评估生物退化酶真菌污染的活动与也门一些古代木乃伊保存在国家博物馆

文摘

也门复杂的木乃伊化使用化学保护盛行于古代文明在公元前4世纪国家博物馆的木乃伊也门萨那,用于这项研究。五个木乃伊被用来评估产生的水解酶的真菌污染。47个真菌物种隔离,从而反映出高度的污染可能导致通风不良和保存系统。曲霉属真菌是最常见的属孤立(48.9%)。十五分离表现出能够产生纤维素酶(EC;3.2.1.4),曲霉属真菌candidus被cellulose-producer最高。果胶裂解酶(PL、电子商务;4.2.2.2)和果胶甲基酯酶(EC中外;3.1.1.11)产生的木霉属hamatum,而几丁质酶(EC);3.2.1.14)是由黑曲霉。蛋白酶活动被只指出枝孢属herbarum。这些真菌水解酶的活动越高代表生物腐蚀的主要威胁包括亚麻绷带恶化以及木乃伊尸体。因此,建议完善保护制度在国家博物馆的木乃伊来减少污染的最低水平和保护生物腐蚀的木乃伊。

1。介绍

人类木乃伊非常容易破坏环境因素(1]。有许多非生物和生物因素,如污染、光、湿度、温度、微生物和昆虫,对博物馆有恶化影响材料(2]。木乃伊上最严重损害发生的微生物如细菌、放线菌和真菌(1,3,4]。

在一个室内环境中,真菌是最危险的微生物负责biocontamination博物馆收藏。博物馆与细菌的增长是有限的,他们需要水,真菌能够增长相对较低的温度和湿度水平如通常保持在博物馆(5,6]。即使在非常恶劣的条件包括干燥和低温,真菌孢子可以生存很长一段时间(7]。真菌通常出现在显示和储存条件的博物馆(8,9]。

真菌降解是一个最高的古代木乃伊的恶化的风险因素(10,11]。真菌似乎是一个主要特性的恶化在世界各地许多国家的博物馆(8,12]。真菌分泌的酶消化有机物,从而改变和削弱这些材料。此外,许多模具包含有色物质,可能导致污渍和斑点纺织品和纤维的强度降低。许多真菌可能是危险的人,在某些情况下造成重大的健康风险和引起人畜共患表面感染由于入侵肌肤角质化的组织,头发和指甲(13,14]。

真菌生物退化导致的质量或价值的改变材料和功能利用率而言会降低。电池所分泌的胞外水解酶真菌导致的形成酸性产品,导致材料的化学蚀变受到攻击(15]。多种纤维素酶催化水解纤维素,打破内部债券以破坏其结晶结构,并使个人纤维素多糖链(16]。果胶酶催化水解果胶物质容易溶于水。Pectolytic酶分为两类,即果胶酯酶和果胶解聚酶。前酶deesterifies切除甲氧基果胶的残留物,叫做果胶甲氧基酯酶(中外),而后者分裂主链和进一步分类为聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶裂解酶(PL) [17- - - - - -19]。几丁质酶是糖基水解酶的降解能力β1,4-linked不溶性的线性聚合物N乙酰氨基葡萄糖(甲壳素)直接向低分子量chitooligomers [20.]。复杂的组织蛋白酶的水解酶,蛋白质水解成小肽和氨基酸的水在酰胺债券。他们已经进化出不同种类的蛋白酶,执行相同的使用完全不同的催化反应机制。真菌产生酸,中性、碱性和metalloproteases。一个有机体可以生产超过一种类型的蛋白酶(21]。真菌蛋白酶活性在一个大的pH值范围(pH值4 - 11)和具有广泛的底物特异性22]。

也门古代木乃伊发现于1983年在山附近的洞穴里Shebam al-Giras获救的考古部门考察萨那大学(23]。也门埃及木乃伊不同于。他们老,回到公元前4世纪根据放射性碳的结果分析的皮革和细麻布24]。死者尸体处理不同于埃及的。当地材料用于木乃伊吸收水分,如raa植物(Aerva是)、指甲花(Lawsonia inermis)、没药、和其他芳香植物被用来保存尸体。铁的氧化物和硫是用来固定蛋白质的尸体。完成该过程的尸体被包裹在亚麻(亚麻属植物usitatissimum)绷带。包扎发生在一个长时期的天(25]。大部分的材料用于木乃伊是天然有机物质。因此,这些木乃伊是容易恶化。此外,博物馆的木乃伊尸体的存储条件显示在不适合的环境条件。这些木乃伊是特别重要的,因为他们描绘古代文明和它的使用先进的医学和科学知识的保存尸体。

