酚类提取物辣木属鉴定叶子抑制关键酶与勃起功能障碍和氧化应激大鼠阴茎组织

文摘

本研究旨在确定提取物的抗氧化性能和抑制效果辣木属鉴定叶子angiotensin-I-converting酶(ACE)和精氨酸酶的活动在体外。提取制备和酚(总酚类和黄酮类)内容、激进(一氧化氮(NO)、羟基(OH))的清除能力,和铁^{2 +}螯合能力进行评估。酚类成分的特征通过高效液相chromatography-diode阵列检测(HPLC-DAD)分析。此外,铁的提取的影响^{2 +}全身的老鼠的阴茎组织匀浆MDA生产ACE和精氨酸酶活动以及它的行动也被确定。提取回收,、螯合铁^{2 +},抑制MDA生产与集成电路模式存在剂量依赖的相关性₅₀值为1.36,0.52,194.23和0.38毫克/毫升µ分别g / mL。没食子酸、绿原酸、槲皮素和山柰酚是最丰富的酚类化合物在叶片中提取。提取也抑制ACE和精氨酸酶活动模式存在剂量依赖的相关性及其集成电路₅₀值分别为303.03和159.59µ分别g / mL。酚醛含量,抑制ACE,精氨酸酶和铁^{2 +}全身的MDA生产和激进的(,)清除和铁^{2 +}螯合能力可能是一些可能的机制m .鉴定叶子可以用于治疗勃起功能障碍和/或管理。

1。介绍

先前的报道表明,勃起功能障碍(ED)是流行在世界各地的1.5亿人,将影响到2025年约有2.5亿人(1]。正常的勃起功能是通过一系列的刺激行动涉及提一个有关海绵体动脉和鼻窦的放松导致增加阴茎血流量(2]。这些行动是由通过一氧化氮的激活——一氧化氮(NO)环鸟苷酸(cGMP)扩张器路径,可以受不同因素造成ED (2]。精氨酸酶活动增加与艾德。精氨酸酶是一种金属酶,精氨酸转化为尿素和鸟氨酸在许多细胞。也有越来越多的证据,ED可以通过根深蒂固的高血压引起的血压的变化可以改变阴茎血管中血液的流动(3]。此外,血管紧张素ⅱ是来自血管紧张素angiotensin-I-converting酶反应催化了我是一个强有力的血管收缩剂能够通过减少诱导血管肥大和内皮功能障碍的释放没有(4]。同样,ACE失效缓激肽、血管舒张药已与勃起功能通过释放没有阴茎海绵体的和放松的5]。血管紧张素I转换血管紧张素ⅱ和失活的缓激肽能引起高血压进而影响勃起功能。

氧化应激已经与ED由于过度提一个有关海绵体组织自由基的生成(6]。过氧化物与一氧化氮(NO)结合形成剧毒的过氧亚硝基诱导脂质过氧化反应。氧化应激在ED降低了可用性的不需要阴茎勃起(6]。最近的趋势在ED的管理包括增加没有水平精氨酸酶抑制剂的使用。这是因为在ED有高浓度的精氨酸酶活动的限制没有合酶活性,减少没有生物合成,增加了精氨酸的降解。抗氧化剂能够降低氧化应激通过清除自由基。多酚是人类饮食中含量最丰富的抗氧化剂和普遍存在成分的水果和蔬菜7]。几项研究已经表明多酚或polyphenol-rich食品的消费之间的各种关系和ED等疾病,糖尿病和心血管和神经退行性疾病(8]。

辣木属鉴定林。(辣木科)俗称鼓棒是药用植物广泛种植于热带和亚热带地区。报告显示,m .鉴定叶子拥有各种药理属性如antiatherosclerosis,抗炎,抗高血压和抗氧化效果9,10]。然而,缺乏信息的可能的作用机制m .鉴定叶提取物对阴茎功能和叶子的能力保护阴茎对Fe^{2 +}全身的脂质过氧化作用。本研究旨在探讨水提取物的抑制效应辣木属鉴定叶子在关键酶与ED (ACE和精氨酸酶)和它的抗氧化潜力。

