O Serogroup-Specific Touchdown-Multiplex聚合酶链反应检测和识别霍乱弧菌O1群、O139 Non-O1 / Non-O139

文摘

一部小说,敏感locus-specific touchdown-multiplex聚合酶链反应(TMPCR),基于两级放大与多重PCR和条件着陆策略,用于探测和区分霍乱弧菌血清型。一组基于分子标记TMPCR方法生成的配置文件霍乱弧菌特殊技能(588个基点)扩增子来自经济新闻W基因编码外膜蛋白和serogroup-specific扩增子,364个基点的O139 O1和256个基点,真正的抄袭rfb脂多糖生物合成基因。TMPCR扩增效率收益平等或不平等的可检测的双螺旋DNA的乐队O1群(588和364个基点)和O139(588年和256年英国石油公司)或一个DNA片段non-O1 / non-O139(588个基点),同时提供没有假阳性的基因组DNA模板识别使用其它弧菌属和肠杆菌科。two-template组合的相互分析表明,使用霍乱弧菌O1群、O139或同样混合O1和O139 TMPCR有检出限低至100 pg的O1, O139或non-O1 / non-O139反应同样包含不平等或混合gDNAs。此外,O serogroup-specific TMPCR方法有100%赞同时血清学分型方法检查血清型霍乱弧菌参考菌株和那些从临床样本中恢复过来。使用这个TMPCR工具的潜在好处会增加血清学分型方法在流行病学监测和监控霍乱弧菌血清型,O1、O139 non-O1 / non-O139出现在临床和环境样品。

1。介绍

霍乱弧菌是水性代理造成霍乱和原地水生栖息地在沿海和河口生态系统的共生与浮游动物的生存和增殖相关(1- - - - - -5]。弧菌spp。,包括霍乱弧菌血清型(6),弧菌parahaemolyticus(7,8),通常生长在自然环境中,可以进入viable-but-nonculturable VBNC状态。产毒素的O1和O139血清型的重要作用霍乱弧菌,以及non-O1 / non-O139血清型,在几个方面研究了。例如,VBNC霍乱弧菌O1群在微观或通过动物从水生环境转换为可耕种的状态通道(9]。VBNC O139和non-O1 / non-O139还可以恢复当cocultured与几个动物细胞系(10,11]。最近,古典生物型的霍乱弧菌O1保留生存能力但失去culturability当cocultured埃尔托型的(12]。这可能表明,埃尔托型的出现霍乱弧菌O1群与位移现有的古典生物型霍乱流行的主要原因。类似于产毒素的血清型,拥有virulence-association基因(O1和O13913- - - - - -18),其他非o1非o139血清型恢复水生环境或致病性也被流行病学与临床标本和流行潜力(18- - - - - -20.]。因此,公共卫生监测和监控的霍乱病例需要系统用于全国法定传染病监测、公共卫生实验室,环境监测21- - - - - -24]。分子检测技术,如基于分子标记聚合酶链反应(PCR)方法为探索开发这些古怪霍乱弧菌微生物一直到目前为止证明有用的诊断和监测疾病暴发或流行全球调查。

在孟加拉海湾,南亚和东南亚,有人建议,这样的霍乱暴发有关的交叉污染和传播霍乱弧菌后段(s)从易感人群到水生环境可能会流行病学与卫生设施的互联差氯化水域,海鲜/食品大宗商品和海水污染,或直接接触食品操作者之间的联系或海鲜预处理工厂工人2,14- - - - - -16,21,22,24]。标准文化在常规诊断和监测方法霍乱弧菌通过公共卫生参考实验室取决于处理的样品霍乱弧菌文化是恢复。关于这一点,霍乱弧菌文化研究调查中恢复了霍乱弧菌简约或疑似患者急性或严重腹泻的凳子或直肠拭子一直通过临床实验室设置在爆发两个在过去几十年在泰国中部1994年和2010年之间。

我们建议的基因组DNA存档保留股票文化可以作为模板当检查O1, O139和non-O1 / non-O139血清型的PCR方法,因为这也可以允许一个互惠O1和O139血清型的检测临床标本与过去的爆发有关。在这项研究中,我们已经成功地开发了一种新颖的敏感,具体,半定量的touchdown-multiplex PCR (TMPCR)检测和分化霍乱弧菌O1群、O139 non-O1 / non-O139血清型。TMPCR雇佣了有用的分子标记是起源于美国的DNA位点参与新创o抗原生物合成的霍乱弧菌(25- - - - - -28)和外膜蛋白(经济新闻W)编码基因特定的霍乱弧菌(29日,30.]。为了达到研究的目的,我们分析了性能效率(特异性和灵敏度)O serogroup-specific TMPCR探测和区分O1, O139,和non-O1 / non-O139基因组,经验决定使用参考菌株霍乱弧菌和不相关的弧菌菌株。然后我们探讨其实用性在区分O血清型的霍乱弧菌股票文化原本孤立的从临床标本。此外,TMPCR进步的考验霍乱弧菌在环境样品也进行了讨论。