本研究旨在筛选真菌污染的五个也门古代木乃伊保存在国家博物馆的也门萨那。真菌是纤维素酶水解酶评估、PL中外,几丁质酶和蛋白酶。这反过来将有助于我们理解使用更好的防腐保护程序为了维护木乃伊从未来的损失。

2。材料和方法

2.1。木乃伊的样品

五个木乃伊保存在国家博物馆的也门萨那被用于本研究收集的真菌污染。使用的木乃伊的细节如表所示1。

2.2。筛选真菌污染

样本取自不同的皮肤区域(脸,手,脚)的五个木乃伊。真菌分离使用传统的方法抽汲,裸奔26在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。盘子在孵化°C为7天。三个复制每个样本的准备。合成殖民地分离、纯化和鉴定。确定真菌的纯文化转移到倾斜和用于生理研究。真菌被确定基于形态学根据强奸犯和芬内尔(27],埃利斯[28,巴内特和猎人29日]。

2.3。筛选分离出真菌的水解酶活性

21隔离检查生产常见的水解酶的能力。下列标准方法用于测定酶活性:纤维素酶(30.),果胶酶(31日),几丁质酶(32),和蛋白酶33]。

2.4。生产的酶液体营养

被发现具有活性最高的隔离每个酶固体媒体则生长在液体媒体进行进一步分析。

2.5。生长条件

真菌生长在是厄伦美厄烧瓶(100毫升)含25毫升的液体生长介质。灭菌后,烧瓶内注射一个6毫米盘的边缘剪5 d群真菌Czapek琼脂培养基上生长。接种的玻璃瓶被孵化为固定文化在30°C 7日14日和21天34]。实验进行了一式三份。

2.6。生长培养基

纤维素酶。100毫升的液体培养基中含有纤维素,1 g;(NH₄)₂所以₄,0.14克;K₂HPO₄,0.6克;KH₂阿宝₄,0.20克;和MgSO₄ 7小时₂啊,0.01 g在蒸馏水35]。一个孤立的曲霉属真菌candidus被接种到无菌媒体纤维素酶的生产。

果胶酶。木霉属hamatum隔离是用于PL和PG酶的生产使用中所描述的Eggins和普36]。每1000毫升是果胶组成,10 g;L-asparagine, 0.5克;(NH₄)₂所以₄,0.5克;KH₂阿宝₄,1.0克;氯化钾,0.5克;CaCl₂,0.2克;酵母提取物,0.5克;MgSO₄ 7小时₂啊,0.2 g在蒸馏水。使用醋酸缓冲pH值调整到5。

几丁质酶。黑曲霉隔离是用于生产几丁质酶的使用中所描述的徐和洛克伍德32]。100毫升的液体培养基含有纳米₃,0.5克;KH₂阿宝₄,0.2克;氯化钾,0.1克;酵母提取物,0.05克;MgSO₄7小时₂啊,0.05 g在蒸馏水。使用醋酸缓冲pH值调整到5。

蛋白酶。枝孢属herbarum在液体介质隔离用于蛋白酶生产被阿里(37]。1000毫升的液体生长介质包含K₂HPO₄,1 g;MgSO₄ 7小时₂啊,0.5克;氯化钾,0.5克;FeSO₄ 7小时₂啊,0.01克;蔗糖、30克;酪蛋白,1% (w / v)蒸馏水。使用醋酸缓冲pH值调整到5。

2.7。酶测定

文化滤液被用作所有提到的粗酶制剂酶。

纤维素酶活动是衡量估计解放的还原糖量使用地乐酚水杨酸(DNS),根据米勒(38与修改Bernfeld []39使用葡萄糖标准曲线。吸光度是阅读使用煮沸酶控制在540海里。被定义为一个单位的纤维素酶活动数量的酶,这种酶催化1的解放μ摩尔/分钟的还原糖用葡萄糖作为标准。

