含牛奶提取抗菌肽为磷脂单层膜的渗透模型生物膜

文摘

三个抗菌肽来源于牛牛奶蛋白检测对渗透形成不溶性层,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)或1,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phospho -rac——(1-glycerol)钠盐(DPPG)。对表面压力的影响()和电动表面电位()测量,Wilhelmy板和铂振动板。静止的扩散条件下渗透率的测量进行的压缩和单层膜。这两种类型的测量显示大大peptide-lipid交互的不同影响。静止的渗透的结果表明,肽与DPPC单层薄弱,排斥,和非特异性和DPPG单层的互动很重要,有吸引力,和具体。这些结果符合事实,抗菌肽破坏细菌细胞膜(负面),而没有显著影响宿主细胞膜(中性)。没有发现这种歧视的压缩等温线。后者表明挤压的渗透在压缩不允许建立单层渗透平衡,所以单层依然过饱和与渗透,显示了under-equilibrium取向在整个压缩范围内,实际上。

1。介绍

1.1。抗菌肽的结构及其致病性细胞膜行动

抗菌肽(安培),命名也是抗生素或宿主防御肽(黄芪丹参滴丸),是进化保存组件的各种生物的先天免疫反应,如两栖动物、无脊椎动物、植物和哺乳动物(1]。迄今为止,ca。2000个不同的安培已确定或预测2,3]。许多安培具有广泛的抗菌活性对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌、寄生虫、包膜病毒和癌细胞(4- - - - - -7]。与传统抗生素相比,似乎安培bacteriocidal(细菌杀手)而不是抑菌(细菌生长抑制剂)。他们可以在几分钟内摧毁细菌速度是快于细菌生长速率(8]。因此,安培是公认的有力来源药物治疗的耐多药微生物(1- - - - - -21]。到目前为止,有几个安培在临床试验1,5,22]。安培的兴趣不断增加在过去的十年里,导致大量的出版物在结构、生物活性和机制的作用特别的安培微生物细胞膜或模型。综述了这些调查的文章(2,4- - - - - -21]。

安培显示出非凡的结构性初级和二级结构的多样性,而后者往往是不同的解决方案和油脂的环境中20.,22,23]。安培是介于10到40 (3,8的氨基酸残基(尽管有更短或更大肽分为安培)。大部分的安培分享两个常见的基本特性是阳离子和amphiphatic [2,11- - - - - -13]。阳离子电荷是由积极的氨基酸(精氨酸、赖氨酸、还有酸性environment-histidine)从2到9 /肽分子2,3]。安培的关键属性的结构是一个大比例的疏水性氨基酸残基(≥30%2])在离散空间组织部门的分子,使其amphiphatic。安培的关键属性是有选择性的毒性微生物或肿瘤细胞膜与本地(主机)细胞没有明显的毒性。选择性是由不同的外层膜的微生物(负)和哺乳动物/植物(中性)细胞膜1,5,6,8,11]。疏水性的增加AMP强烈与损失的选择性(11]。

没有行动的共同分子机制AMPs-it取决于肽的性质,细胞膜脂质成分和肽/脂质比(1,2,8,11]。机制包括几个阶段,还没有完全理解,尽管广泛的研究。必要的一步是肽与膜脂质导致远程缺陷。不同的分子机制假设(如barrel-stave或环形/虫洞孔隙的形成,总通道形成或surfactant-like相互作用[1,2,8,11- - - - - -14,16,19)假设聚合/寡聚化AMP在细胞质膜是必要的步骤导致膜溶解。

1.2。含牛奶提取安培

抗菌性能的牛奶已经知道了很长一段时间。牛牛奶蛋白生物活性肽的天然宿主胃肠道消化过程中释放的牛奶或其发酵产品。到目前为止,一些肽释放牛奶蛋白被认为是有一个广泛的抗菌活动(24- - - - - -35]。这些安培是作为哺乳动物细胞无毒;因此,他们被认为是有效的药物,食物biopreservatives,和/或补充在功能食品35]。牛奶安培的兴趣不断增长。那些来自主要的牛奶蛋白(——酪蛋白α乳白蛋白,β乳球蛋白)最近了35]。最经常调查含牛奶提取AMP是迄今为止牛某(LfcinB),最初来源于乳铁蛋白(小牛奶蛋白)25个胺基酸肽(36- - - - - -39]。LfcinB显示了一个非常广泛的生物活性,包括抗菌、抗真菌、抗寄生虫,anticancerous [39]。那么在其他含牛奶提取安培。其中一个最有希望的是lactophoricin-I哪个结构(中小学)是完全不同的从某B (LfcinB)。Lactophoricin-I宣布作为第一个AMP源自lactophorin [32)——小牛奶蛋白。虽然有几个lactophoricin-I报告,描述其生产(32,33,40)、结构(32- - - - - -34,40,41),和生物膜相互作用模型,(如支持脂质影响(33和胶束41),以及抗菌活动在体外(32,41]),进一步调查这个肽和其他含牛奶提取安培需要认识到他们的潜在的应用。