2。材料和方法

2.1。细菌培养和实验室分类

六十九年霍乱弧菌菌株作为目标gDNA模板包括引用和野生型菌株的O1群(包括El Tor /古典小川和El Tor /古典生物型稻叶型),O139, non-O1 / non-O139。另外31个菌株作为非特异性gDNA模板包括8弧菌spp。16革兰氏阴性细菌,和7的革兰氏阳性细菌。一批传播的霍乱弧菌一夜之间,0.5毫升MO45 O1 569 b或文化O139菌株接种成100毫升Luria-Bertani(磅)汤补充1%氯化钠(氯化钠)解决方案,然后在37°C孵化3 h和剧烈的颤抖。细胞培养的光密度0.8被用于板法和下降,随后,枚举通过平皿计数(PC)琼脂(美国密歇根州Difco Eiken,日本)。PC琼脂也补充1%氯化钠。non-O1 / non-O139菌株包括O22和O155培养。

亚文化的霍乱弧菌和其他弧菌种虫害是生长在选择性硫代硫酸盐柠檬酸胆汁盐蔗糖(tcb)琼脂(默克公司,达姆施塔特,德国),随后,他们血清生化反应特征根据其它地方描述的方法(31日,32]。短暂、生化测试包括三糖铁(TSI)运动性indole-lysine (MIL)氧化酶,尿素,先生,Voges-Proskauer(副总裁)、柠檬酸、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、乳糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、甘露醇、葡萄糖/天然气,肌醇,七叶树素,宽容和盐0%,3%,6%,8%,和10%氯化钠溶液。所有试剂都是购自Difco实验室(美国密歇根州Difco)。血清型O1、O139和non-O1 / non-O139测试凝集反应的基础上使用商用O serogroup-specific抗血清(抗血清VcO1多价SAP / O139 S &试剂实验室,曼谷,泰国)。non-O1 / non-O139特点分为两nonagglutinable(唠叨)组(根据Heiberg唠叨I和II)的反应。此外,电脑琼脂用于活细胞数和枚举所有的菌株进行这项研究。

2.2。霍乱弧菌从临床标本和血清型文化

共有148名股票的文化霍乱弧菌与108年凳子和40直肠拭子总共获得霍乱弧菌简约或疑似患者急性或严重腹泻暴发期间中央泰国在1994年和2010年之间。通过使用匿名系统,文化最初由临床实验室设置隔离进行隔离的来源和时间收集和相应的tcb股票文化准备。所有随后的亚文化和保存在半固体琼脂培养基含有1%氯化钠的微生物学,公共卫生学院,泰国Mahidol大学。血清学分型的O1、O139 non-O1 / non-O139, 148年亚文化的凝集霍乱弧菌隔离在个人盲目执行。此外,只有霍乱弧菌O1血清组的亚文化特征与由O1型多价抗血清凝集的是使用单价Ogawa或稻叶型抗血清。生物型的菌株的表型测试执行使用溶血的羊血,鸡红细胞的凝集,Voges-Proskauer,和敏感多粘菌素b。与此同时,相同的基因组dna霍乱弧菌隔离是准备根据下面描述的快速沸腾的方法或使用QIAamp DNA minikit(试剂盒、希尔登,德国)。纯化的原液gDNA提取最初量化,然后根据下面描述的方法存储。

