小说的冻结反应基因(11]。因此,本研究对的监管和功能扩展了我们的知识fr47。

PCR分析发现fr47表示在所有七个树蛙组织测试。然而,的大小fr47记录增加响应24小时冷冻接触是依赖于器官。冻结的表达增加fr47在六个组织测试相比,控制条件。这不同于之前的研究,用northern数据显示增加fr47成绩单在肝脏,但没有改变大脑,心脏,肺、肾、骨骼肌组织为了应对冻结(8]。这些发现的差异可能是由于更大的PCR的敏感性,与北方相比印迹技术。总的来说,这些结果进一步证实fr47对冻结和扩大组织监管的基因。一个假设可以证明的瀑特异性表达fr47在寒冷,fr47基因表达与青蛙的“战斗的逃跑”反应。

众所周知,冷冻后几分钟内启动(即。,ice crystal nucleation), glucose production and export from the liver rapidly increase [19]。有人建议,葡萄糖合成起源于一个极端夸张的“战斗或逃跑”的反应,增加血糖水平在所有脊椎动物时期的压力(19]。这是支持的事实,adrenaline-blocking化合物(特别是普萘洛尔)也有效地阻止葡萄糖合成在寒冷(19,20.]。与之平行的“战斗或逃跑”的反应是器官的已知部分“战斗或逃跑”也显示显著upregulationfr47在冻结。例如,与“战斗还是逃跑”相关的生理反应包括增加心率、呼吸、骨骼肌活动,从肝脏糖分子的释放,抑制不必要的器官的活动(21]。有趣的是,最强劲的增长fr47转录后冻结发生在心脏、肺、肾、肝脏和骨骼肌(图3)。如果一个“战斗或逃跑”的反应被激活在青蛙冰成核,这些器官是非常重要的;随着心率增加,肾脏将会必然地过滤血液更快,呼吸频率增加,肌肉将准备采取行动,将从肝脏释放葡萄糖。重要的是,它已经表明,冻结发作诱因立即增加两倍的树蛙心跳降低以冰的积累(22]。

已经发现几乎所有的冻结反应基因也对缺氧或脱水压力,两者都是冻结的同伴压力1]。我们的数据显示,虽然fr47转录后水平增加24小时缺氧在六个组织测试,只有三个组织显示转录水平的增加反应脱水至40%(数据4和5)。以前的工作由麦克纳利et al。8在肝组织同意目前的结果,显示出强劲的增长fr47转录的24小时缺氧和脱水的20%。很可能增加fr47观察到更高级别的脱水(40%)在目前的研究是由缺氧加剧,同时发展高潮的损失。

帮助阐明一个可能的功能角色FR47在生存压力,我们首先创建了一个新创模型的蛋白质结构(图1(一))。鉴于之前的报告表明,疏水的c端FR47可能代表一个可能的跨膜部分,我们建模FR47与细胞膜相互作用(图1 (b))。的确,我们FR47细胞膜模型表明,FR47有可能参与细胞膜相关的细胞过程,如信号转导。尽管FR47目前未知的磷酸化状态,分析phosphotyrosine SH2绑定图案出现在FR47表示完全守恒GRB2绑定主题(pY-X-N-X, X是典型的疏水残基)。可能FR47可能有调节作用GRB2信号在强调状态。GRB2-SOS已知信号调节磷脂酶C (PLC)和肌醇的生产1,4,5-triphosphate (IP3)水平,细胞内第二信使的蛋白激酶C (PKC) [23]。有趣的是,IP3含量可以显著增加在寒冷的树蛙,4小时后增加了三倍,经过24小时的冻结,“碳足迹”的11倍(8,23]。在这方面,麦克纳利et al。8)表明,fr47在肝脏转录增加剂量依赖和时间依赖方式回应佛波醇12-myristate 13-acetate(也称为PMA)刺激PKC活性。可能freezing-induced IP3含量增加可能通过GRB2信号之间的相互作用和影响FR47,介导通过GRB2 SH2域,可以提供一个反馈机制来规范fr47PKC介导的转录活动。

除了冻结的表达fr47决心在几个发展阶段从胚胎到成年青蛙(图6)。的表达fr47直到最后Gosner稳步增长在发展阶段44-45 [14),青蛙已经几乎完全异化的尾巴。的上升fr47记录首次重大在26 - 30日Gosner阶段(后一瘸一拐地芽出现时),没有明显改变,直到最后阶段的发展,fr47转录超过8倍大于在早期阶段(14到20 Gosner阶段)。这一点意义重大,因为木蛙卵通常在4月时冻结的威胁已经在很大程度上通过。此外,在目前的研究发展从鸡蛋到成人都发生在室温,因此动物从未经历过冷。这表明fr47在树蛙发展必须有一个未定义的生物作用,也可能有重要作用促进生存在寒冷。有趣的是,Gosner阶段(26 - 30日的增加fr47记录开始显著)也标志着蝌蚪的肺的开发和使用(14]。

的结果fr47表达式的树蛙表明蛋白质表达式是特定于开发和器官。数据还表明,fr47必须扮演一个角色在发展中木青蛙;然而,这个角色仍然不清楚。基于的multiorgans模式fr47基因表达,我们有强有力的证据表明一个重要的角色在树蛙FR47强调宽容,证明持续不断的蛋白质的特点,确定其细胞功能与GRB2信号和IP3合成和可能的交互。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

作者的贡献

卡特里娜·j·苏利文和凯尔·k·比格同样这项工作。

确认

我们应感谢j . m .层和y翠的编辑审查。支持的研究发现由自然科学和工程研究委员会(NSERC)加拿大的肯尼斯·b层和加拿大研究合作项目。卡特里娜苏利文和凯尔·k·比格举行NSERC CGS奖学金。

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