1.3。AMP与磷脂膜的相互作用的研究

磷脂单层蔓延在空气/溶液界面视为halfmembrane和推荐最简单的细胞膜模型(42- - - - - -45]。侧压力()提出了生物膜的范围进行30到35 mN / m (46,47),尽管如此,由于不同的各种生物膜的脂质成分,他们的压力可能落在较低的范围内,mN / m。人们认为生物膜对应的混合液体的密度范围扩大(LE)和液体浓缩(LC)磷脂阶段或LC阶段。

生物膜的单层模型可以克服一些严重限制由更高级的模型(44),如磷脂单膜囊泡(SUV或LUV)创建表面曲率理论问题,或者支持磷脂结构的强烈影响的影响,支持。单层模型方便调查首次peptide-lipid交互涉及肽脂头组织的协会是紧随其后的是部分嵌入在疏水区域;这些阶段发现足够的抗菌作用的众多安培。

有许多论文AMP与磷脂单层膜的动力学研究在静止的扩散条件下获得所谓的渗透型材表面的压力,与(48- - - - - -53]。增加表面的压力,在渗透过程是由于压缩的脂质成分由于亲水脂分子的插入46]。渗透的概要文件,与,发现众多安培线性(48- - - - - -51),同样这些测量插入生物活性肽和蛋白质的47,54,55]。线性的与概要文件是由于表面压力的线性增加的摩尔分数插入amphiphile-the依赖是有效的只有低两亲物浓度(46]。另一方面,也是非线性的与资料已经报道了一些安培52,53)或生物活性肽(47,56- - - - - -58]。资料的解释是复杂的表面压力可能改变肽插入的程度(46)或2 d相组成的单层47]。调查在静止的渗透安培通常结合压缩等温线的纯肽和peptide-lipid混合层(59,60]。

在目前的工作,三牛含牛奶提取抗菌肽称为E-5-K L-16-Y,和N-23-T(符号的名称形成的第一个和最后一个胺基酸残留及其数量)对渗透测试与1不溶性层形成,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)或1,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phospho -rac——(1-glycerol)钠盐(DPPG)。两个类型层的证据确凿的属性(DPPC [61年- - - - - -64年],DPPG [62年,65年- - - - - -71年)为我们服务作为哺乳动物的粗糙模型(中性)和细菌(负面)细胞膜,分别。调查的最有前途的肽N-23-T,最近叫lactophoricin-I [32,40,41]。它显示了一个amphiphatic结构(40,41)和一系列的抗菌活动(32]。另外两个牛奶安培选择对他们不同的电荷比N-23-T (cf。表1)。

这个调查的主要目的是描述分子相互作用的表面压力,,电动表面潜力,。的测量提供直接的信息,自由能之间的相互作用的脂质单层和渗透。表面电位测量,很少使用,到目前为止,在调查安培的渗透脂质层(72年- - - - - -74年),供应信息下令单层的状态。的影响和在多肽的渗透检查固定扩散条件下的关系:的初始密度磷脂单层以平衡表面压力,,类型的磷脂(DPPC或DPPG)肽的浓度。的和影响渗透的协会与电影相互交互和无序化的角度讨论单层。对胶片密度依赖的渗透影响讨论的适应能力的渗透amphiphatic磷脂单层结构密度。lactophoricin-I,压缩等温线(- - - - - -和- - - - - -)子阶段包含该肽进行了讨论。调查的重点是验证是否和影响脂质单层的测量在压缩子阶段包含渗透不同于那些在静止的扩散条件下获得的。

2。材料和方法

2.1。材料

1,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC≥99%)和1,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phospho -rac——(1-glycerol)钠盐(DPPG 99%)来自σ。缩氨酸最初隔绝牛牛奶蛋白质的序列:5残留肽α乳白蛋白被任命为E-5-K 16残留肽αs2酪蛋白被任命为L-16-Y, 23日残留肽从组件3眎胨(很少)被任命为N-23-T或lactophoricin-I [32(后者是在文学或者表示LPcin-I [40,41])。更多的信息在这些缩氨酸的合成和纯化(32,33,75年),在结构和抗菌活动在体外在[26,31日- - - - - -34]。可用的数据在肽的理化性质在表组成1。净电荷预测使用“肽属性计算器”软件的CS生物公司E-5-K pH值范围为5.5 8是0,因为L-16-Y + 4的pH值范围4 - 8人,和N-23-T的pH值范围7 - 8 + 2.1,而使用pH值下5.6采用+ 3的值。

使用Milli-Q水的电导率(接触有限公司₂0.8)μ表面张力的S /厘米,72.8 mN m⁻¹。磷脂股票的解决方案准备用分光年级氯仿(奥尔德里奇,A.C.S.)。

2.2。在静止的扩散条件下渗透率测量

这些测量内径的培养皿中进行2r= 9.5厘米。由于肽中可用少量,子阶段成交量减少到20毫升。测量过程如下。磷脂单层蔓延在空气/水界面从ca。1毫克/毫升DPPC或DPPG CCl在10%乙醇溶液₄(使用汉密尔顿注射器)达到所需的表面压力,,建立了ca。10分钟后。平衡的电影。接下来,缩氨酸水溶液(100 - 1000年μL)注入下磷脂单层调整肽所需的浓度范围的5×10⁻⁷1×10⁻⁵摩尔dm⁻³。这些实验的关键的一步是平均肽浓度只是其注射后,进行保护的方式对抗磷脂膜的扰动。这是实现通过一个玻璃搅拌器(安装在底部的细胞),提出了旋转注射后在ca。5 s。接下来,渗透过程是研究通过测量表面压力的时间演化,- - - - - -,和电动表面潜力,- - - - - -,在60分钟。