2。材料和方法

2.1。样品收集

辣木属鉴定树叶从阿库雷主要市场,购买阿库雷,尼日利亚,和认证的作物和害虫管理,联邦理工大学,阿库雷、尼日利亚。的m .鉴定叶子被风干在室温和粉。除非另有说明,所有其他化学试剂使用的分析成绩和水的玻璃蒸馏。一个Jenway紫外可见分光光度计(型号6305;英国Jenway Barlo世界科学、Dunmow)被用来测量吸光度。

2.2。酚类提取

粉末样品(5克)在100毫升蒸馏水浸泡约24小时37°C。混合物在4000转速/分钟过滤和离心10分钟获得一个清晰的上层清液用于后续分析。

2.3。高效液相Chromatography-Diode阵列检测器(HPLC)分析

色谱分析进行了梯度条件下使用C₁₈列(4.6毫米×150毫米)挤满了5μ米粒子直径;流动相是水含有1%甲酸(A)和乙腈(B), B的成分梯度是13%,直到10分钟并改变获得20,30岁,50岁,60岁,70年,20岁和10% B在20岁,30岁,40岁,50岁,60岁,70,和80分钟(11]。辣木属鉴定0.45叶提取物和流动相过滤μm膜滤器(微孔),然后由超声脱气浴之前使用;分析了提取20毫克/毫升的浓度。流量是0.7 mL / min,注入体积是40μL,没食子酸的波长为254 nm, 280 nm儿茶素和表儿茶素,325 nm绿原和鞣花酸和365 nm槲皮素、槲皮甙、异槲皮苷、芦丁、山柰酚。股票的解决方案的标准参考准备在高效液相色谱流动相的浓度范围0.030 - -0.250毫克/毫升为山柰酚、槲皮素、槲皮甙、异槲皮苷、芦丁、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸0.050 - -0.450毫克/毫升,高卢和绿原酸。色谱峰被证实通过比较他们的保留时间与参考标准和爸爸光谱(200 - 500海里)。

2.4。总酚含量测定

提取的总酚含量测定所描述的单等。12]。短暂,适当的稀释提取Folin-Ciocalteu试剂氧化为2.5毫升10% (v / v),纳科中和2.0毫升的7.5%₃。反应混合物孵化了40分钟在45°C和765海里的吸光度测定分光光度计。没食子酸作为标准和总酚含量后来没食子酸当量计算。

2.5。总类黄酮含量的测定

总类黄酮含量是决定使用稍微修改的方法(13]。短暂,0.5毫升的适当稀释提取混合0.5毫升的甲醇,50μL 10%的间变性大细胞淋巴瘤引起₃,50μL 1 M乙酸钾和1.4毫升H₂o .混合物在室温下孕育了30分钟。此后,反应混合物的吸光度后来以415海里。槲皮素作为标准和总类黄酮含量计算槲皮素等价。

2.6。一氧化氮清除活动

一氧化氮清除试验进行了使用格里斯试剂方法(14]。短暂,0.3毫升的硝普酸钠(5毫米)加入1毫升的每个不同浓度的提取。管被孵化25°C 150分钟。150分钟后,0.5毫升的格里斯试剂(相同体积的1%对氨基苯磺酰胺5%磷酸和0.01%萘基乙二胺在蒸馏水中,使用后12 h(准备)是补充道。吸光度测量546海里。

2.7。羟基自由基清除能力

哈里维尔和Gutteridge的方法(15)是用来确定提取的能力,防止铁^{2 +}/小时₂O₂全身的脱氧核糖的分解。提取0 - 100μL 120年添加到反应混合物μ400年20毫克脱氧核糖,LμL 0.1磷酸盐缓冲剂,40岁μL 500年μ米菲₂所以₄,体积是800μL与蒸馏水。反应混合物在37°C孵化为30分钟,反应就停止添加0.5毫升的28%三氯乙酸。其次是增加0.4毫升的0.6%硫代巴比土酸溶液。管随后被孵化的沸水了20分钟。吸光度测量在532 nm的分光光度计。