2.3。基因组DNA提取

修改miniprep gDNA提取方法用于目标和不属预定目标的gDNAs如下。如上所述,细菌培养(1.5毫升),生长在一夜之间在37°C与剧烈的摇晃旋转在12000 rpm为1分钟。细胞颗粒悬浮在582年μL (TE缓冲(10毫米Tris-HCl, 1毫米EDTA), pH值8.0。暂停与添加15细胞溶解μL 20%十二烷基硫酸钠溶液和3μL 20毫克/毫升蛋白酶K,充分混合,然后在37°C 1 h。一个10μL 10毫克/毫升核糖核酸酶的添加,混合彻底,孵化为30分钟37°C。100年μL 5 M氯化钠(氯化钠)解决方案和80年μL 10%十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)添加了0.7 M氯化钠溶液中,充分混合,并为10分钟在65°C的环境。然后,0.4倍体积的氯仿/异戊醇(24:1)补充道,轻轻混合5分钟,在12000转离心5分钟。水相包含gDNA曾两次接受同等体积的phenol-chloroform和紧随其后的是离心。同等体积的异丙醇加入回收DNA的解决方案,彻底混合,和DNA颗粒是离心机。经过脱水的一种极端冰冷的乙醇体积的70%,进一步的离心分离,这是溶解在TE缓冲pH值7.6。

此外,使用快速沸腾的方法,一夜之间相同的文化是在12000 rpm为1分钟。细胞颗粒悬浮在500年μL (TE缓冲pH值8.0和孵化30分钟的56°C。后立即在100°C被煮10分钟,10分钟的暂停是站在冰然后离心机在12000转3分钟颗粒细胞碎片;明确gDNA上清液。最后,纯化gDNA提取以及原油提取(煮溶菌产物)定性和定量分析了分光光度计波长比260/280 nm或琼脂糖凝胶电泳。不同浓度的30到50的整除μg / mL (260/280 OD大于1.7)使用整个研究保存在−20°C到使用。

2.4。引物设计

相应的引物设置特定的霍乱弧菌血清组(表1)最初是来自目标DNA序列霍乱弧菌O1, 22 kbrfbDNA位点(25),霍乱弧菌O139, 46个kbrfbDNA位点(28]。这些rfb同源染色体的基因参与脂多糖(LPS)生物合成O1和O139抗原。的rfbV基因负责园艺学会元素有限合伙人参与生物合成设计霍乱弧菌O1-specific引物扩增子生成364个基点。的wbf天冬酰胺合成酶是指定为R基因编码霍乱弧菌O139-specific引物(256 bp扩增子)。的经济新闻W基因编码使用的外膜蛋白质霍乱弧菌种专一性或通用引物,扩增588 bp扩增子(29日,30.]。分析一致相同的DNA和蛋白质含量进行在线可用的爆炸计划(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)、BLASTN BLASTx BLASTP,序列相似性算法。多重序列比对分析了共识序列使用ClustalW计划(http://www.ebi.ac.uk/clustalW/)。这些多路合成引物的整除集100年股票的浓度μTE缓冲pH值8.0 M整个研究中使用存储在−80°C到使用。

2.5。Touchdown-Multiplex PCR扩增

最初,two-template组合的霍乱弧菌O1和O139同时locus-specific放大条件下进行测试(33,34)使用96 - MyCycler热循环(美国BIORAD)或PCR梯度热循环(ThermoHybraid Px2,阿什福德,英国),两个结合的引物浓度等因素集和经验决定在25 gDNA模板μL聚合酶链反应混合物组成的1 x PCR缓冲MgCl(氯化钾50毫米,1.5毫米₂,10毫米Tris-HCl pH值9.0),200年μ每个核苷酸(dATP, dTTP dCTP, dGTP), 1 U AmpliTaq(美国珀金埃尔默),或TaqDNA聚合酶(美国Promega)。放大条件进行predenaturation 5分钟在95°C,紧随其后的是30个周期在94°C的变性1分钟1分钟和扩展在72°C,除了引物退火温度(70→50°C)的精神性每个用于1分钟。最后在72°C扩展做了10分钟。首先,使用一个常数1的浓度μ每个引物组,反应使用混合O1 569 b和O139 MO45 gDNAs (ng)相同比率的10:10,1:1和0.1:0.1或在不平等的比率1:10到0.1:10反之亦然。第二,使用混合gDNAs (10 ng),底漆集(通用:O1-specific: O139-specific)浓度比率(μ1:1米):1、1:0.5:0.5,1.0:0.2:0.2,0.5:1.0:1.0,0.5:0.5:1.0,0.2:0.2:1.0,和0.1:0.1:1.0进行了分析。在这种情况下,放大目标位点的引物结合特异性取决于退火温度算法primer-template组合受到限制。这些算法允许热循环的发展TM-PCR协议如下所述。