表面压力()和电动表面电位()测量进行使用KSV 5000朗缪尔平衡和KSV 1000社民党表面电位计(赫尔辛基KSV有限公司)。表面压力()测定铂Wilhelmy板(周长3.94厘米)和电表面潜力()与镀金振动板(VP)——穿孔。的对电极测量是一个银、氯化银半电池(Ag) AgCl / 3 M氯化钾)辐射计制造的公司。测量传感器和细胞被放置在一个树脂玻璃箱恒温器在20°C。

2.3。压缩等温线,- - - - - -和- - - - - -

聚四氟乙烯槽(15厘米×58厘米×1厘米)和两个亲水缩醛树脂障碍(对称压缩)是用于压缩等温实验。系统配备一个电平衡和铂Wilhelmy板(周长3.94厘米)的表面压力传感器。表面电位测量使用KSV点1镀金振动板。的反电极由制造商measurement-supplied不锈钢做的。设备被关闭在一个树脂玻璃框自动调温器在20°C。所有溶剂用于清洗槽和障碍均为分析纯。校准解决方案DPPC和DPPG毫升氯仿(浓度约为0.5毫克⁻¹)被用于传播(微量调节注射器的汉密尔顿有限公司美国)脂质层肽的子阶段的解决方案。的平衡时间20分钟后,电影的速度压缩2.5毫米分钟⁻¹障碍⁻¹由两个对称的运动障碍。PC电脑和KSV软件被用来控制实验。每个压缩等温线进行至少三次。标准误差在±0.5²随着分子区域,意味着±0.2 mN m⁻¹表面压力和±5 mV与表面电位测量。

3所示。结果与讨论

3.1。表面活性含牛奶提取肽的空气/水界面

活性肽的空气/水界面研究了注入一个数量的原肽的解决方案搅拌后水样达到所需的浓度。发现的唯一一个肽,lactophoricin-I (N-23-T),显著增加的表面压力空气/溶液界面;也就是说,1×10的解决方案⁻⁶5×10⁻⁶和1×10⁻⁵摩尔N-23-T dm⁻³显示平衡表面压力的12.2,16.7,和19.5 mN m⁻¹分别和大约90%的价值观是建立在肽注射后30分钟。Lactophoricin-I也产生高电表面势的变化,在400年和1100年之间增加mV,根据浓度。相比之下,L-16-Y和E-5-K肽没有显示表面活性在空气/溶液界面(例如,在−2.5,+ 0.5 mN米之间⁻¹和在100 - 600 mV测量浓度的1×10的范围⁻⁶1×10⁻⁵摩尔dm⁻³)。值得注意的,表面的潜力近中性肽E-5-K开始稍微负值的200−−50 mV(取决于浓度),增加了ca。300 mV在60分钟。N-23-T表面活性的空气/溶液界面(与L-16-Y和E-5-K)应该归因于相对最大数量的疏水残基的肽链,特别是关于他们在外的分子(cf。表范围1)。

3.2。压缩等温线DPPC和单层DPPG Lactophoricin包含子阶段

表面压力和区域(- - - - - -)和电动表面电位与区域(- - - - - -DPPC)等温线注册在压缩和DPPG单层膜纯水和包含1×10的子阶段⁻⁶摩尔dm⁻³lactophoricin-I数据所示1(一)和1 (b)。

数据可能会注意到1(一)和1 (b)巨大的扩张效应所lactophoricin-I DPPC和DPPG单层膜。区域/磷脂分子的比例增加,,肽插入呈现在图2的函数。这些与依赖关系进行评估的等温线注册肽含有子阶段和纯水通过比较在相同的领域值。注意,扩张lactophoricin-I施加于DPPG单层(ca。800%)的两倍大于DPPC,表明静电相互作用的带正电的肽与带负电荷的phosphoglycerol团体阻力更多肽单层相比中性DPPC。另一方面,一个伟大的扩张DPPC单分子层的肽(ca。400%)表明竞争吸附在空气/水界面(cf N-23-T。部分3.1)。吸附肽,由于其显著的指控,可能形成高度分散(表2 d域1)。把上面的,mN米⁻¹对应于最大范围扩大效应归因于共存的2 d肽与2 d磷脂域域,信用证。后者可能会在一定程度上扰乱peptide-lipid交互,特别是DPPG单层的,同时,形成混合lipid-peptide 2 d阶段不能排除。在较高的范围内,mN米⁻¹,扩大效果急剧下降到接近于零,表明肽领域的崩溃的范围内。值得注意的,等温线得到我们DPPC -和DPPG-lactophoricin-I系统显示一个伟大的类比了内维尔和同事(76年,77年抗菌肽肽的渗透,LL37 DPPC和DPPG单层膜。有趣的是,等压插入实验(与时间测量)(77年]显示显著的扩大效应的LL37 DPPG (ca。180%)没有透露,,DPPC / LL37系统,虽然等温线显示它。LL37赞成的歧视效应的负面单层支持并发使用显微数字化测量的结果(77年)和表面同步x射线散射(76年,77年)技术显示一个伟大的(随着时间进展)结构变化DPPG单层LL37渗透,与DPPC单层;后者没有任何明显的结构性变化在接触LL37。作者(76年)假设的形成一个混合DPPG-LL37 2 d阶段也经历了一个额外的2 d平面驼峰的相变表示等温线。然而,没有其他的证据形成的混合阶段DPPG / LL37或DPPG / lactophoricin系统,到目前为止。

