绿茶潜在的改善双酚A诱导的氧化应激：一个体外和在网上研究

摘要

本研究试图阐明双酚A对红细胞的氧化应激及其绿茶提取物的改善作用。为此，从健康成人采集静脉血EDTA小瓶，用于制备红细胞悬液。用不同浓度的双酚a /处理红细胞悬浮液在溶血剂量依赖性增加发生。类似地，当红细胞悬浮液用任一不同浓度的处理(0.05-0.25毫米)和双酚a(50毫米μg / mL)or 0.05 mM连同不同浓度的BPA的（50-250 μg/mL)，剂量依赖显著增加溶血发生。双酚a和被发现是添加剂。为了证实这一点，我们利用分子对接工具检测了双酚A与红细胞蛋白(血红蛋白、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)的结合能力，发现双酚A与蛋白之间存在各种氢键。目前的数据清楚地表明，双酚a以类似的方式引起氧化应激。同时加入不同浓度(10-50)μ以g/mL的绿茶提取物制备含高剂量双酚A(250)的反应混合物μg/mL)对双酚a诱导的溶血产生浓度依赖性改善。效果是显著的()。结论：BPA诱导的氧化应激可以通过绿茶提取物可以减轻显著。

1.介绍

双酚A（BPA 2,2-双（4-羟基苯基）丙烷），一异雌激素，是聚碳酸酯塑料的重要单体和环氧树脂和聚苯乙烯树脂的组成[1]。广泛应用于金属罐、水管等管路。2、奶瓶、饮水杯[3.]、牙科密封剂[4,5，以及许多其他家用电器。研究表明，由于聚合物的不完全聚合和降解，双酚A可从食品和饮料容器中浸出[6]，以及从在正常使用条件下牙科密封剂和复合材料。双酚A已经发现不仅环境样品，包括空气，水，污水污泥，土壤和尘埃[在7- - - - - -9]，而且在人体体液，例如血浆，脐带血，胎盘组织，羊水，卵泡液和乳汁的标本。由于广泛使用，建设毒理学数据库，有需要时进行调查双酚A引起的毒性的机制。

研究显示，双酚A对大脑、生殖系统和肝脏有不良影响[10,11]。马瑟和(12]已经报道了BPA导致活性氧物质的在促氧化剂和睾丸的抗氧化状态的不平衡和增加的量。一项研究维尔马和Sangai [开展13]表明，与双酚A处理引起的细胞毒性在人红细胞这可能是由于氧化应激。但是，没有研究已经指出的双酚A诱导氧化损伤的确切机制。

我们提出双酚A引起羟基自由基的产生，引起脂质过氧化。由于存在高浓度的多不饱和脂肪酸和氧化还原活性血红蛋白分子相关的氧运输，红细胞被用作研究生物膜氧化损伤的细胞模型，氧化还原活性血红蛋白分子是活性氧形成的有力促进剂[14]。伴随于此，H₂O₂，产生在通过充分研究的途径中的膜有害的氧化变化的红细胞的一个有效的内源性氧化剂，被选为标准化合物进行调查双酚A活性的/比较机制。

从植物中提取的草药正越来越多地用于治疗各种临床疾病。天然抗氧化剂对药物引起的毒性的保护作用越来越受到关注，特别是在涉及自由基生成的情况下[15]。相对较低剂量的绿茶显示出较强的自由基清除活性在体外(16]。由于绿茶中含有许多生物活性成分，特别是儿茶素具有清除人体各种系统产生的活性氧的内在特性，因此绿茶对人体健康具有许多有益的特性。17]。众所周知，绿茶提取物具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗病毒[18,抗癌19),抗菌20,抗真菌21]，和神经保护作用[22]。

在目前的研究中，我们通过实验和对接阐明双酚A诱导氧化应激类似于H₂O₂和绿茶改善变化的双酚A的双酚A.虚拟筛选引起经分子对接研究，有针对性的对血红蛋白，过氧化氢酶，谷胱甘肽红细胞过氧化物酶和对接构象的结合效率进行评价。外源性物质 - 蛋白质相互作用研究在获得中毒性的机制更好地了解意义。因此，分子对接预测是用来发现双酚A可能相互作用位置与血红蛋白，过氧化氢酶，和红细胞的谷胱甘肽过氧化物酶。

2.材料和方法

2.1。提取制备

绿茶提取物是按照Bhargava和Singh [23]。简单地说，将5克绿茶粉(印度大吉岭绿茶布鲁克林公司)与100毫升50%的乙醇在水中混合12小时，每2小时间断摇动一次。混合物用Whatman number 42滤纸过滤。混合滤液在50℃以下蒸发浓缩，得到残渣，并在冷藏条件下保存。使用前用生理盐水重悬残留物。

