抗糖尿病的活动Ruellia tuberosal,Role ofα淀粉酶抑制剂:在网上,在体外,在活的有机体内方法

文摘

Ruellia tuberosal是一个偏方治疗糖尿病。然而,到目前为止还没有调查其降糖活性。在目前的研究中,抗糖尿病的机制的正己烷分数methanolic提取(HFME)这种植物的调查在网上,在体外,在活的有机体内。在网上研究使用AutoDock4.2执行软件。在体外α淀粉酶抑制活动被starch-iodine调查方法。单剂量450毫克/公斤HFME 14天受到一种抗糖尿病的筛查在活的有机体内由多个低剂量链脲霉素诱导大鼠(MLD-STZ)。分子建模结果表明,桦木醇表现出非竞争性α淀粉酶抑制活动。HFME的影响引起糖尿病大鼠血糖的显著减少。单剂量HFME抑制α淀粉酶活性在活的有机体内()与糖尿病对照组相比。此外,这种提取强烈抑制α淀粉酶活性在体外(集成电路₅₀0.14±0.005毫克/毫升)。得出HFME通过施加一个抗糖尿病的影响α淀粉酶抑制剂。我们的研究结果提供了一个可能的降糖作用r . tuberosal .作为替代治疗糖尿病的管理。

1。介绍

糖尿病(DM),一个世界大代谢障碍,特点是高血糖。血糖升高的原因可能与遗传有关,环境组件,包括胰岛素抵抗和高胰岛素血症(1]。糖尿病患者经历重大的发病率和死亡率微血管和macrovascular并发症(2]。

替代疗法的公共利益,包括植物和天然膳食补充剂的使用,已在世界各地。Ruellia tuberosal在东南亚包括印尼广泛传播。在民间医学,它被用作治疗糖尿病药,抗高血压,退热剂、止痛剂。r . tuberosal具有显著的降血糖效果alloxan-induced糖尿病大鼠和兔子3,4]。据报道,五类黄酮、cirsimaritin cirsimarin, cirsiliol 4-glucoside, sorbifolin,和pedalitin桦木醇、香草酸,indole-3-carboxaldehyde隔绝methanolic提取物的乙酸乙酯部分r .晚香玉l . (5]。芹黄素、毛地黄黄酮、3 5-diglucoside apigenin-7-O-glucuronide,芹黄素苷、芹黄素rutinoside,毛地黄黄酮苷和黄酮糖苷也报道r . tuberosal . (6,7]。然而,它的生物活性化合物的降糖机制到目前为止还没有被调查。在网上的调查r . tuberosal .化合物显示最潜在的抑制剂对大鼠模型α淀粉酶和人类α淀粉酶是桦木醇。此外,基于抑制常数的近似表明桦木醇更多潜在的抑制剂α淀粉酶比阿卡波糖(8),但桦木醇的抑制机制尚未被研究过。了解酶的作用机制和抑制机制的目标是至关重要的早期发现和开发药物的候选人。的作用机制研究的目的是描述与目标化合物的相互作用,了解自然基质化合物与目标相互作用以及如何在生理浓度来调节这个活动。

这项工作的目的是评估一个活跃的化合物的抗糖尿病的作用机理r . tuberosal在网上,在体外,和体内。糖尿病治疗的一个可能的机制是通过抑制α淀粉酶。碳水化合物消化的酶的抑制剂,如α淀粉酶,现在积极寻找医学预防糖尿病,因为它可以控制餐后血糖的增加9]。血液中的血糖水平的控制是最有效的治疗方法。长期高血糖减少发展中微血管的火险隐患,减少macrovascular并发症(10]。

2。材料和方法

2.1。植物材料和提取制备(HFME)

天线的部分r . tuberosal .收集从他们在东部的自然栖息地,印度尼西亚东爪哇。植物是由大学的植物学家reidentified Brawijaya,印度尼西亚。工厂是在树荫下清洗和干燥,和植物粉(1公斤)浸泡在甲醇(1 L×3)在室温下。methanolic提取过滤,使用真空旋转蒸发器蒸发(低于50°C)。粗提取液的分离与正己烷(1:1)。正己烷的methanolic提取(HFME)集中使用真空旋转蒸发器和N₂。集中HFME用于抗糖尿病的研究。获得的HFME受到初步萜类化合物(类固醇)筛查使用薄层色谱法(TLC) [11]。薄层色谱硅胶F254上执行,使用移动阶段根据林等。5]。发展后,斑点了治疗Liebermann-Burchard试剂在110°C和加热5分钟。此外,桦木醇被证实与质(12,13],桦木醇的相对量(%)的确定是基于%峰面积。