图3显示了渗透效果进行比较计算和纵坐标的等温线的存在和没有注册渗透,分别。的和差异在同一区域显示为一个函数的表面压纯磷脂单分子层,。的与依赖关系如图3所谓的渗透是同行资料测量静止的扩散条件下随着表面压力的增加,作为一个函数的初始价值。然而,这里需要强调的是,资料来源于压缩等温线对应挤压渗透出单层,对面的资料直接测量静止的扩散条件下的渗透过程。一个可能会注意到在图3最大影响确定DPPC / N-23-T和DPPG / N-23-T系统具有可比性,总计32和34 mN m⁻¹,分别。的效果随密度增加脂质,达到最低(ca。−1 mN m⁻¹DPPC / N-23-T系统和ca。6 mN m⁻¹DPPG / N-23-T)接近崩溃点。的与依赖关系呈现在图3显示出轻微的线性的离开,一个用于DPPG / N-23-T大于DPPC / N-23-T系统。积极的信号影响几乎整个压缩范围内显示多余的吸引作用的脂质与渗透。相应的与依赖项显示更大的差异化对磷脂的类型相比与(图3)。的与依赖整个压缩范围内下降,多数采用值负信号。的最低达到接近崩溃点是ca。−200 mV DPPC / N-23-T系统和ca。−20 mV DPPG / N-23-T。积极的影响测量只在最低的密度范围< 3 mN m⁻¹DPPC和DPPG层高度扩张的肽(即。,3次DPPC和ca。8倍的DPPG)。这种扩张定向排列允许自由的脂质。因此,更高的扩张DPPG单层,DPPC相比,伴随着更消极的效果。自净负效果是由带正电的肽,它是由于磷脂的眩晕酰基链的渗透。这个解释是符合普遍接受的观点78年- - - - - -80年]下降倾向的烃链对表面界面减少了他们的贡献潜力[80年]。

插入的数据1(一)和1 (b)显示课程的压缩模量、,定义为81年,82年] 计算的- - - - - -等温线。根据戴维斯和Rideal [81年),价值是2 d相组成的象征;即的范围mN米⁻¹对应于液体扩展阶段(LE,链无序)的mN米⁻¹,液体浓缩阶段(LC,链命令);(一些作者58)区分的中间范围mN米⁻¹归因于L1阶段)。增加对应于增加刚度(即。,decrease of compressibility) of the monolayer [82年]。的与课程制作DPPC层(插入的图1(一))显示持续局部最大值2.5 mN m⁻¹所赋予我们的最大密度LE-DPPC阶段。以下最低与在mN米⁻¹范围是归因于共存DPPC勒和LC阶段。在对应于最大的扩张所lactophoricin-I磷脂单层膜,mN米⁻¹(cf。2),与依赖的渗透DPPC单分子层显示了一个稍微更大的刚度比纯DPPC单分子层。它表明肽的相互作用与LC DPPC阶段。在发生恰恰相反mN米⁻¹范围相应扩大效应(cf的跌倒。图2);也就是说,与先后摔倒时的最低ca 2 mN m⁻¹在ca。31 mN m⁻¹这至少反映了拐点- - - - - -等温线的渗透DPPC单分子层内广阔的高原地区。后者表示二维相变(或可能是两个连续的)这可能是归因于肽本身,可能,混合peptide-lipid 2 d阶段。这个假说是基于层的许多安培水子阶段显示的2 d转换mN米⁻¹范围和崩溃ca。30 mN m⁻¹(44,49]。崩溃DPPC单分子层水子阶段和1×10⁻⁶摩尔dm⁻³lactophoricin-I解决发生在55.2和55.1 mN m的值⁻¹,分别对应于40 - 42的地区²每个脂质分子(75年]。这些参数表明lactophoricin-I一直挤压前的单层崩溃。在相应的略有不同与依赖关系在45 << 52 mN米⁻¹范围意味着非常轻微的phophocholine组与挤压肽的相互作用。

