多态性对血清淀粉样A4蛋白糖基化的影响

文摘

血清淀粉样蛋白A4 (SAA4)是一种本构载脂蛋白的高密度脂蛋白。在下半年,展品N-linked糖基化。既有糖化和nonglycosylated形式在等离子体和个体之间的这两种形式的比例各不相同。本研究进行检查的影响遗传多态性的SAA4糖基化状态。健康受试者,55年SAA4多态性被PCR直接测序和分析其糖基化的地位被免疫印迹分析。结果表明,糖基化的百分比在71年主题与氨基酸替换位置和/或84显著()高于野生型学科。多态性没有影响SAA4的血浆浓度。这些发现表明,蛋白质结构的变化改变SAA4分子糖基化的效率。的功能含义这应该是感兴趣的。

1。介绍

血清淀粉样蛋白A (SAA)是一种多态蛋白(1- - - - - -4]。在人类中,SAA蛋白质编码在四个位点,被称为SAA1,SAA2,SAA3,SAA4。SAA3是一个假基因,而其他编码的产品,这是screted从肝脏和绑定到血液中高密度脂蛋白(HDL)。的合成SAA1和SAA2(急性期SAA;A-SAA)增加炎症性疾病。他们可能在免疫系统中发挥的作用,脂蛋白代谢和组织修复期间或之后炎症(2,3]。他们也AA的前体蛋白,血清的主要成分活性淀粉样变(4]。与A-SAA SAA4,本构SAA换句话说,不是明显升高的炎症,不形成淀粉样原纤维(5- - - - - -7),除了它的变体(8]。SAA4有112个氨基酸,插入位置对应的八个氨基酸残留A-SAA [705]。该插入生成N-linked糖基化。有趣的是,SAA4并非完全糖化;两种形式,糖化(G)和nonglycosylated (NG),等离子体(图中观察到1)。因为我们注意到G的比率:NG也各不相同,个人在个人可能是常数,本研究旨在研究是否SAA4的糖基化是基因调控。

2。材料和方法

2.1。样品

研究生物伦理委员会批准的协议是人类基因组和基因分析,有望医科大学(13 - 17)。52名健康成人(22雌性和雄性30),年龄在21到80年,自愿参与本研究。以来罕见的多态性在女性的两个网站,发现了她的丈夫,儿子,女儿被添加到分析。包含EDTA血管了。离心后,获得了等离子体和保持在−20°C和DNA提取巴菲外套和储存在−20°C。

2.2。免疫印迹

等离子体稀释1:100年与电泳样品缓冲和10μL是受到tricine十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到聚乙烯二氟化物膜,如前所述[7]。膜被1%牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐(PBS) 1小时在室温下反应(RT),然后用2μg / mL兔子反SAA4抗体(9在RT) 1小时,其次是反应1:1000稀释peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白(美国生物科学Inc .)为1小时RT,然后,作为衬底,EzWestLumi +(阿Corp .)、日本)应用和输出进行了分析使用化学发光图像分析仪系统,Ez-Capture毫克(阿)。使用CS Analyzer 3.0软件系统,两者的强度SAA4-corresponding乐队被阅读。每个样本的SAA4浓度计算强度的两个乐队相比之下与血清,SAA4浓度是已知的(9]。

2.3。DNA分析

SAA4外显子2,3,4,受到PCR直接测序之前报道[紧随其后8]。这是上执行所选的科目如下所述。的基础上外显子的snp发现4,PCR-RFLP方法建立了筛选分析。PCR进行30 94°C的周期,1分钟;54°C, 1分钟;和72°C, 1分钟使用正向引物(CCAGGGTCTATCTTCAGGGATTAATAGAGT),包括限制站点和反向引物(TTCAGTATTTCTTAGGCAGGCCGTCAGGTC)。消化与AfaI(豆类、日本),71年削减野生型序列的残留物,或TaqI(豆类),84年削减野生型序列的残渣,评估在琼脂糖凝胶。