2.8。菲^{2 +}螯合试验

的铁^{2 +}提取的螯合能力决定使用稍微修改的方法(16,17]。刚做好的500μM FeSO₄(150μL)于168年添加到反应混合物μL 0.1 Tris-HCl (pH值7.4),218年μ盐水(0.9%)、L和提取(0-25μL)。5分钟的反应混合物是孵化前的13μL 0.25% 1, 10-phenanthroline (w / v)。吸光度是随后在分光光度计测量510海里。铁(II)螯合能力随后被计算。

2.9。阴茎组织匀浆的制备

老鼠被砍下温和的乙醚麻醉和快速切割。阴茎组织被放置在冰和体重。这些组织随后均质在寒冷的盐水(1/10 w / v)约为10-up-and-down中风大约1200在聚四氟乙烯玻璃高速搅拌器转速/分钟。匀浆是离心10分钟3000×g产生颗粒,丢弃和低速上层清液(S1)被关了脂质过氧化反应试验。

2.10。脂质过氧化和硫代巴比土酸反应试验

百微升(100μL)阴茎的匀浆上清液混合,混合物包含30μL 0.1 Tris-HCl缓冲区(pH值7.4),提取(0 - 100μL)和30μL prooxidant (250μM硫酸铁(II))。体积是300μL蒸馏水在孵化前的37°C 2 h。颜色反应是由增加300μL 8.1% SDS(十二烷基硫酸盐钠)包含匀浆的反应混合物,其次是增加600μL乙酸/盐酸(pH值3.4)和600年μL 0.8%的硫代巴比土酸(稍后通知)。这种混合物在100°C的环境1 h。硫代巴比土酸活性物种的吸光度(TBARS)为532 nm。MDA(丙二醛)生产用%表示控制(18,19]。

2.11。Angiotensin-I-Converting酶(ACE)抑制试验

提取物的抑制ACE活性决定根据Cushman的描述方法和张20.]。不同浓度的提取和50μL(兔肺ACE (EC 3.4.15.1)解决方案(4亩/毫升)在37°C preincubated 15分钟。此后,酶反应是由增加150μL(8.33毫米ACE衬底(hippuryl-l-histidyl-l-leucine (HHL)]的125毫米Tris-HCl缓冲区(pH值8.3)37°C的反应混合物和孵化了30分钟。通过添加250反应停止μL 1 M盐酸。马尿酸(Bz-Gly)产生的反应与1.5毫升乙酸乙酯提取。混合物被离心分离乙酸乙酯层,之后1毫升的乙酸乙酯层被转移到一个干净的试管和蒸发干燥。残渣再溶解在蒸馏水和吸光度测量在228海里。每个浓度的平均值从三个决定是用来计算ACE抑制浓度在1.25和6.30之间μg / mL用作控制。

2.12。精氨酸酶抑制试验

阴茎匀浆是由均质化10 g (w / v)的阴茎组织均一化冷三卷缓冲(磷酸盐缓冲剂,pH值7.2)。匀浆是离心20分钟4000 r.p。m和上层清液作为酶的来源。精氨酸酶活性测定尿素的测量由埃利希试剂的反应。反应混合物包含在最终浓度1.0毫米Tris-HCl缓冲区,pH值9.5,包含1.0毫米MnCl 0.1精氨酸酶制剂的解决方案和50毫米的最终体积1.0毫升。混合物是孵化10分钟37°C。反应被终止的2.5毫升埃利希试剂(2.0 g的p-dimethylaminobenzaldehyde 20毫升的浓盐酸和由100毫升蒸馏水)。光密度读数被20分钟后450海里。没有执行的控制实验测试样本和精氨酸酶抑制活性表达为抑制百分比(21]。