课程的与依赖关系计算出DPPG单层膜(插入的图1 (b))不仅显著不同,对于DPPC还宽内最低mN米⁻¹范围是归因于挤压渗透出单层(cf图2)。的值接近于零在这个范围内显示巨大的压缩(流动性)单层的挤压肽的域。因为纯DPPG单层没有显示勒/ LC阶段共存pH值5.6,在20°C (65年,66年),其增加先后从零到最大的ca。500 mN m⁻¹归因于二维固体(S)。有趣的是,在扩张lactophoricin-I DPPG单层的,最高的mN米⁻¹(cf。2),渗透单层显示当地与最大的ca。210 mN m⁻¹。这可能归因于LC-DPPG相摄动的肽。恰恰相反出现在坠落的范围扩张效应,mN米⁻¹,其中与依赖显示了明显不同的宽最小形状相比,DPPC(图1 (b))。DPPG单层膜的崩溃点水子阶段和lactophoricin-I下降明显不同的解决方案值,53.1和58.1 mN m⁻¹,对应于40²和41²分别为每个分子(75年]。这些参数显示显著的交互phosphoglyceride组与lactophoricin-I挤进地下区域。这些交互是显示的形状- - - - - -依赖在mN米⁻¹范围,显著的降低价值渗透DPPG相对于纯DPPG,单层的减少从ca 200 mN 500 - ca⁻¹(出口的。,图1 (b)单层)反映出显著增加的流动性(即。,softening the monolayer owing to interactions with the squeezed peptide). Since, the200 mN的价值⁻¹是典型的液体浓缩2 d阶段(81年),我们得出结论,存在挤压肽不允许DPPG的2 d固相的形成。更详细的解释peptide-lipid交互需要进一步调查与应用适用于单层膜结构技术。

3.3。时间演化的静止的渗透效果,与和与

表面压力的变化()和电动表面电位()在固定的渗透N-23-T肽进入DPPC或DPPG层比较数据4(一),4 (b),5(一个),5 (b),分别。

可以看到静止的渗透N-23-T DPPC层造成可以忽略不计效果(数据4(一)和6(一)),相比之下,发现从压缩等温线(图3)。小的负效果(ca。−2.5 mN m⁻¹,最多)也被测量在静止的渗透其他肽DPPC单分子层。他们表明,渗透液削弱横向DPPC-DPPC交互。的- - - - - -课程DPPC / N-23-T系统(图测量4 (b))的减少ca。−1000 mV;略少- - - - - -减少(ca。−600 mV)测量DPPC / L-16-Y系统(结果未显示)。消极的影响意味着迷茫DPPC单分子层。

的固定的影响渗透带负电的正电荷肽DPPG单层(图5(一个))与DPPC相比要大得多;的最大效果相当于14 mN m⁻¹对于N-23-T(图5(一个))和8 mN m⁻¹对于L-16-Y(图7(一))。这些影响其他作者在范围之内的所有报道的渗透各种安培层的不同磷脂(48- - - - - -50,52,53]。应该强调,亲和力N-23-T和L-16-Y DPPG单层可比,尽管N-23-T在空气/水界面,显示表面活性L-16-Y相反。(cf部分。3.1)。推断的事实是,大部分的安培在油脂的环境中采用amphiphatic构象可能大大不同于溶液中大部分(2,11- - - - - -19),因为它证明了圆二色性(CD)和核磁共振(NMR)调查(22,23)(cf表1)。N-23-T的负面影响就越少DPPG单层,DPPC相比,被我们认为有吸引力,静电peptide-DPPG互动积极肽拖到单层在更大的深度。

3.4。固定的影响渗透作为磷脂密度函数

的和固定的影响渗透L-16-Y和N-23-T肽DPPC DPPG单层膜,测量后60分钟的接触时间。,比较数据6(一),6 (b),7(一),7 (b)作为一个单层的初始表面压力的函数,。

应该是这里提到的危险一步静止的渗透率测量(如部分中提到2)是均衡的渗透浓度后立即注射,这可能造成干扰的磷脂单层。另一方面,手工操作在附近的副总裁震动可能会导致一个不受控制的设备零水平的转变。(大量的振动板技术是已知的干扰(详细讨论我们83年])。在上面的,最初的的值效果评估被刚刚完成搅拌单层下面的解决方案。的这种方式包含影响评估- - - - - -进化的结果之前的渗透,不包括逐步改变一些实验中观察到在注入的肽和均衡的浓度。这种模式的计算效果保证尽可能减少实验误差结果的准确性测量本身,±10 mV,最大;这个错误所示垂直误差数据6 (b)和7 (b)属于使用标志。最大的错误决定值(考虑到改变在平衡纯磷脂单层和均衡的肽的浓度)±0.3 mN m⁻¹。自从错误决定价值观的影响=依赖,横向和垂直误差如图6 (b)和7 (b)都是相同的。作为一个可以看到数据6 (b)和7 (b),实验错误的使用标志着除了图6(一)。