果胶酶。两种酶的果胶酶家族估计。(一)果胶裂解酶(PL)活动是化验spectrophotometrically通过确定uronide在235纳米40]。3毫升的反应混合物含有果胶0.1% 0.05 Tris-HCl缓冲区(pH值8)和0.5毫升的文化滤液。反应混合物在30°C 3小时孵化。然后3毫升0.01 N盐酸和1毫升的反应混合物混合,光密度阅读。一个单位的PL活动被定义为酶的数量导致吸光度的增加在30分钟的0.01。(b)果胶甲基酯酶(中外)活动被安德烈•柯特兹(化验基于描述的方法41由Olutiola和Akintunde[]和修改42]。消毒25毫升锥形瓶,2毫升的文化滤液混合5毫升的1.2%果胶(在0.05 M Tris-HCl缓冲区包含5毫米碳酸钠,pH值8)。瓶孵化在水浴30°C 3 h随后与0.02 N氢氧化钠滴定调整pH值8。中外职业活动的一个单位被定义为所需的酶量增加1μ相当于每小时氢氧化钠反应保持在pH值8。

几丁质酶活动根据Monreal估计和里斯(43]。5毫升反应混合物含有1%的胶体几丁质磷酸盐缓冲剂(pH值5)和1毫升的文化滤液。混合物在37°C 1 h,孵化反应被添加0.5毫升的DNS,水浴中煮15分钟,冷却到室温。当时光密度测量在540 nm合适的空白。发布的还原糖决心从葡萄糖的标准曲线。一个单位的几丁质酶活性被定义为酶的数量,产生1μ摩尔还原糖的分钟⁻¹在试验条件下。

蛋白酶活动的方法估计Folin和Ciocalteu44]。反应混合物5毫升的0.65%酪蛋白(pH值7.5)和1毫升的酶提取被旋转混合好,孵化在37°C 10分钟。反应被添加5毫升的冷10%三氯乙酸和孵化在37°C为30分钟。这是绘画纸滤纸过滤,滤液从而获得用于显色。5毫升的Na₂有限公司₃和1毫升Folin-Ciocalteu (FC)的试剂添加到一个整除的滤液和孵化37°C 30分钟和吸光度是读660海里。氨基酸释放的数量是酪氨酸的使用标准曲线计算。被定义为一个单位的蛋白酶活动产生的酶量1μ摩尔酪氨酸的最小值⁻¹在试验条件下。

蛋白质含量。可溶性蛋白据洛瑞等人估计方法(45),使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。

2.8。干重的测定

真菌菌丝生长介质的分离通过绘画纸没有过滤。1滤纸。菌丝进行清洗和干燥在烤箱60°C 24 h。菌丝干重的被记录。

2.9。统计分析

双向方差分析(方差分析)是用于统计评价酶活动和干重使用GraphPad棱镜版本6。数据显示为平均数±标准差。的价值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

15种10属的真菌从五也门古代木乃伊PDA被孤立。真菌分离出所有样品的总数是47(表2)。木乃伊1 (M1)最低真菌污染,也就是说,只有两种曲霉属真菌(图1)。相比之下,M4显示最高污染9种(图12隔离1)。另一个木乃伊显示中度污染。根据分离出真菌的数量从5个木乃伊,从高到低的顺序如下:污染M4 > M2 = M5 > M3 > M1(图1)。

真菌的多样性的每个妈妈,虽然在同一个博物馆保存,可能是由于环境条件,在每个房间内不同博物馆由于几个因素包括建筑物的施工和设计。此外,木乃伊被发现的地方不同。每个妈妈都保存在一个单独的房间,和保存条件不同房间的通风、湿度和温度(数据未显示)。除此之外,一些木乃伊被消毒剂,而其他人没有。

曲霉属真菌是最常见的属从高频率的木乃伊样本中分离出的真菌总数的48.94%,最常见的物种吗答:尼日尔(25.53%)紧随其后答:flavus(10.63%),答:来自烟,a, candidus演变来和答:ustus在低频隔离。枝孢属和青霉菌被孤立在温和的频率占14.89%和12.76%,分别。Aureobasidium支链淀粉,毛壳菌属thermophilum,毛霉菌circinelloides, Scopulariopsis koningii,葡萄穗霉属chartarum,木霉属hamatum,和Ulocladium chartarum从木乃伊标本分离出罕见的发病率。