2.2。动物和诱导糖尿病

正常的健康男性鼠形老鼠(180 - 220 g)被用于目前的调查。动物实验是在遵循国际公认的道德准则的实验室动物。此外,道德间隙进行研究得到的动物保健和使用委员会Brawijaya大学(编号232 -凯普乌兰巴托)。老鼠适应了一个星期前在我们实验室条件实验。老鼠被安置在标准环境条件下温度(°C)和一个12 h光/暗周期。他们用标准颗粒饮食和水随意。实验前,一夜之间他们禁食,但他们仍然允许访问水。

对于一个在活的有机体内研究中,老鼠被分成3组,每组6个动物如下:正常控制(非糖尿病的老鼠注射玉米油3毫升为14天),糖尿病控制(未经治疗的糖尿病大鼠服用玉米油为14天),和治疗组(糖尿病大鼠治疗HFME合著的450毫克/公斤。溶解在3毫升玉米油为14天)。糖尿病(糖尿病控制和治疗组)是引起的腹腔内管理多种低剂量链脲霉素(MLD-STZ)的剂量20毫克/公斤合著。5天(16]。注射后14天,大鼠出现空腹血糖(FBG) > 250 mg / dL被认为是糖尿病,被用于实验。

2.3。高血糖活动

所有大鼠的血糖水平记录在实验期间定期(0天,2周)。从尾静脉血样采集和血糖测量数字化的血糖仪(GCU部件米OneTouch) [17,18]。

2.4。α淀粉酶抑制试验:在活的有机体内HFME政府对老鼠的影响等离子体

正常对照组,通宵禁食后,糖尿病组和治疗组(HFME政府后第15天)老鼠被颈椎错位。心脏血液收集和离心机在5000 g×20分钟。大鼠血浆收集和储存在4°C到进一步使用(19,20.]。根据Starch-Iodine淀粉酶活性进行了方法。0.5毫升的底物缓冲溶液(0.25 M / L磷酸盐缓冲剂在pH值7.0包含40 mg / dL可溶性淀粉)与100年混合好μL蒸馏水和保持在37°C 5分钟。这样做是对样品和空白试验。潜伏期后,0.01毫升的大鼠血浆混合添加到样品溶液,在reincubation 37°C 7.5分钟。第二次孵化后,0.5毫升的染色试剂(0.254克和4.0克碘化钾碘1 L)和2.5毫升蒸馏水补充道。混合后,溶液的吸光度为581 nm使用分光光度计(液体20 d)。一式三份化验中进行研究和平均值。淀粉酶活性的单位任意定义为以下方程: 在哪里在样品溶液的吸光度starch-iodine复杂和在空白的吸光度starch-iodine复杂的解决方案。

2.5。α淀粉酶抑制试验:在体外HFME对老鼠的影响等离子体

0.10毫升的连续稀释水植物提取物(HFME稀释DMSO)与0.5毫升的孵化基质缓冲溶液在37°C 5分钟。采用相同的程序如上(使用正常对照组血浆α淀粉酶)。抑制活性百分比计算使用以下公式: 是和测试解决方案和酶的活动吗酶的活性没有测试解决方案。α-淀粉酶的抑制百分比活动然后转换成IC50。比较在体外和在网上结果,IC50转换为通过计算在Cer et al。21]。

2.6。在网上抑制机制

三个主要的机制抑制竞争,非竞争性和竞争力。抑制机制涉及蛋白质和多种配体(底物、抑制剂和代数余子式)的相互作用。Protein-multiple配体相互作用可以建立使用多个配体同时对接(MLSD)策略。策略之一是Lamarkian遗传算法使用AutoDock4 [LGA22]。

对接的随机初始化开始的人口。不同于single-ligand对接,multiligand对接中的单个解决方案包含多个配体的构象。Multiligand对接程序加载PDBQT输入文件为每个配体(抑制剂和底物)。每个配体对象将与自己的一组随机初始化状态变量。通过这种方式,每个配体对象都有自己的配置,配体中心,扭转树。标准达到程序。所有配体之间的相互作用能和抑制常数和蛋白质受体AutoDock4.2计算使用修改后的能量函数。

桦木醇,α淀粉酶抑制剂在r .晚香玉作为配体(8),和麦芽糖作为衬底停靠鼠属α淀粉酶的模型。的鼠属α淀粉酶在创建模型根据Ratna Wulan et al。8]。研究抑制机制(桦木醇的竞争力,竞争力,或非竞争性)尚未公布。在这里,我们建议使用桦木醇的抑制机理在网上的方法。在非竞争性抑制,es复杂、酶抑制剂的复杂,enzyme-substrate-inhibitor复杂的经历(4)。在竞争激烈的或没有竞争力的抑制,es复杂、酶抑制剂的复杂,enzyme-substrate-inhibitor复杂无法完成(4)。验证非竞争性抑制的方法使用,我们计算es复杂、酶抑制剂的复杂,enzyme-substrate-inhibitor复杂的使用(4)从几个小α淀粉酶抑制剂,如桦木酸、姜黄素和Bisdemethoxycurcumin [14,15,23]。