3所示。结果

免疫印迹结果主要分为三个模式(图1):模式1:nonglycosylated形式(NG)占主导地位(对应图的糖基化比例< 40%3),模式3:糖基化的形式(G)占主导地位(对应图的糖基化比例> 60%3),模式2:1和3之间的中间模式。52名受试者中,42例(80.8%),6例(11.5%),4例(7.7%)显示模式1、2和3分别。有人看见一个微弱的乐队在nonglycosylated SAA4模式3。这可能与一个转译后的C-terminus-degraded物种(10),尽管这还没有得到确认。

DNA测序的四个外显子进行了两个主题在免疫印迹每组表现出不同的模式。受试者的数据显示模式1与以前的报告(完全同意5),被称为野生型。对象显示模式2有一个等位基因在渣替代71年从TAC TGC,这将改变酪氨酸的氨基酸半胱氨酸。两个学科的一个显示模式3有一个等位基因与一个替换84从TCG TTG残留物,从而改变氨基酸的丝氨酸亮氨酸。上面的其他有相同的替换71年和84年在残留。为了定义最后的单体型,她的丈夫和两个孩子进行了分析。丈夫显示模式1免疫印迹和野生型序列的纯合性,而两个孩子显示模式2和杂合性残留84替换(图2)。因此,渊源者显示两个替换一个等位基因^71年酪氨酸和^84年亮氨酸和其他^71年半胱氨酸和^84年爵士。

替换以来没有找到另一个外显子,外显子4中的两个snp分析剩余的科目。糖化形式的百分比(% G)和血浆浓度SAA4各组之间比较每个多态性(图显示3)。受试者的平均% G与野生型的人^71年酪氨酸取代,那些^84年Ser替换为24.1%,50.5%,和53.1%,分别。% G替换明显()高于野生型。之间没有差异% G指出替换^71年酪氨酸和^84年爵士。也没有SAA4不同浓度组中。

4所示。讨论

本研究显示多态性的SAA4糖基化效率的影响。N-glycosylation现象中,一个低聚糖与天冬酰胺侧链oligosaccharyl转移酶。天冬酰胺结构周围环境可能因此确定寡糖的糖基化效率通过改变访问或oligosaccharyl转移酶。然而,由于SAA4的三级结构尚未阐明,讨论无法超越的猜测。已经假定的多肽链需要为了让合适的碳水化合物附件(天冬酰胺网站11]。事实上,基于计算机的二级结构预测(PSIPRED和GOR4方法)表明,N-glycosylation网站SAA4分子采用随机线圈构象无关的氨基酸替换残留71年和84年(12,13]。构象差异引起的氨基酸替换可能仅存在于螺旋区域毗邻N-glycosylation网站。这种差异可能影响的规模和灵活性展开N-glycosylation网站,导致糖基化的效率的差异。

SAA4本构载脂蛋白的高密度脂蛋白。其生理功能几乎是未知的。SAA4的血浆浓度,不同个体间,也没有与其他主要载脂蛋白(9]。我们以前报道,SAA4可以最低限度诱导炎症条件(14]。如果它在炎症过程中发挥作用,糖基化的状态SAA4可能功能的影响。

在先前的研究中,我们报道了SAA1多态性影响SAA含量(特别是A-SAA浓度)15]。的一个原因可能是,SAA多态性影响SAA的亲和力,高密度脂蛋白紧随其后的是等离子体间隙的变化,这是由我们的实验使用重组SAA1同形像(16,17]。目前的研究表明,多态性影响糖基化SAA4浓度没有影响,这表明糖基化可能不发挥积极作用在SAA4代谢水平足以影响血浆浓度。然而,它可能是值得研究SAA4之间的交互和高密度脂蛋白,关注SAA4多态性及其相关糖基化状态。它可能是一个触发器,可以提供一个提示SAA4函数。

总之,糖基化受到SAA4的多态性。其生物学意义,加上SAA4的生物功能,需要进一步调查。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由淀粉样变的补助金支持研究委员会研究棘手的疾病来自卫生部、劳动和福利,日本。作者感谢久美子Namatame、Takako Muto Tomomi Kaku的技术支持。

引用

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