2.2。实验样品

志愿者（健康成人营养良好的23-25岁的人）被招募参加古吉拉特大学，艾哈迈达巴德的动物系的伦理委员会的批准后研究。The venous whole blood samples were collected in syringes containing EDTA and centrifuged at 1,000 ×g for 10 min at 4°C to remove plasma and buffy coat. The RBCs were washed twice with cold saline (0.9% NaCl). The pellets were diluted with normal saline to obtain cell density of 2 × 10⁴加拿大皇家银行/毫升(24]。

2.3。体外红细胞的孵化与BPA，H₂O₂和绿茶提取物

双酚a (Hi-media Laboratories Pvt. Ltd.，孟买，印度)和H₂O₂(Merck Specialties Pvt. Ltd.，孟买，印度)通过孵育2 mL红细胞悬液与(i)不同浓度的双酚a (0-250)μg/mL)和(ii)不同浓度的H₂O₂(0 - 0.25毫米)。进一步研究BPA和H之间的相互作用₂O₂， 2 mL红细胞悬液与()50孵育μg/mL的双酚a与不同浓度的H₂O₂(0–0.25 mM) and (iv) 0.05 mM of H₂O₂以及不同浓度的双酚a (0-250μg / mL)。为研究绿茶提取物对双酚a的改善作用，取2 mL红细胞悬液与不同浓度的绿茶提取物孵育(0-50)μg/mL)和250μg/mL浓度的BPA。

Total volume of each reaction mixture was made up to 4 mL with additional saline. All reaction mixtures were incubated at 37°C for 4 h with intermittent shaking.

2.4。测量溶血

悬浮液1000×g离心10 min。在540 nm处用分光光度法读出上清液的色密度。溶血百分比计算公式如下: 为获得100%溶血，取2 mL红细胞悬液与2 mL蒸馏水孵育。

2.5。统计分析

每个实验重复十次。结果表示为平均值±SEM。（ANOVA），随后进行Tukey事后检验使用单向方差分析对数据进行统计学分析。显着性水平与接受。测量相关系数来估计两个变量之间的线性关联的强度。

2.6。蛋白质目标结构和配体的制备

血红蛋白(PDB id-2HHB)、过氧化氢酶(PDB id-1QQW)、谷胱胺肽过氧化物酶(PDB id-2f8A)的x射线晶体结构从蛋白数据库(PDB ID-2YK0)中检索[25]。数据经历使用GROMOS96效用（无反应场）在瑞士PDB观测器4.0.1实现能量最小化。(26]。

双酚A的配体结构(2D结构)以结构数据格式(SDF)从NCBI PubChem检索[27]并且使用ChemSketch的v的衍生3D结构。1028]。利用HyperChem中实现的分子力学几何优化模块将双酚A的结构能量最小化[29]。AMBER力场的介电常数与距离有关，静电和范德华力的标度因子设为0.5，键合类型没有任何切断，其长度被选择来确定全局最小能量构象。随后，所有的结构被最小化并导出到硬盘中。

2.7。活性位点预测

这种预测没有为蛋白质结构进行共结晶与配体作为配体结合位点被牵连作为活性位点与配体的数据集对接。未结合的配体结构进行了计算分析使用Q-SiteFinder [活性位点三十]。它通过面包车的计算检测该蛋白质表面上的口袋DER使用甲基探针和探针具有有利的相互作用能量范德华相互作用能成簇和排名。

2.8。虚拟筛选

利用Planaria Software LLC公司的ArgusLab 4.0.1，将待研究的双酚A实际筛选(docked)到靶蛋白血红蛋白(PDB id-2HHB)、过氧化氢酶(PDB id-1QQW)和谷胱磷脂过氧化物酶(PDB id-2f8A)的结合位点[31]。为了能够快速取样，结合位点被构建，其中包含与共结晶配体中任何原子在3.5 A内至少有一个原子的所有残基。结合位点的构建应用于共结晶配体的蛋白结构。对于利用Q-SiteFinder预测活性位点的未结合配体蛋白，我们采用了另一种方法。使用Q-SiteFinder中实现的Jmol Java插件对每个蛋白靶标进行计算分析，嵌入在预测空腔体积中的氨基酸被用作活性位点残基。

这两种方法通常能很好地表达蛋白靶标结合袋中的重要残基。生成大小为X = 22×Y = 15×Z = 16、原子尺度为0.40 A的网格框，选择得分为得分函数的高精度ArgusDock引擎。网格生成后，配体与蛋白柔性对接，生成1000个位姿，其中10个最佳低能位姿聚在第1位进行检测。ArgusDock引擎利用配体扭性作为层次树，其中根节点(一组没有可旋转键的键合原子)被放置在由活性位点残留物组成的网格中的搜索点中。一组不同的和有利的转换被产生，并且通过近似的穷尽搜索在扭转搜索中存活下来的姿态被保留并最终聚集。