最后,一个25μL优化TMPCR混合物除了相类似霍乱弧菌O1和O139 gDNA模板、10 ng和三组多路引物(0.4、0.4和1.0μ米,resp)使用。优化放大条件下进行一个周期的predenaturation 94°C 5分钟,其次是5周期连续退火温度衰减1°C从57°C到53°C在每个周期和时间增量(30秒前三周期和35秒过去两个周期)。在94°C的反应是变性1分钟,其次是在该温度下退火算法和聚合在72°C 1分钟。随后,变性的20个周期为1分钟在94°C,在52°C 40秒,退火和延伸率在72°C 1分钟了。最后一个引物延伸步骤做了10分钟的72°C。在类似的方式,净化霍乱弧菌O22或O155 gDNA O139代替。要么大肠杆菌gDNA模板-控制(数控)或nuclease-free水,而不是gDNA模板,作为内部控制(IC)被用在所有的实验。

2.6。半定量的TMPCR

相互作用的检测霍乱弧菌O1和O139旨在分析的放大效率O serogroup-specific TMPCR在小心地控制实验,利用gDNA模板比率是否不公平地一样。,可检测水平的O1 gDNA可以放大反应含有高量的其他相关O139 gDNAs,和反之亦然。

的不平等互惠的检测霍乱弧菌O1和O139(表2)做了如下。在实验中,反应包含100 ng O1 gDNA量和连续的10倍稀释O139 gDNA (100 ng 1 pg),或O1群的数量比率:O139变化从单一到10⁵倍,反之亦然。在实验B,反应包含的数量比率O1群:O139 gDNAs 100 ng 1 pg, 10 ng 10 pg, 1 ng - 100 pg或O1群的数量为10⁵——10³和10倍大于O139,反之亦然。也,100 pg O139 gDNA测试针对不同数量的O1群gDNA: 100 ng, 50 ng, 25 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg。

平等互惠的检测霍乱弧菌O1和O139(表3)做了如下。在实验C,等量的O1群:O139 gDNAs测试系列稀释10倍,100 ng 1 pg。的内部控制(实验D和E),相同数量的10倍连续稀释gDNA模板、O1和O139,。此外,纯化霍乱弧菌O22或O155 gDNA模板是用来代替O139。所有实验进行了一式三份。

2.7。16 s rDNA放大

TMPCR放大的质量控制,16 s rDNA放大担任内部控制反应进行了一式三份的反应包含目标或不属预定目标的DNA模板在整个研究。此外,特定的引物微生物DNA (16 s rDNA轨迹)包括正向引物5′cgg TGA AAT GCG标签AGA条t - 3′和反向引物5′-TTA CTA GCG ATT 20 AGT TC-3′(35]。一个25μL优化PCR混合物包含1 x PCR缓冲和200μ米每个核苷酸除了正向和反向引物,TaqDNA聚合酶,gDNA模板使用浓度为0.5μ米,0.5 U, 1μL(未稀释的模板,分别。优化放大进行predenaturing 5分钟在94°C,紧随其后的是30个周期为45秒94°C的变性,退火为45秒55°C,在72°C和扩展了45秒。最后一个扩展在72°C 5分钟。在这方面,663个基点的扩增子与预期大小从所有反应得到含有微生物gDNA模板。

2.8。PCR分析产品

五分之一的扩增子与6 x混合装载染料溶液通过1.5%到2.0%琼脂糖凝胶电泳在恒定电压1 x 10 V /厘米的此种缓冲(硼酸Tris-HCl 89毫米,89毫米,2毫米EDTA)(美国俄亥俄州Ameresco)。溴化乙锭- (EtBr)彩色DNA凝胶用于分析扩增子的大小在DNA碱基对比标准尺寸标记(500 ng每个100个基点的梯子)(美国Phamacia生物技术)。EtBr-stained DNA带的强度是可视化和拍摄下一个紫外线(UV)波长使用DNA凝胶文档(美国一起Fotodyne)。

此外,分析扩增特异性、敏感性和富达的O serogroup-specific TMPCR完成如下。在使用目标gDNAs反应,强烈EtBr-stained双乐队被检测到,平等或不平等,O1群(588个基点和364个基点)和O139(588个基点和258个基点)。强烈的乐队是non-O1检测到588个基点(唠叨I和II唠叨)。在反应中使用不属预定目标的gDNAs或nuclease-free水而不是DNA,预期扩增子的大小和非特异性DNA乐队被观察到。