中给出的结果数据6(一)和7(一)表明非线性的与依赖关系,称为渗透概要文件(56]。一个可以看到与概要文件(数据6(一)和7(一))和相应的与依赖关系(数据6 (b)和7 (b))显示局部极值的位置轴取决于磷脂的类型。极值表明依赖的渗透影响2 d相组成的单层,可能,在形状和分散度2 d阶段的域。尽管许多作者提出了线性的与概要文件的渗透无数安培(48- - - - - -52)或生物活性肽(47,54,55磷脂单层膜,其他一些结果表明,线性的与不是所有的规则肽(52,53,56- - - - - -58]。例如,Weroński和同事(58)获得非线性与依赖性的渗透合成十肽(非结构的片段肝炎G NS3蛋白)DPPC DPPG单层膜。类似形状的概要文件并显示了人类似的区分DPPC和DPPG单层膜。另一个例子与档案转移在给出最大(56)的渗透annexin-V与胆碱磷酸磷脂层形成(POPC) phosphoglycerol (POPG)和磷脂酰丝氨酸(弹出),或它们的混合物。另一方面,不同的一些测量点拟合线性相关,与,(57比线性)表明一个更复杂的过程。

这里值得一提的是,线性的与概要介绍文学的安培和生物活性肽主要是测量范围内低于30 mN米⁻¹(44,49,58)或更窄47,54,57]。一般来说,线性的与概要文件用于确定所谓的最大插入压力(MIP) [47](也叫排除表面压力)外推值没有影响表面压力发生(= 0)。这个解释假设以上肽的MIP没有插入到单层发生。因为MIP值通常被发现接近mN 30米⁻¹或更少(虽然生物膜料显示在30至35 mN m⁻¹(46,47]),可以得出这样的结论从众多安培的结果没有能力穿透细菌膜与抗菌活性在体外。尽管MIP值是用于评估有效的与生物膜相互作用的生物活性多肽,它们不能直接引用一个渗透到磷脂影响或细菌比磷脂单层膜更高级的生物膜模型。另一个问题关于MIP被巴恩斯和同事讨论84年,85年]表明,一些浓缩的朗缪尔双可能存在层以上MIP,占很高的能量势垒的弹射在压缩。上述歧义有关MIP暗示磷脂单层在压缩(或减压)并不复制所有生物膜特性决定的渗透安培。然而,生物膜的单层模型有助于调查AMP-lipid交互在渗透在静止的扩散条件下的初始阶段。

所示的配置文件数据6(一),6 (b),7(一),7 (b)让我们跟随方便的迹象和在特定系统的影响。DPPC层导致的静止的渗透和影响负面迹象在几乎整个调查范围(数据6(一)和6 (b))。这些与概要文件(图6(一))显示的高原范围超过30 mN m⁻¹持续两个带正电的肽,N-23-T L-16-Y。这高原意味着达到最大的低肽的相互作用与DPPC单分子层。同时,电表面潜力,,DPPC单分子层强烈降低带正电的肽,特别是在ca。30 mN m⁻¹(图6 (b)),恰逢最大的流动性所示与(插入图最小1(一))。

另一方面,固定正电荷肽进入DPPG单层膜的渗透影响积极的迹象在几乎整个范围的调查(图7(一)),而相应的效应逆转的迹象轴(图7 (b))。的与依赖测量静止的渗透DPPG单层(图7(一))显示一个狭窄的最大值ca。24 mN m⁻¹落在范围的LC阶段纯DPPG单层(讨论DPPG单层膜的二维相变,看到62年,67年- - - - - -71年])。的最大效果表明最大peptide-DPPG单层交互的(降低表面自由能增加)。

注意到的总表面压力最大所讨论的,+= ca。38 mN m⁻¹,下跌接近典型的生物膜的范围,另一方面,在该地区归因于地下peptide-lipid交互(cf图1 (b))。的最大值,发生在同一值作为最大值,建议最好的结构性peptide-lipid调整(排序的分子组的偶极子接口提供的更大的倾向更大的部分滴)。注意,积极影响盛行的N-23-T费用+ 3,而负的盛行的L-16-Y + 4(图7 (b))。这表明积极的一面影响不是主要由肽的阳离子电荷。似乎更多,更大的阳离子电荷引起的定向障碍DPPG单层显示的更大的降低(图7 (b))。可能解释为增加深度渗透由于静电相互作用越强。数据的结果7(一)和7 (b)表明,当DPPG密度增加的上面与最大显示,(具体的交互)和结构适应能力的肽DPPG单层()减少。这些变化可能是归因于降低肽的渗透深度,其次是phosphoglycerol组织的重新定位。

3.5。比较固定的渗透效果和那些评估从压缩等温线

应该强调的大小从静止的渗透实验(数据的影响6(一)和7(一)从压缩等温线)明显不同于评估(图3)。尤其是DPPC单层显示的区别是,静止的渗透效果可以忽略不计(ca。−1 mN m⁻¹,图6(一)),而从压缩等温线评价更大数量级(图3)。另一方面,静止效果达到最大范围的500年和1000−−mV(图6 (b)),而从压缩等温线评价的变化范围30 - ca。−200 mV(图3)。可以忽略不计的效果获得固定渗透DPPC单层恰逢一个非常低的溶血活性(即。负面影响红细胞,红细胞)N-23-T L-16-Y。比较数据显示在表中1,你会发现N-23-T不会显示溶血活性(检查≤2×10⁻⁴摩尔dm⁻³(32]),虽然L-16-Y显示了一个无关紧要的人(即。,3。6% as compared to the effect of 1% Triton X-100 simulating 100% hemolysis [31日])。应该是这里提到,我们的调查已经进行肽的浓度远低于最低抑制浓度(MIC)为各种细菌菌株,在文献中报道,为N-23-T 3×10以上⁻⁴摩尔dm⁻³(32为L-16-Y], 2.5×10的范围⁻⁵1×10⁻⁴摩尔dm⁻³(31日,32),ca的E-5-K。5×10⁻⁶摩尔dm⁻³(26]。