2.13。数据分析

三个复制的结果汇集和表达为平均值±标准偏差(美国)。学生的以及,单向方差分析(方差分析)和最小意义差异(LSD)进行了22]。意义是接受。集成电路₅₀确定使用非线性回归分析。

3所示。结果

3.1。酚醛概要

HPLC-DAD分析如表所示1和图1显示没食子酸等酚类化合物的存在(105.67毫克/克),儿茶素(20.19毫克/克),绿原酸(79.31毫克/克),和鞣花酸(52.95毫克/克)和槲皮素等黄酮类化合物(137.81毫克/克)、槲皮甙(74.9毫克/克)、异槲皮苷(75.65毫克/克)、山柰酚(106.75毫克/克),和芦丁(60.38毫克/克)。总酚和类黄酮含量的结果m .鉴定叶提取展示在表2。总酚含量报告为没食子酸当量15.2 mgGAE / 100 g,而总类黄酮含量报告为槲皮素相当于3.1 mgQUE / 100 g。

3.2。自由基清除能力

酚类提取剂量依赖性回收和如数据所示2和3,分别。集成电路₅₀值是0.52毫克/毫升()和1.36毫克/毫升()(表3)。

3.3。菲^{2 +}螯合能力

图4显示了铁^{2 +}酚类提取物的螯合能力m .鉴定。提取能够螯合铁^{2 +}剂量依赖性的方式集成电路₅₀= 0.38毫克/毫升,如表所示3。

3.4。抑制丙二醛的生产

阴茎组织匀浆的孵化铁的存在^{2 +}导致显著增加()丙二醛(MDA)含量(120.58%),如图5。然而,酚类提取物m .鉴定叶子与IC剂量依赖性抑制MDA水平的方式₅₀值为194.23μ克/毫升(表3)。

3.5。酚类提取物的影响m .鉴定叶子在ACE和精氨酸酶的活动

酚类提取的交互ACE如图6表明,酚类提取物m .鉴定叶子抑制ACE活性在体外与集成电路模式存在剂量依赖的相关性₅₀303.03μ克/毫升。此外,在图的结果7显示,酚类提取与集成电路抑制剂量依赖性的方式中精氨酸酶活性₅₀= 159.59μ克/毫升(表3)。

4所示。讨论

m .鉴定已知各种药用福利和这些都是归因于其植物化学物质如酚类化合物(10,23]。这些植物化学物质能够导致人体的生理行为。报告显示,酚类药用植物的内容与他们的抗氧化能力24]。这一研究获得的结果表明,酚类提取物m .鉴定的叶子表现出羟基(OH)和一氧化氮(NO)自由基清除能力。生成羟基自由基(OH)主要是在生物系统超氧化物阴离子和过氧化氢的Haber-Weiss通过芬顿反应或过氧化氢反应(25]。氢氧自由基()是高活性,精力充沛,短暂的,和非常有害的细胞(26]。研究表明,活性物种,如羟基自由基()发挥重要作用在糖尿病引起ED (27,28]。的的清除能力m .鉴定叶提取物可能是由于多酚类物质的存在,可以捐赠氢原子哦自由基,从而抑制氧化法(29日]。一氧化氮自由基(),诱导的形式生成的一氧化氮合酶(NOS)在炎症反应,调节许多细胞毒性和病理过程,可以在一定程度上有助于形成的斑块在阴茎组织(30.]。虽然没有勃起的起始中介需要放松的阴茎海绵体平滑肌和阴茎组织,它还可以结合超氧化物(过氧亚硝基)形式。没有之间的交互和活性氧(ROS)是艾德的病理生理学(核心31日]。过氧亚硝基细胞毒性,导致脂质过氧化反应和硝化反应导致丙二醛和氢过氧化物的形成32]。虽然过氧硝酸盐引起平滑肌松弛,也增加内皮细胞凋亡的发生率,减少没有的合成和生物利用度33]。因此,的清除能力m .鉴定叶提取物作为显示在这项研究可以在勃起功能障碍的管理是有益的。因此,增强人体的抗氧化状态可能是一个实际的方法,氧化应激勃起功能障碍是可以管理的。

