用代谢研究结肠癌¹1 H核磁共振光谱

抽象

背景。大肠癌是全球癌症死亡的第三个原因。对于诊断，微创的方法，如结肠镜检查和乙状结肠镜的使用，并且无创筛查测试不是很准确。我们决定研究的潜力¹HNMR光谱学与代谢组学和化学计量学作为一个初步的无创性检查。我们得到的代谢物和结肠癌患者和法线之间的代谢途径的区别图案。方法。血清从确诊结肠癌患者和相同数量的健康对照者获得。样品用于发送¹HNMR光谱和分析进行Chenomex和MATLAB软件。代谢物使用人体代谢数据库（HDMB）和主要代谢循环使用Metaboanalyst软件鉴定识别。结果。15种代谢产物被鉴定，例如吡哆醇，乳清苷，和牛磺胆酸。涉及主要代谢循环，所述胆汁酸的生物合成，维生素B6代谢，代谢甲烷和谷胱甘肽代谢。讨论。主要检测代谢周期也早些时候在不同癌症的报道。我们的观察证实了早先的研究暗示降低血清LCA / DCA，增加维生素B6的摄入量，以帮助的重要性，预防结肠癌。这项工作可以在为使用预备步骤来看待¹HNMR分析，侵入性手术前筛查试验。

1.介绍

结直肠癌（CRC），排在第三位的癌症死亡在世界的原因。据估计，142820人被诊断为CRC和50830名男女将在2014年死于它在美国的死亡率已经下降，由于筛选和年龄调整发病率是45.0每10万[1]。死亡率在美国做出了应有的公众意识和五十岁后筛检保险支持大幅下跌。在伊朗CRC的情况下，是从6上升到7.9每10万人在2005年到38.0每10万人在2012年，是第四常见的癌症[2]。

CRC筛选是由不同的程序，如粪便隐血试验（FOBT），乙状结肠镜检查，结肠镜检查，结肠镜检查虚拟和双重对比钡剂灌肠（DCBE）进行。每个人都有自己的优点和缺点。一种数字直肠检查（DRE）期间常规身体检查由一些医生执行，并且它们可以使用该过程来检查直肠的下部[3]。

似乎非侵入性的方法不很精确，但更经济，更容易执行。有两个FOBT测试，以检测血红蛋白的粪便中存在。一个用途用于检测染料，零陵香FOBT，另粪便免疫化学测试使用特异性免疫球蛋白。每两三年执行用于上述50年个人这种方法和有效地减少CRC的15的情况下，以33％〔4]。一种数字直肠检查和对比钡灌肠也用于筛选，但不能检测关于由结肠镜检查鉴定息肉的50％[五]。乙状结肠镜检查和结肠镜检查是侵入性的，但似乎是CRC [诊断的最有效的工具6，7]。所用方法的组合取决于许多因素，如患者的病史，年龄，并在许多国家[保险8]。

在CRC的遗传变化已被广泛研究。代谢表示新组学科学这需要小分子的组织和体液中的唯一存在和浓度的优势，使一个指纹，其可以是唯一的个人中的一个。代谢组学已成为许多人的疾病，如CRC的诊断和管理中的重要作用的潜力。更多的调查是必须的小分子，如代谢产物难以定性，需要高通量技术[9]。近年来，随着新技术的出现，像质谱和¹1 H核磁共振（¹HNMR），用于分析小分子提供被执行[10]。获得用于所需的样本的光谱图案之后，化学计量学是使用类似主成分分析（PCA），部分线性平方（PLS），或PLS-DA（判别分析）[不同数学建模完成11，12]。这给了我们一个模式来区分正常和异常样本之间的代谢产物。使用由微分化学位移和人代谢物组数据库（HDMB）中得到的图案，所述代谢产物被识别。使用其它软件等Metaboanalyst和KEGG通路分析，得到所涉及的主要途径[13]。

由于大多数大肠癌筛查方法，如结肠镜检查和乙状结肠镜检查是侵入性的，我们决定采用高通量技术，找出这将正常进行区分癌症患者的代谢物模式。

2。材料和方法

2.1。样品采集

五 mL of blood was collected from people who were on a liquid diet for at least 48 hours and were referred for colonoscopy to the Gastroenterology Department at Amir Alam Hospital, Tehran. One group comprised of 33 patients diagnosed with cancer by colonoscopy and biopsy and the second group of individuals without colon cancer. Sera were separated and stored at −80°C. All groups were made to fill a consent form as per the requirements of Pasteur Institute Ethics Committee before serum collection.