2.6.1。酶底物抑制剂反应方程

非竞争性抑制。抑制剂(I)结合同样自由酶(E)和ES复杂(ES)(见方案1)。这些绑定事件只发生在一个网站不同于精确的活性位点被衬底,在哪里和。注意,我们假设这两个酶复合物的形成是与各自的衬底/抑制剂和平衡,,,是协会常量。协会常数由AutoDock4.2报告为抑制常数计算。然后反应方程如下: 然后,替换(ESI),[西文],(EI), [E],[我]使最终方程如下: 非竞争性抑制剂机制应该构成(4)以上。

竞争性抑制。的抑制剂结合底物的活性部位,防止绑定。竞争性抑制剂结合自由酶(见方案2)。

没有竞争力的抑制。在竞争力的情况下抑制,抑制剂结合的学位复杂和防止转换产品(见方案3)。

2.7。统计分析

的结果在活的有机体内抑制活性的α淀粉酶是表示为±SEM和分析了使用单向方差分析(方差分析)其次是至少显著差异(LSD)。使用SPSS 15.0版进行了方差分析和LSD。差异被认为是重要的。IC50值测定的情节与浓度和抑制百分比的计算是通过概率单位回归分析的意思是抑制值。IC50值被定义为提取液的浓度,包含α淀粉酶抑制剂,抑制大鼠胰腺的50%α淀粉酶活性。

3所示。结果

3.1。准备HFME和桦木醇的特性

甲醇提取的干燥地上部分r . tuberosal .(1公斤)与正己烷获得HFME切块。HFME百分比收益率为1.69%相对于干燥的地上部分。初步筛查发现类固醇类固醇的存在。类固醇检测视觉的存在后,紫色斑点喷雾Liebermann-Burchard试剂。桦木醇(类固醇)HFME进一步确定通过比较它们的光谱数据与文献值。液相色谱质谱分析的HFME样品显示桦木醇的存在。桦木醇的分子离子峰,被发现m / z441 (mh)⁻被注意到。(W / W)数量的百分比在HFME桦木醇是6.96%。

3.2。HFME影响α淀粉酶活性在体外

获得的数据α淀粉酶抑制HFME如图的效果1。HFME抑制被发现α在大鼠血浆淀粉酶活性与增加分级浓度从7.13%到93.77%的提取(0.016至1.6毫克/毫升)。此外,在鼠HFME的抑制作用α血清淀粉酶似乎依赖于浓度曲线后,虽然没有显著()效应在低浓度(0.015毫克/毫升)。IC50 140±53μ克/毫升,如表所示1。基于非竞争性抑制方程在Cer et al。21),转换IC50值是314μM。

3.3。HFME管理的效果α淀粉酶活性在活的有机体内

在体外酶抑制剂的影响并不总是可再生的在活的有机体内。因此有必要确认有效性的观察结果在活的有机体内。这样做是通过调查空腹血糖(FBG)在正常控制,糖尿病控制和治疗大鼠组和调查α淀粉酶单位活动。糖尿病高血糖时确认检测到。

HFME淀粉酶单位活动的影响如表所示2。口服HFME被发现拥有重要的()α在治疗组淀粉酶抑制活动。似乎包含桦木醇可以抑制EFα淀粉酶在活的有机体内。

口服HFME的的影响r . tuberosal .表所示3。有显著提升血糖在糖尿病对照组与正常对照组相比。HFME管理r . tuberosal . 450毫克/公斤合著。两周会把参数显著向正常对照组。我们的研究表明,HFME的报道降糖效果r . tuberosal .可能部分是通过抑制介导的α淀粉酶活性。

3.4。在网上抑制机制

桦木醇、桦木酸Bisdemethoxycurcumin,姜黄素(图2)对绑定能力α淀粉酶。在网上研究结果(表4)表明,桦木醇具有较高的亲和力α淀粉酶(桦木醇13.12μM;−6.66千卡每摩尔)比桦木酸(75.66μM;−5.62千卡每摩尔),Bisdemethoxycurcumin (45.86μM;−5.92千卡每摩尔),姜黄素(260.62μM;−4.89千卡每摩尔)。它还表明,桦木酸和桦木醇经历了(4),而Bisdemethoxycurcumin和姜黄素未能遵循(4)。此外,氨基酸残基的结合位点进行交互α淀粉酶是氢键。