DPPG / N-23-T系统,从压缩效应评估等温线也明显大于静止的渗透,特别是在的范围< 30 mN米⁻¹。另一方面,相应的影响主要是积极的迹象显示(即。,低于250 mV,图7 (b)),而从压缩等温线评价接近−20 mV,几乎整个范围内的> 3 mN m⁻¹(图3)。静止的渗透结果表明N-23-T施加一个定向影响DPPG单层,而压缩等温线意味着轻微的眩晕效果的范围> 3 mN m⁻¹。这里应强调这两个类型的实验匹配反向过程,所部分3.1。固定渗透(自己的结果和文献的47,48)表明,固定在不同lipid-peptide渗透系统的小时后达到平衡。出于这个原因,你可能认为相反的过程(单层挤出)不能达到渗透平衡通常在压缩条件下使用。支持这一观点的结果(86年)获得了混合层的β酪蛋白与胆碱磷酸(DPPC、DMPC或DSPC),表现出强烈的依赖关系- - - - - -等温线的平衡稳定时间气体包含肽脂质电影传播子阶段。

总之,比较之间的渗透影响了我们从两种类型的实验表明,影响测量在单层压缩过度饱和状态对应的单层渗透,同时,under-equilibrium取向的单层混合。这里需要强调的是,压缩等温线不影响计算显示的倾向之间的歧视N-23-T负面和中性脂质层,而静止的渗透实验。值得提及的(插入实验与测量)报道77年)的渗透LL37肽DPPC和单层DPPG这充分证明了脂质组LL37而歧视等温线不显示它。事实上,静止的渗透结果符合一系列文献报道其他安培2,5- - - - - -21]标明他们的相对强劲的交互与phosphoglycerol组与网络中立的胆碱磷酸组。

3.6。静止的渗透影响肽浓度的函数

的的影响渗透的三肽,N-23-T L-16-Y,和E-5-K DPPC DPPG层比较图8作为一个函数的对数的渗透浓度,接近30 mN m⁻¹。

你可能注意到常见的线性与依赖的渗透三肽DPPC单层这表明通过水化壳可能发生非特异性相互作用。等与Langmuir-Szyszkowski方程系统描述与讨论的渗透溶性两亲不溶性层(63年,64年]。有趣的是,peptide-DPPC交互从轻微排斥稍微有吸引力的增加肽的浓度超过3×10⁻⁶摩尔dm⁻¹。因为他们不与多肽的结构,也与他们的,他们可能会通过水化壳胆碱磷酸组和肽的地下区域。

另一方面,与日志依赖测量静止L-16-Y的渗透和E-5-K肽进入DPPG单层显示非线性形状明显不同,表明具体peptide-lipid交互(图8)。值得强调的是这里的渗透E-5-K DPPG层导致轻微的负面效果,在整个浓度范围调查(图8)。这表明排斥E-5-K / DPPG单层交互显示E-5-K实验条件下的负电荷。一个负电荷的E-5-K也建议的负值在空气/溶液界面(cf部分3.1)。根据理论预测IEP E-5-K (cf表1),这应该采取一种轻微的正电荷肽在pH值5.6。另一方面,净电荷与pH值依赖(计算使用CS生物有限公司的“肽属性计算器”)表明E-5-K中性pH值范围为5.5 8。上面的不一致可能归因于以下几个原因。首先,在计算有一定的局限性肽IEP由于不确定性的pK一些氨基酸的值被视为独立的计算。以上,IEP通常是计算的精度±0.5。其次,实际的pH值在空气/水界面可能本质上不同于大部分的解决方案。把上面的,净电荷的E-5-K条件下使用可能是负值。另一方面,E-5-K效应产生的渗透到DPPC或DPPG层(结果未显示)是积极的信号,从50到300 mV。为带正电的肽,讨论了的迹象效果没有显示与肽电荷的大小直接相关;因此,影响主要是解释为定向的脂质。从这个角度来看,相对较短的E-5-K肽,显示与DPPG单层排斥相互作用,可能产生定向效应。

调查的过程在此可能解释根据“地毯机制”的第一步,讨论(2,8,9,11- - - - - -21)与安培到磷脂的渗透影响。在第一步,渗透与矩阵结合形成的磷脂组负责人,不进入酰基链。由红外光谱的调查显示,在低肽/脂质比,α螺旋和β单肽东方与分子轴向膜的外表面。比例增加时,肽开始定位在细胞膜1,11,13]。就像最近报道(87年,88年),一些安培具有疏水性梯度沿α斜长轴可能穿透酰基链地区浅角,30°、60°之间。上述阶段可能发生的渗透DPPG单层。