我们的结果表现出类似真菌污染相比,隔离来自埃及木乃伊。这些措施包括链格孢属清塞音,曲霉属真菌humicola,黑曲霉,Chaetomella可怕的,毛壳菌属globosum,Hormodendrum viride,青霉菌corylophilum(11]。23木乃伊从墓地和墨西哥北部被发现主要的洞穴青霉菌,曲霉属真菌,枝孢属,链格孢属,假丝酵母tropicalis,和白色念珠菌(46]。还三种曲霉属真菌其中一个链格孢属被发现与开放deteriogens骨架有关长颈鹿在印度旁遮普大学的动物学博物馆拉合尔(47]。

24隔离检查的能力产生纤维素酶,果胶酶,几丁质酶和蛋白酶。其中,15分离酶潜在(表展出3)。纤维素酶降解纤维素二糖,而内切葡聚糖酶把纤维素链以随机的方式和exoglucanases先后从nonreducing删除单纤维二糖和葡萄糖单位年底纤维素链(10]。在这项研究中曲霉属真菌,candidus演变来Aureobasidium支链淀粉,Ulocladium chartarum,枝孢属cladosporioides, a . ustus和青霉菌sp,分别表现出高降解纤维素能力活动基于区域面积。类似的结果表明,青霉菌sp.产生高纤维素的活性[48]。另一方面,酶提取获得答:尼日尔和答:terreus被发现丰富的β葡糖苷酶(49]。曲霉属真菌candidus纤维素酶是准备定量估计;它显示出纤维素酶活性显著降低,潜伏期(图2(一个))。也门古代木乃伊是2000岁,他们的木乃伊制作过程包含许多植物材料。大量的物种能够产生纤维素酶表明这种酶降解的主要原因的亚麻绷带木乃伊和其他材料。

Pectinolytic活动是最重要的一个的真菌胞外酶水解果胶物质通常存在于植物细胞壁(50]。我们的研究结果显示,在检测真菌,青霉菌echinulatum和木霉属hamatum显示最高pectolytic活动对果胶酶酶,果胶甲基酯酶(中外)和果胶裂解酶(PL)。这些结果与很多研究显示一致木霉属sp。51),Pencilliumsp.是最常见的果胶酶生产商(50]。相比之下,曲霉属真菌sp.显示最高pectinolytic活动(52)紧随其后Scopulariopsis koningii和毛霉菌circinelloides。PL和中外职业活动木霉属hamatum没有任何差异的具体活动在第二周孵化酶(数字2 (b)和2 (c)),但在第三周均显示明显的海拔(表4)。这表明果胶酶酶是参与真菌代谢和可以帮助增长适应。这些酶起着重要的作用在日益恶化的亚麻绷带以及木乃伊。

我们的研究显示的结果答:尼日尔和p . citrinum能够产生几丁质酶酶。这些结果类似于高chitinolytic活动答:尼日尔(53]。然而,木霉显示最大chitinolytic活动从8 5属真菌物种与农业土壤样本(54]。产生的几丁质酶的活性答:尼日尔显示急性减少第二周的孵化时间相比第一周(图2 (b))。这表明几丁质酶的酶答:尼日尔与木乃伊的皮肤没有参与分离株的生长适应性。

蛋白水解酶是一大群酶裂解肽债券的蛋白质碎片和氨基酸。真菌引起的胶原蛋白水解作用依赖于许多因素,如存储和环境条件,除了某些物质的存在,驻留在木乃伊的皮肤(10]。在我们的结果中,只有一个真菌隔离能够产生蛋白水解活性(表2)。这种隔离是c .标本。发现的蛋白水解活性降低孵化而2周后,3周后,提升了2倍(图2 (c))。相比之下,真菌从不同的来源比木乃伊显示更高的蛋白水解活性。72.2%的54真菌分离株显示蛋白水解活性[55]。

确定真菌物种和提高经济增长的因素是一个重要的一步成功的建立一个适当的和有效的策略来保护博物馆的木乃伊的集合。真菌的问题应该通过控制解决周围环境的物理条件,他们存储/显示或使用杀虫剂进行治疗。控制保护木乃伊的环境条件是最好的手段。

4所示。结论

可以得出的结论是,更高程度的污染也门古代木乃伊保存在也门的国家博物馆可能会从穷人的保存条件。也包括纤维素酶水解酶类的活性越高,PL,中外,几丁质酶,蛋白酶的分离出真菌物种代表了重大威胁会导致也门古代木乃伊的生物腐蚀。因此,建议改善国家博物馆的木乃伊的保全系统以减少污染降低到最低水平,进而将保护生物腐蚀的木乃伊。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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