2.2。样品制备¹HNMR光谱

600 μ血清L的用70 μ大号d₂O and 1 mM sodium 2-trimethylsilylpropionate (TMSP) was used as internal reference in a 5 mm NMR tube at room temperature and data acquisition was carried out.

用于NMR数据的收集，一维¹HNMR spectra were acquired on a Bruker DRX-500 NMR spectrometer operating at 500.13 MHZ and Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) 90-(t-180-tn-acqusition) (，)如前所述的脉冲序列。

使用Chenomix 6.4软件进行数据和模式识别分析。

2.3。化学计量学分析

2.3.1。主成分分析（PCA）

最初，NMR变量为均值中心;然后使用PCA检测离群值数据[11用于检测强离群值和由Q残差用于检测与95％置信水平适度离群值。

2.3.2。部分线性方（PLS）

PLS是经由原始变量的线性组合（使用多变量回归技术来提取物有监督方法X），可以预测类成员的信息（ÿ）。PLS使用OSC的应用后，ÿ矩阵，其包括0为正常，1个用于异常的所有数据集。有和没有OSC进行PLS和结果与超过95％的置信[获得12]。

盐含量过滤器被开发以消除不必要的变化从光谱数据。PLS使用OSC的应用后，ÿ矩阵，其包括0为正常，1个用于异常的所有数据集以前描述14]。矩阵X包括¹从法线和基体样品的HNMR数据ÿ来自癌症患者的样本。从OSC减去X，即占尽可能方差的因素X和正交ÿ。避免OSC处理后的过度拟合，以防止预测业绩不佳是很重要的。因此，除去OSC因子的数量的精确测定是十分重要的。除去只是其中一个因素。

2.3.3。人代谢物组数据库（HDMB）

HDMB的NMR搜索链接被用于检测某些化学位移的代谢物，其中包含有关的代谢物在信息人体中发现的[15]。

2.3.4。代谢途径分析

将其用Metaboanalyst 2.0执行用于途径分析和可视化。这些途径是通过在结肠癌患者的代谢产物的影响。

3.结果

PLS使用OSC的应用后，ÿ矩阵，其包括0为正常，1个用于异常的所有数据集。有和没有OSC和结果有超过95％的置信水平得到执行PLS。数据1和2显示结肠癌和正常组之间的完全分离的图案。数字3示出了加载其上升和下降代谢物的水平的一个指示样品的曲线图。随着数字和化学位移的帮助下，13种代谢产物被确定为表1。从上述微分的代谢产物进行检测15种代谢途径富集分析图进行后4。比例过高分析，在表所示2根据代谢产物改变的数量来检测途径的影响，并测试在Metaboanalyst软件中用户上传的化合物列表中，某一特定组化合物的表现是否碰巧超过预期。在路径分析的背景下，在特定路径中涉及的化合物被富集和比较随机击中测试。路径分析的详细结果如表所示2，而且，因为许多途径同时进行测试，统计从富集分析的值进一步调整为多次试验。

4.讨论

在这项研究中检测到一些代谢产物及其路径的这对大肠癌有重要的影响。所涉及的所有周期的，初级胆汁酸的生物合成和酮体和氰氨基酸代谢的降解是主要的那些（表2）。所有涉及到的代谢物，主要包括为胆固醇，甘氨酸，甘氨胆酸，和它们参与初级胆汁酸合成牛磺胆酸。次级胆汁酸通过酶促去缀合和通过在大肠内厌氧菌的初级胆汁酸脱羟基形成。报告显示的更高的脱氧酸在血清的存在和胆汁的患者结肠腺瘤比健康对照16]。有研究表明，这些次级胆汁酸表现出促进肿瘤的动物中的能力和它们可以触发细胞凋亡和也可以充当参与结肠细胞不同的细胞信号传导途径[调节分子17]。有趣的是，LCA（石胆酸）/ DCA（脱氧胆酸）的比例可以是区分倾向结肠癌的重要因素[18]。据报道，在高饮食中补充维生素B6的大鼠实验中，LCA/DCA的减少[19]。与结肠癌有关的第二个代谢周期是维生素B6。关于这种维生素的作用有几种理论。它上调一种保护因子，胰岛素样生长因子结合蛋白1 (IGFBP1);在HT29结肠癌细胞暴露于吡哆醛(维生素B6的一种形式)时，其mRNA上调。IGFBP1由肝脏分泌，推测对癌症和心血管疾病的发生具有保护作用[20]。ELISA表明分析表明补充维生素B6结肠HSP70，血红素加氧-1，和HSP32，其增加的细胞增殖和结肠损害的显著降低水平。热休克蛋白（HSP，分子伴侣）已被建议为与结肠癌的发生相关联21]。在小鼠接受结肠致癌物质氧化偶氮甲烷，发展结肠隐窝病灶，前体结肠癌，和细胞增殖的病变是由补充维生素B6抑制[22]。