4所示。讨论

本研究的结果显示,治疗HFMEr . tuberosal .显示了有效的抑制α淀粉酶活性在体外。Ruellia tuberosal获得重视糖尿病控制,因为植物化学的分析表明在HFME类固醇(桦木醇)的存在。Karthic et al。14)也报道,水提物的化合物美国cumini、桦木酸具有结构相似性与桦木醇表现出抑制活动α淀粉酶。

关于抑制剂和之间的相互作用的研究α淀粉酶是有意义的,在获得一个更好的洞察力的机制α淀粉酶抑制。因此,分子对接预测被用来找到可能的抑制机制。Ratna Wulan et al。8)也报道在网上研究桦木醇,类固醇化合物r . tuberosal,is anα淀粉酶抑制剂。Bisdemethoxycurcumin,姜黄素、桦木酸和桦木醇有小,和一个小抑制康斯坦察()。小的值和验证该配体对效率有亲和力α淀粉酶,这表明配体α淀粉酶抑制剂。与以前的研究结果是一致的在体外研究[14,15,23]。Bisdemethoxycurcumin(竞争力抑制剂)和姜黄素(竞争性抑制剂)未能完成(4)。桦木酸(非竞争性抑制剂)经历(4)。这些情况表明,(4)可用于预测非竞争性α淀粉酶抑制剂机制。此外,桦木醇经历(4),这表明它的非竞争性机制。对接结果显示没有范德瓦尔斯,疏水,或静电相互作用存在,但只有氢键发挥了重大作用,桦木醇的绑定,Bisdemethoxycurcumin,姜黄素α淀粉酶。有必要IC50转换成来比较在网上和在体外研究的结果。基于计算使用非竞争性抑制,桦木醇的价值从在体外研究是在314年μ米,近24倍结果在网上。

计算值在体外学习取决于酶的浓度(或目标分子)抑制剂和底物以及其他实验条件。在网上 价值,一种内在的热力学量,是独立于衬底但取决于酶(目标)和抑制剂。这些问题的价值在体外和在网上。

的确认在体外和在网上结果,我们的表现在活的有机体内研究用链脲霉素引起的糖尿病大鼠(STZ)。STZ诱导糖尿病化学实验动物(14]。STZ释放,参与DNA损伤;结果胰腺β肽进行破坏的坏死(24,25]。胰腺的损伤β肽的结果减少内源性胰岛素释放,铺平了道路,减少葡萄糖的利用组织。在这项研究中,STZ诱导糖尿病就会导致大鼠的血糖水平显著提升。一些研究报告,MLD-STZ引起糖尿病1型(26]。1型糖尿病是由于自身免疫破坏产生胰岛素的胰腺β肽导致缺乏胰岛素的分泌。策略之一,治疗糖尿病的方法采用包括抑制碳水化合物消化酵素等α淀粉酶,从而降低餐后血糖水平(9]。在这项研究中,HFME的影响的活动α淀粉酶在活的有机体内被评估。管理450毫克/公斤合著。HFME的Ruellia tuberosal .显著降低了光纤光栅在这些老鼠两周的治疗后,这表明它有低血糖症的性质。这一结果与先前的研究一致在活的有机体内抗糖尿病的潜在的r . tuberosal .提到,这种植物的提取物具有强烈的血糖降低财产alloxan-induced糖尿病大鼠和兔子3,4]。四氧嘧啶和STZ诱导糖尿病在不同的机制,导致血糖水平的一个重要高程和诱导1型糖尿病(27]。HFME包含桦木醇是高度亲脂性的,并且很容易穿过细胞膜,抑制等发挥其药理作用α淀粉酶。的抑制剂α淀粉酶延缓碳水化合物的分解,降低餐后血糖游览一个人患有糖尿病。此外在这项研究中,口服政府HFME被发现拥有重要的()α淀粉酶抑制活动相比,治疗组与正常控制和糖尿病对照组。抑制的能力α淀粉酶在活的有机体内通过光纤光栅介导的HFME表明控制碳水化合物消化的抑制。

5。结论

总之,这项研究的结果表明,机制之一r . tuberosal .展出其低血糖症的可能是通过抑制胰腺癌α淀粉酶。根据在网上的研究中,它作为一种非竞争性抑制剂α淀粉酶。然而,进一步的研究是需要隔离桦木醇并验证非竞争性抑制剂在体外。最后但并非最不重要的,这项研究提供了科学的支持r . tuberosal .治疗DM。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者要感谢教授Aulanni女士的早期草稿深刻的评论。

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