3所示。结果

Primer-template特异性结合经验决定了反应的优化PCR参数分析三组多路引物的扩增效率,特别是结合霍乱弧菌gDNAs的O1、O139或O22 / O155。我们最初包含的gDNA内容优化的不同反应霍乱弧菌O1 569 b或O139 MO45独自,或者同样是复杂的。最可靠的扩增条件可重复执行的反应使用10 ng霍乱弧菌O1 MO45 / 569 b或O139反应测定,或者同样是复杂的。由此产生的算法在退火温度高于55°C可能减少放大特定的扩增子与预期大小的收益率(数据没有显示)。所有反应包含O22或O155 gDNA推定地产生了588个基点的DNA带(数据没有显示)。最佳退火温度范围从53°C到57°C。很明显,退火温度和引物PCR因素设定浓度更有可能影响扩增效率是否O1, O139或同样混合gDNAs。结果,优化复合PCR扩增依赖于退火温度55°C和引物浓度的0.4(通用),0.4 (O1-specific)和1.0 (O139-specific)μM(图1)。

我们进一步采用严格的协议开发TMPCR因为提供的多重PCR大多数反应包含的阶梯状的放大问题的背景不属预定目标的gDNAs。同样,多重PCR获得含有虚假的产品即使在一些反应霍乱弧菌O1, O139或non-O1 / non-O139 gDNAs准备通过CTAB / phenol-chloroform提取方法或快速沸腾的方法(数据未显示)。由于优化O serogroup-specific TMPCR与宽松的着陆策略,热循环条件下采用退火温度衰减的间隔57°C到53°C和时间增量减少nonlagging产品在初始几何放大周期。而16 s rDNA放大,这证明TMPCR特异性或100%给推定地包含积极放大反应霍乱弧菌但是没有其他不属预定目标的dna基因组(表4)。的21个霍乱弧菌TMPCR O1作为目标DNA测试,很明显,一直积极放大EtBr-intense双螺旋DNA乐队(588年和364年英国石油公司)中观察到的反应包含参考菌株(8)、(5)、稻叶型Eltor Eltor Ogawa(4),古典稻叶型(2),和Eltor Ogawa(2)。同样,其他16霍乱弧菌O139菌株产生的放大双螺旋DNA片段(588和256个基点),虽然唠叨我和唠叨二只给了一个588个基点的DNA带。只有代表目标和不属预定目标的gDNAs放大了O serogroup-specific TMPCR,由16 s rDNA PCR相比,放大,如图所示2。此外,没有TMPCR当使用不同的特异性和敏感性霍乱弧菌O1, O139和non-O1 / non-O139 gDNA模板是否纯化或煮。

分析放大TMPCR的敏感性,我们确定相应的放大与算法,使用混合的数量的比率霍乱弧菌gDNAs (O1: O139),包含每个gDNA模板相比,这些反应连续稀释。结果TMPCR CTAB / phenol-chloroform提取实验霍乱弧菌gDNA是否O1、O139或O22 / O155放大图所示3。至于图3(一个),TMPCR可以检测O serogroup-specific DNA片段真正来源于中O1和O139相互反应。低至1的检测极限ng的O1获得更高的存在或数量的O139 100倍大于O1群。同时,检出限低至10 ng的O139获得的更高的大于O139 O1群或10倍。图3 (b)显示,其检出限是100 pg中O1群或O139逆反应包含数量比例不均,100 pg O1和ng O139和反之亦然。再次,TMPCR可能显示检出限低至100 pg的gDNAs在反应中含有等量O1和O139的比率。注意TMPCR很清楚的检出限低至100 pg gDNA O1和O139当检查的等量比例连续稀释O1和O139模板(图3 (c))。同样,它也有相同的检测极限低至100 pg gDNA O1和O139当单独复制(数字3 (d)和3 (e))。的低至100 pg O22 O155 gDNA也发现(数据未显示)。

最后,我们测试了放大富达的O serogroup-specific TMPCR通过使用目标gDNA样品从148年的股市文化存档霍乱弧菌临床分离株。总的来说,TMPCR表现出100%血清学分型方法参考是否一致霍乱弧菌文化从凳子或直肠拭子(表5)。大便的测试给的所有108年文化积极TMPCR结果:65(60.2%)的O1血清型整合与O1 serogroup-specific TMPCR(588和364个基点),15(13.9%)的O139血清型整合与O139 serogroup-specific TMPCR(588和256个基点),和28 (25.9%)non-O1 / non-O139血清型整合与O serogroup-specific TMPCR(588个基点)。同时,所有的40从直肠拭子文化也一直积极与测试:39例(97.5%)符合O1血清型和O1 serogroup-specific TMPCR且只有一个(2.5%)符合non-O1 / non-O139血清型和特定TMPCR 588个基点。从临床孤立的只代表gDNAs存档霍乱弧菌文化在图所示4。所有样品测试通过O serogroup-specific TMPCR都与16 s rDNA PCR阳性。