3.7。长期课程的渗透,与和与

数据9(一个)和9 (b)显示代表- - - - - -和- - - - - -课程在ca测量。10小时的固定的渗透L-16-Y DPPG单层在不同肽的浓度。

这些结果提供一些必要的信息。首先,渗透平衡DPPG单层不是建立在现实实验时间60分钟,可能由于缓慢渗透到单层内构象平衡。其次,长期- - - - - -课程注册DPPG / L-16-Y系统显示非单调变化后(图10 - 130分钟的接触9(一个))。他们发现最明显的肽的浓度最高,1×10⁻⁵摩尔dm⁻³(图9(一个))。这些结果表明,前肽渗透DPPG单层诱发相变2 d。相比之下,没有非单调- - - - - -变化观察在肽(L-16-Y和N-23-T)的渗透到DPPC单层(结果未显示)。这意味着只有足够强大peptide-lipid交互(如DPPG单层的)可能诱发二维相变在进行渗透。

这里需要强调的是,- - - - - -课程见图9(一个)开始的接近30 mN m⁻¹;然而,由于依赖的影响肽的浓度,落在不同的非单调变化值,31 - 38 mN m⁻¹。这个范围一致的上限与最低发现DPPG单层的子阶段包含N-23-T(插入图1 (b)),这可能归因于肽摄动脂质域转换为LC-DPPG域,由于排出渗透到子阶段。

相应的长期- - - - - -改变由肽渗透DPPC或DPPG层没有间断。的- - - - - -变化测量在ca。10小时的时间超过几次那些观察到在单层压缩(cf。数字1 (b)和9 (b))。降- - - - - -课程显示进步的磷脂单层定向障碍可能穿透深度增加的结果。肽的浓度最低,1×10⁻⁶和2×10⁻⁶摩尔dm⁻³当地- - - - - -最大显示(图9 (b))表明,在渗透过程中,单层转移整个相对最高程度的排序(由我们认为最好的肽的结构拟合和脂质在单层的方向)。

应该是这里提到这些- - - - - -改变我们观察到DPPG / L-16-Y系统(图9(一个)),显示被Vollhardt类比和Fainerman63年)的渗透β乳球蛋白或β酪蛋白,DPPC单分子层,赵和同事(89年,90年)——的渗透β乳球蛋白,DPPC单分子层。上述作者的观察相结合- - - - - -改变在进行渗透(500分钟)和定期BAM, GIXD测量。这些调查证明没有具体DPPC分子之间的相互作用β乳球蛋白、β酪蛋白,这是符合我们的研究结果为含牛奶提取肽。上述作者解释了不连续的- - - - - -改变勒/ LC过渡诱导DPPC单分子层的渗透(数量和大小的BAM技术领域观察到明显依赖于初始密度DPPC单分子层)。这里值得提及的是,类似的长期- - - - - -变化最近报道了静止的渗透三肽来自人类β-defensin POPE-POPG(7: 3)层(91年]。

4所示。结论

渗透的带正电的抗菌素,含牛奶提取肽(N-23-T和L-16-Y)到DPPG单层,在静止的扩散条件下,揭示了非线性的表面压力,与,和电动表面潜力,与在最大的——档案转移ca。24 mN m⁻¹,一直。很明显不同与概要文件获得肽的静止的渗透进DPPC monolayer-they达成最低/高原> 30 mN米⁻¹。另一方面,影响评估通过比较压缩等温线在纯水和N-23-T包含子阶段被发现更大的比那些静止的扩散条件下测量,特别是,渗透到DPPC单层。与此同时,压缩的影响发现等温线相比少得多,测量在静止的渗透。更重要的是,压缩等温线没有透露如此巨大差异的亲和力lactophoricin-I DPPG DPPC单层膜,因为它被发现从静止的渗透的结果。比较我们的结果lactophoricin-I从实验表明,两种类型和影响测量的压缩单层渗透(DPPC或DPPG)更远离平衡,同时对渗透(显示过度饱和)和取向的单层(这显示了一个压缩期间under-equilibrium取向)。事实上,仅从静止的渗透实验结果符合大多数抗菌肽(安培数)的选择性渗透到带负电荷的微生物膜,如发现在体外。这些实验的主要结论是,生物膜的单层模型当静止的扩散条件下供应调查结果相关的生物系统,同时压缩等温线必须被谨慎使用。

长期的- - - - - -课程(ca。10小时)表明,平衡后的渗透过程建立了几个小时的时间,这取决于肽/脂质比。这可能是由于减缓取向/构象变化与脂质膜相关的肽。的- - - - - -课程期间测量L-16-Y渗透到DPPG单层显示非连续变化,特别是依赖于肽的浓度。他们表明,渗透过程分为DPPG单层诱发二维相变受到足够强peptide-lipid交互。没有显示在静止的不连续变化渗透肽进入DPPC单分子层是归因于微不足道,排斥peptide-DPPC交互。

确认

作者感谢博士从蒙彼利埃大学德西尔维坎帕尼亚大区中心de Biochimie Structurale法国,提供含牛奶提取肽形成的由她。两个作者(万达Barzyk和Katarzyna Więcław-Czapla)承认三个月奖学金从大学亨利·庞加莱,南希,法国。

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