体内铁平衡系统的破坏会导致铁过载与氧化应激有关ED (34]。铁过载增加活性氧簇(ROS)的形成导致脂质过氧化反应的起始35]。铁二世(铁^{2 +})与氢反应₂O₂在芬顿反应生产高活性氢氧自由基,可以破坏蛋白质、脂质、核酸。我们的研究结果显示,酚类提取物m .鉴定叶子能够螯合铁^{2 +}剂量依赖性的方式。这种螯合能力可能是由于一些植物化学物质如多酚类物质的存在。酚类化合物和铁能形成一个复杂从而帮助其从身体排泄。菲^{2 +}螯合能力m .鉴定叶提取物可能因此是有益的管理/预防勃起功能障碍(36]。此外,Akomolafe et al。37]建议没食子酸等酚类化合物、绿原酸、儿茶素、山柰酚、槲皮素、槲皮甙能干扰铁的新陈代谢从而螯合金属离子。

超氧化物阴离子和其他活性氧物种已被证明是一个主要贡献者勃起功能障碍的发病机制通过脂质过氧化反应的起始38,39]。增加,丙二醛(MDA)含量中培养时,大鼠阴茎组织匀浆中菲的存在^{2 +}可以通过分解过氧化氢生成(40]。菲^{2 +}全身的细胞膜的脂质过氧化作用导致氧化应激,减少抗氧化酶,导致损伤阴茎组织(41]。根据贾et al。42]DNA氧化损伤可能发生通过膜多不饱和脂肪酸的过氧化分解。各种细胞的DNA损伤影响体内平衡导致细胞死亡(43]。然而,抑制MDA生产造成的提取物m .鉴定叶子可以归因于螯合铁的提取的能力^{2 +}和回收激进分子从而防止氧化损伤的起始39]。

一些实验调查显示,增加血压可能与勃起功能障碍(44]。因此抑制angiotensin-I-converting催化作用的血管紧张素I转换酶血管紧张素ⅱ对降低血压有显著影响从而激活释放任何可以改善勃起功能。此外,抑制ACE激活血管舒缓激肽在内在勃起功能5,44]。血管紧张素转换酶抑制剂发挥宝贵的作用在患者高血压和勃起功能障碍。观察到酚类提取物的抑制效应m .鉴定叶子王牌活动可能是酚类成分有关,这可能导致勃起功能。以前的报告表明,酚醛树脂可以与二硫化物桥梁存在表面的酶从而修改结构和降低其活动(45]。

没有生物利用度下降由于内皮功能障碍或神经损伤是勃起功能障碍的主要诱发因素(45]。精氨酸酶水平的提高是常见的ED患者由于减少一氧化氮合酶(NOS)活性和损伤的生物合成一氧化氮(NO)通过NO-cGMP通路(46]。因此,精氨酸酶活性的抑制作用存在剂量依赖的相关性m .鉴定叶提取物可能是艾德的管理意义重大,因为这将增加性兴奋期间生殖器血流量。酚类提取物的抑制性能m .鉴定叶子可以归因于酚醛组件。多酚具有抑制已报告对精氨酸酶活性的影响(47,48]。此外,黄酮类化合物如儿茶素、表儿茶素、槲皮素及其衍生物(槲皮甙、异槲皮苷)显示强烈的精氨酸酶活性抑制剂,可以联系的形成氢键和疏水相互作用的多酚类化合物和酶的疏水活性部位47,48]。

5。结论

抗氧化性能和ACE和精氨酸酶酚类提取物的抑制效应m .鉴定表明,这种植物叶子治疗勃起功能障碍的潜在管理。这些研究结果还显示可能的作用机制m .鉴定叶的管理/治疗。然而,这种促进健康效应是建议其酚和类黄酮含量的函数。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关。

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