3.结果

3.1。对红细胞

当红细胞悬浮液用生理盐水孵育，环境上清澄清具有完整的红细胞在管的底部沉淀。几乎在该混合物中没有观察到溶血。

加入不同浓度的H₂O₂(0.05-0.25毫米)对红细胞悬浮造成的严重影响()溶血增加(图1)。加入0.25 mM H可获得最大溶血率(77.88%)₂O₂(表1)。结果表明，H₂O₂以浓度依赖性方式诱导溶血()。

添加不同浓度(50-250)μg/mL)的双酚A对红细胞悬浮液造成显著()溶血增加(图2)。随着双酚A浓度的增加，沉淀在管底的完整红细胞数量急剧减少，导致上清呈红色。添加250时可达到最大溶血率(98.75%)μ双酚A的克/毫升（表2)。结果表明双酚A诱导的溶血呈剂量依赖性()。

在另一组实验中，我们研究了H的协处理效应₂O₂双酚A对溶血有作用。红细胞悬浮液用不同浓度H孵育₂O₂(0.05-0.2毫米)和50毫米μg/mL的双酚A，会造成显著()溶血增加(图1)。表格3.showed that when erythrocytes were treated with 0.05, 0.10, and 0.15 mM/mL of H₂O₂，分别为3.36%、9.33%、32.85%，分别为12.93%、25.18%、44.82%μBPA的克/毫升，分别。效果也剂量依赖性（)。

同样，红细胞悬浮液用0.05 mM H处理₂O₂连同不同浓度（50-250 μ双酚A的克/毫升），就引起显著（)溶血增加(图2)。表格4表明，当红细胞用50，100和150处理过的 μ双酚A的溶血率分别为6.71%、15.60%和23.59%，添加H后溶血率分别为12.93%、26.37%和39.37%₂O₂分别为(0.05毫米)。效果是剂量依赖性的()。表3.和4表明，溶血的这种加速可能是由于这两种化合物的加性效应。

仅在红细胞悬浮液中加入绿茶提取物可导致溶血(1.67%)，几乎等同于用生理盐水处理的对照组。红细胞与不同浓度的绿茶提取物孵育(10-50)μg/mL)和250μg/mL的双酚A，会造成显著()和溶血浓度依赖性降低()(图3.)。这种保护作用在50岁时最高μg/mL浓度的绿茶提取物。

3.2。计算对接和建模研究

我们实施了一个基于结构的计算方法来研究双酚a对血红蛋白、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的潜在相互作用模式。使用ArgusLab软件对蛋白靶标进行虚拟筛选，并分析每个对接构象的结合能值。为准确识别血红蛋白、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的结合位点，以双酚A的结合模式进行分子对接模拟。将双酚A对接到血红蛋白(PDB id-2HHB)、过氧化氢酶(PDB id-1QQW)和谷胱甘肽过氧化物酶(PDB id-2f8A)的x射线晶体结构中。

结果表明，双酚A与血红蛋白空腔的结合亲和力较高，能量值(−79.5491 kcal/mol)高于过氧化氢酶(−36.9179 kcal/mol)和谷胱甘肽过氧化物酶(−71.8106 kcal/mol)(表)5)。考虑了与氨基酸侧链和氨基氮形成有利氢键的低能构象。对接刺激揭示了酶腔内最有可能的结合位点。表格5与血红蛋白结合位点相互作用的氨基酸残基分别为Lys 99、Thr 137、Ser 133和Asp126 (h -键和空间相互作用图)4），过氧化氢酶的结合位点是赖氨酸237，酪氨酸215，精氨酸203，苯丙氨酸198，丝氨酸201，和Phe 446（H-键和硬脂酸相互作用-图5）和谷胱甘肽过氧化物酶是精氨酸20，苯丙氨酸110，谷氨酸111，他的121，和Glu 114（H-键和硬脂酸相互作用-图的结合位点6)。这个结合位点的主要驱动力是氢键。

4.讨论

本研究的结果显示的即H处理₂O₂对红细胞悬浮液造成的溶血增加呈剂量依赖性。阿斯兰等[32]也报道增加了与H处理红细胞悬浮液的渗透脆性₂O₂。交互H₂O₂与铁的血红素导致产生更强的羟基自由基[33,34，通过攻击膜上的多不饱和脂肪酸，导致脂质过氧化增加。这是H的作用机理₂O₂造成氧化应激。