下一个有效循环是以3-羟基丁酸为代谢物的酮体的合成和降解。有趣的是，最近的研究表明生酮饮食有助于克服各种癌症。这是因为大多数恶性细胞依赖葡萄糖作为燃料，而由于线粒体功能障碍，脂肪酸不易代谢。恶性肿瘤细胞生长体外由低血糖和低碳水化合物饮食的相似抗肿瘤性质受到负面影响在小鼠中被示出体内实验[23]。3-羟基丁酸也是一个生物标志物选自结肠的患者血清中检测到通过GC-MS [24]。

甘氨酸是一种非常重要的代谢产物，因为它需要参与氰氨基代谢，代谢硫胺，甲烷代谢，谷胱甘肽代谢接下来的四个周期。血清中甘氨酸和结肠癌之间增加协会已在许多研究[被证实25]。如通过飞行时间质谱（TOFMS）的时间在代谢组学研究中观察甘氨酸分化为结肠癌代谢物[26]。一个体外癌细胞上通过代谢物谱进行的研究表明在癌细胞增殖甘氨酸关键作用[27]。

硫胺素或维生素B1在癌细胞中有重要的作用，研究表明使用硫胺素降解酶，硫胺素酶。Liu等研究表明，在含硫胺的细胞培养基中加入硫胺酶对乳腺癌细胞的生长有明显的抑制作用[28]。还的硫胺酶聚乙二醇化的版本是能够在RS4白血病异种移植模型中延缓肿瘤生长和延长存活[29，三十]并且可以看出，增加的甘氨酸和硫胺素被链接。

在大肠内代谢甲烷细菌有报道，早在1977年该报告显示，在呼吸甲烷是排泄发生两次频繁的患者结肠癌的正常个体[31]。这表明在患者和正常人厌氧肠道菌群之间的差，并暗示结肠直肠癌可以通过厌氧细菌在大肠内通过核胆汁酸脱氢形成致癌物引起[32]。谷胱甘肽途径增加甘氨酸后看到。在原发性大肠癌组织谷胱甘肽水平比相应的正常组织显著高。报告显示，提高谷胱甘肽水平对成活率显著的负面影响在结直肠癌患者[33]。

报告显示，在结肠癌的氨基酸增加代谢和分解代谢。甘氨酸也被认为参与甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢，其增加结肠癌和是氮代谢的部分的[34]。

（R）-3-羟基丁酸是在丁代谢非常重要的。丁酸的抗肿瘤作用在使用结肠直肠癌细胞系的研究中描述，其中丁酸抑制生长和诱导分化和细胞凋亡[35]。在其他研究中丁酸能抑制肿瘤生长体内在小鼠模型[36]。但也有相互矛盾的关于丁的保护作用报告，可见结肠细胞仍增加和成长，即使有高浓度的丁酸盐在结肠[37]。

岩藻糖和甘露糖代谢是由L-岩藻糖，其是在癌症和炎症的重要的翻译后修饰的影响。色拉寺和癌症患者的总细胞蛋白显示，岩藻糖水平的提高，最近一些岩藻蛋白已经被确定为glycoproteomic分析新癌症生物标记[38]。

5。结论

运用¹HNMR分析和化学计量学，在结肠癌患者和法线的血清代谢物之间获得分化图案。使用HDMB 15种主要代谢物进行鉴定和Metaboanalyst软件检测出已被报道发挥在癌症和肿瘤进展的重要组成部分，13个代谢周期。其主要途径是胆汁酸合成和维生素B6的生物合成，和我们的研究证实了早期的发现，并提出降低血清LCA / DCA，增加维生素B6的摄入量，以帮助预防结肠癌的重要性。

利益冲突

作者宣称，他们有利益相互这项工作没有冲突。

作者的贡献

作者都在开展这个项目同样参加了会议。

承认

作者承认伊朗巴斯德研究所资助这一项目。

参考文献

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