此外,TMPCR当检查提供了可靠的测试结果霍乱弧菌在环境样品如水样和海鲜,而培养法/血清型(表6)。特别是当检查的霍乱弧菌在水生环境中,TMPCR提供积极的结果霍乱弧菌non-O1 / non-O139水样本,而没有文化的方法。

4所示。讨论

传统的文化技术是恢复的基础霍乱弧菌从临床样本的文化霍乱弧菌简约或cholera-like病人。然而,这种方法依赖的能力霍乱弧菌传播在体外文化和表达通常在生理条件下表型特征形态,生化反应,或血清。这种经典的微生物方法不仅是可行的微生物细胞生长到平皿计数琼脂或富集培养基营养构成整个目标微生物的增长至关重要,而且孕育文化传播条件下有利于他们的最佳生长。这样VBNC霍乱弧菌以及一些VBNC弧菌属可以存在于自然水生栖息地等,他们不但是在实验室培养的特点,因此没有使用常规微生物方法由于复苏文化的复苏从环境样品的极限。然而,霍乱弧菌一旦恢复那些隔离来源需要逻辑分析来确定他们的财产是否的表型或遗传型的。

在目前的研究中,我们提供了所有的血清型的证明霍乱弧菌参考菌株和临床分离株都一直积极与O serogroup-specific TMPCR方法,显示血清型和O serogroup-specific基因型的一致性。换句话说,TMPCR方法使用的引物组特定O1, O139, non-O1 / non-O139可以同时产生扩增子真正来自目标DNA序列只包含少量的反应的目标gDNAs但不是gDNAs无关。这暗示,TMPCR性能效率高(特异性和灵敏度)的探测和识别O1, O139和non-O1 / non-O139血清型的霍乱弧菌参考菌株和临床分离株。O serogroup-specific底漆集没有cross-hybridize对不属预定目标的DNA序列既不包含目标gDNA模板的反应中也不包含无关的反应中gDNA模板。至于直接定量测定评估工具,TMPCR的检出限低至100 pg霍乱弧菌gDNAs的O1、O139或non-O1 / non-O139。当模拟条件的混合gDNAs O1和O139进行了分析,TMPCR方法表现出高灵敏度。平等或不平等的混合使用的反应化验O1和O139 gDNAs与反应的结果可以比较好gDNAs使用单一来源。这可能表明O serogroup-specific TMPCR化验检查时可以增加血清学分型的效率方法的定性和定量分析血清型霍乱弧菌文化从任何隔离来源是否临床环境中恢复过来。培养法相比,只有TMPCR给当目标DNA阳性结果霍乱弧菌non-O1 / non-O139可以检测到在一个水样本在这个研究。也就是说,TMPCR可以提供证明霍乱弧菌non-O1 / non-O139出现在水样VBNC状态。这个有前途的技术可以作为类似于分子markers-based PCR方法允许的探测和识别霍乱弧菌O1, O139和non-O1 / non-O139隔离从临床病人或水生环境13- - - - - -24]。

此外,TMPCR需要gDNA准备的过程,目标基因扩增,postanalysis PCR产品。然而,与血清学分型的方法相比,该技术变得更容易的过程和所需的时间运行大量的采样霍乱弧菌文化。类似于其他着陆或多重PCR方法为探索开发多种微生物(33,36,37)的性能效率TMPCR本研究测试是通过一个两级放大将多重PCR条件着陆策略,哪些是适合同时放大目标DNA序列的高保真度和可行的。这个改进的多重PCR包含同步PCR和特定PCR和放大的任何一个或两个步骤着陆策略,执行宽松的着陆策略应用温度低于优化退火温度,和严格的着陆策略应用温度高于优化退火温度。TMPCR方法来规避问题的多重PCR检测已成功用于同步放大目标DNA序列最初来源于O1, O139和non-O1 / non-O139血清型与相应降落PCR参数。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突的出版。

确认

作者感谢热带医学学院,Mahidol大学和军队医学科学研究所,曼谷,泰国,提供O1 MO45 569 b和O139菌株。野生菌株的O1群(包括El Tor /古典小川和El Tor /古典生物型稻叶型)和O139被Bamrasnaradura传染病医院,请提供Nonthaburi。non-O1来自公共卫生学院Mahidol大学。其他参考菌株O22和O155 Toshio岛田教授提供的请国家传染病研究所的东京,日本。

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