亲脂性[35，双酚a可以稳定在细胞的疏水性质膜中，并可能启动过氧化物的形成。它可能穿过脂质膜与血红蛋白中的铁结合，导致血红蛋白亚基解离和铁的释放，而铁本身起到促氧化剂的作用，并产生大量的羟基自由基。产生的羟基自由基可能会干扰脂质膜，引发脂质过氧化，使细胞的渗透更加脆弱，最终导致溶血。

早前已有研究表明，双酚A可诱导大鼠不同组织的氧化应激[36,37]并诱导细胞凋亡在肝细胞中[38]。Moon等人[39提示双酚A可通过增加肝脏氧化应激引起肝脏损伤和线粒体功能障碍。Sajiki [40证实双酚A与红血球铁血红素和Obata和Kubota结合[41研究表明，双酚A增加了大鼠纹状体中羟基自由基的形成在活的有机体内microdialysis。另一项由Verma和Sangai完成的研究[13研究发现，双酚A处理的肝脏和肾脏匀浆中脂质过氧化显著升高，且浓度依赖在体外实验，支持我们的研究。

该组合的研究（BPA和H₂O₂、表3.和4)已经加速溶血，这可能是由于两种化合物的添加作用。上述假设被清楚地证明为双酚A和H引起的溶血₂O₂高度相关(数字7和8)。

如图所示3.，绿茶提取物显著（)降低双酚a引起的溶血。Verma和Sangai的另一项研究[13的研究报告，有改善作用的红茶提取物(0-200μg/mL)对双酚a诱导的细胞毒性。最大延迟溶血被观察到200μ红茶提取物为g/mL，为50μg/mL浓度的绿茶提取物。这清楚地表明绿茶提取物比红茶提取物的效力更强。绿茶中的多酚显示出比维生素C强20倍的抗氧化活性。42]。一些研究[43- - - - - -45已经报道了环境污染对红细胞的细胞毒性作用以及天然抗氧化剂对它们的改善作用。

绿茶提取物中含有儿茶素，以其抗氧化、稳定红细胞细胞膜、降低溶血而闻名[46]。儿茶素类也可以螯合金属离子，如铁（III），以形成无活性复合物，并防止可能损坏自由基的产生[46,47]。绿茶提取物被认为是活性氧的有效清除剂，如超氧化物、过氧化氢、羟基自由基和各种化学物质产生的一氧化氮[48]。在最近的研究中，补充绿茶提取物的减弱大鼠环孢素A诱导的氧化应激[49]。Ostrowska等[50研究发现，绿茶可以保护肝脏和脑细胞免受乙醇中毒引起的氧化应激。

Mathur等人[51]解释说，双酚A引起枯竭的抗氧化防御系统和诱导氧化应激。另一项研究由哈桑等人完成的。(52报道双酚A通过氧化应激诱导肝毒性，最终降低抗氧化酶。过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶是重要的抗氧化防御系统的酶，保护组织免受活性氧诱导的氧化应激。这两种酶都能催化H的水解₂O₂分解成水和氧分子，防止组织损伤。

我们提出双酚A通过增加羟基自由基的形成而增加溶血，而羟基自由基可能直接或间接(通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶)诱导脂质过氧化。为了证实这一假设，我们进行了双酚A与血红蛋白、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的分子对接。分子对接方法通常使用基于能量的评分函数来识别与结合目标在能量上最有利的配体构象。蛋白质-配体相互作用的结合能对于描述配体与目标大分子的结合是非常重要的。一般的假设是，与较高的能量值相比，较低的能量值代表更好的蛋白质配体结合。基于与受体的结合亲和性(对接能量(kcal/mol))，评估了双酚A与蛋白(血红蛋白(PDB id-2HHB)、过氧化氢酶(PDB id-1QQW)和谷胱甘肽过氧化物酶(PDB id-2f8A)能量对接模拟最低的配体结合模式(图)4,5,6)。基于这一结果，我们得出双酚A与血红蛋白的结合亲和力(−79.5491 kcal/mol)高于过氧化氢酶(−36.9179 kcal/mol)和谷胱甘肽过氧化物酶(−71.8106 kcal/mol)。对接结果显示，在双酚a与血红蛋白、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的结合中，不存在范德华、疏水或静电相互作用，只有氢键起主要作用。我们试图通过比过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶更有效地与血红素结合来确定和探索双酚A的作用机制，生成H等羟基自由基₂O₂，并诱发脂质过氧化。

总之，我们报告了双酚A通过产生羟基自由基对人红细胞的细胞毒性，其方式与过氧化氢相同。绿茶提取物对双酚a诱导的细胞毒性有有益的作用，因为它们强大的抗氧化特性和降低氧化应激的能力。

利益冲突

作者声明，他们在本论文的发表上没有任何利益冲突。

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